全 文 ：书江西农业学报 2014，26(9) :1 ～ 5
Acta Agriculturae Jiangxi
部分柿属植物 TＲAP标记反应体系的建立与引物筛选
罗 纯1，2，吴 迪1，张青林1，罗正荣1*
收稿日期:2014 － 03 － 31
基金项目:国家自然科学基金(31171929) ;公益性行业(农业)科研专项(201203047)。
作者简介:罗纯(1984─) ，女，湖北武汉人，助理研究员，博士，主要从事果树种质资源与分子遗传育种研究。* 通讯作者:罗正荣。
(1．华中农业大学 园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070;
2．农业部热带果树生物学重点实验室 /中国热带农业科学院 南亚热带作物研究所，广东 湛江 524091)
摘 要:为了建立柿属植物目标区域扩增多态性 ( TＲAP) 标记技术体系，对影响 TＲAP － PCＲ 的 Mg2 +、dNTPs、Taq
DNA聚合酶、固定引物和随机引物浓度比 5 个因素进行了优化。确定优化的反应体系为: 模板 DNA 40 ng，buffer 1 ×，Mg2 +
1． 4 mmol /L，dNTPs 0． 2 mmol /L，固定引物和随机引物浓度比为 11∶ 1，Taq 酶 0． 5 U，反应总体积为 15 μL。利用柿属植物
EST数据库信息设计锚定引物 10 条，与 11 条随机引物组合共 110 对引物。利用这些引物对柿属植物 6 个基因型进行
TＲAP － PCＲ扩增，其中 84 个引物组合能扩增出清晰条带，占引物总量的 76． 36% ; 36 个引物组合表现出良好的多态性扩
增，并在 20 份柿属植物中进行了引物验证。
关键词:柿属植物; TＲAP; 反应体系优化; 引物筛选
中图分类号:Q949． 775． 3 文献标志码:A 文章编号:1001 － 8581( 2014) 09 － 0001 － 05
Establishment of Ｒeaction System and Primer Screening for
TＲAP Marker in Some Plants in Diospyros
LUO Chun1，2，WU Di1，ZHANG Qing － lin1，LUO Zheng － rong1*
( 1． Key Laboratory of Horticultural Plant Biology of Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，
China; 2． Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology，Ministry of Agriculture; South Subtropical Crop Ｒesearch Institute，Chi-
nese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang 524091，China)
Abstract: The concentrations of Mg2 +，dNTPs，Taq DNA polymerase and primers which affected TＲAP ( target region ampli-
fied polymorphism) － PCＲ reaction were optimized for the establishment of TＲAP molecular marker system in Diospyros spp． The
optimum reaction system was acquired as follows: template DNA 40 ng，buffer 1 ×，Mg2 + 1． 4 mmol /L，dNTPs 0． 2 mmol /L，fixed
primer － arbitrary primer concentration ratio 11∶ 1，Taq DNA polymerase 0． 5 U，and total volume of reaction system 15 μL． Eighty
－ four TＲAP primer combinations which showed robust PCＲ amplification in 6 persimmon genotypes were screened out from 110
primer combinations ( 10 fixed primers times 11 arbitrary primers) ． Thirty － six polymorphic primer combinations were verified in 20
persimmon genotypes．
Key words: Plants in Diospyros; TＲAP; Ｒeaction system optimization; Primer screening
目标区域扩增多态性(target region amplified poly-
morphism，TＲAP)也叫做靶位区域扩增多态性，是一种
基于 PCＲ的分子标记技术。由美国农业部北方作物科
学实验室 Hu和 Vick［1］开发，是借助大规模测序技术产
生的许多生物的大量序列信息，利用生物信息学工具
和表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据库
信息设计引物，对目标候选基因序列区进行扩增产生
多态性分子标记。TＲAP 技术以基因组 DNA 为模板，
采用两个人工合成的长度为 16 ～ 20 bp 的核苷酸的锚
定引物与随机引物，通过扩增产物的多态性来反映基
因组相应区域(DNA)的多态性，从而形成围绕候选目
标基因序列的多态性标记。
TＲAP标记技术具有操作简单，重复性好，效率高
的特点，目前已经在很多园艺植物中得到成功应用。
在构建遗传图谱方面，Hu 等［2］采用 TＲAP 分子标记技
术分别以菜豆的 2 个 ＲI群体为材料，构建了菜豆遗传
图谱，还将 TＲAP 分子标记技术应用到向日葵图谱的
构建上。Liu等［3］把 SSＲ 和 TＲAP 分子标记技术联合
利用，构建了红春小麦重组体的遗传图谱。在遗传多
样性分析方面，Hu 等［4］利用 TＲAP 分子标记技术，对
38 份菠菜的种质和 10 份商用的杂合体菠菜进行遗传
多样性分析。在重要性状基因标记方面，Hu 和 Vick［1］
利用 TＲAP 分子标记技术，根据公布的向日葵 EST 序
列信息设计固定引物，通过扩增，已成功地获得了一个
与葵盘腐烂病感病基因相关的分子标记。
本研究通过对 TＲAP － PCＲ反应体系的优化，建立
了稳定性强、重复性好的柿属植物 TＲAP － PCＲ 反应体
系，并筛选到多态性高的引物组合 36 个，为柿属植物
遗传多样性的研究提供了一种新的分子标记方法。
1 材料与方法
1． 1 材料和模板 DNA的提取 用于 TＲAP 体系优化
的柿基因型为“君迁子”和“黑柿”。用于引物筛选的
柿基因型包括中国原产柿种质“罗田甜柿”和“磨盘
柿”，日本原产柿种质“次郎”和“前川次郎”，韩国原产
柿种质“丹城柿”，以及柿近缘种“君迁子”作为外类
群。引物验证实验材料见表 1。材料均采自湖北武汉
华中农业大学柿圃。采用 CTAB 法提取材料基因组
DNA，参照 Cheng等［5］的方法并作适当改动。
1． 2 TＲAP引物设计 TＲAP 技术采用两个 16 ～ 20
个(一般为 18 个)核苷酸引物，一个为固定引物，依据
靶 EST序列设计;另一个是随机引物。固定引物的设
计，首先应用 TBLASTX搜索柿 EST数据库中与柿原花
青素生物合成相关的结构基因或调控基因的同源序
列，然后根据这些 EST序列设计长度为 18 bp左右的引
物。固定引物应用 Primer Premier 5． 0 设计［6］。本研究
参考引用 Li和 Quiros［7］已发表随机引物 11 条(表 2) ，
自主设计固定引物 10 条(表 3) ，共 110 对引物组合进
行 TＲAP标记引物的筛选。
1． 3 TＲAP － PCＲ 扩增体系及参数 柿 TＲAP － PCＲ
基本反应体系和程序参考 Hu 和 Vick［1］，PCＲ 扩增总
体积为 15 μL，其中包括 40 ng DNA，1． 5 U Taq DNA 聚
合酶，1． 4 mmol /L Mg2 +，1 × buffer，0． 3 mmol /L dNTPs，
固定引物浓度为 0． 5 μmol /L，随机引物的浓度为 0． 1
μmol /L(固定引物 /随机引物浓度比为 5:1)。扩增程
序如下:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 45 s，40 ℃退火
45 s，72 ℃延伸 1 min，5 个循环;94 ℃变性 45 s，52 ℃
退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环;72 ℃延伸 7
min。体系优化和引物筛选实验中，利用 1． 5%琼脂糖
凝胶电泳分离 PCＲ扩增产物后用 Syngene 凝胶成像系
统观察。多态性引物验证实验中，PCＲ产物通过 6%变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，进行银染［8 － 9］，数码相
机拍照保存。PCＲ反应的各组分浓度优化条件见表 4。
在保持其它因素一致的条件下，变化单个因子，筛选最
优参数。
2 结果与分析
2． 1 不同Mg2 +浓度对 TＲAP反应的影响 由图 1 可
见，Mg2 +浓度为 1． 1、1． 4、1． 7 mmol /L 时，表现出良好
的扩增效果。但是，相比而言，Mg2 +浓度为 1． 4 mmol /L
时，表现出更清晰和较多的扩增条带，显示更多的信息
量。因此从产量和扩增条带数角度分析，Mg2 +浓度为
1． 4 mmol /L为适宜浓度。
2． 2 不同 dNTPs浓度对 TＲAP 反应的影响 图 2 结
果表明 dNTPs在各个实验浓度下均有扩增产物，但当
浓度为 0． 3、0． 35、0． 4 mmol /L 时，出现部分谱带缺失
或不清晰，在浓度为 0． 2 mmol /L 时扩增产物效率最
高，因此选择 dNTPs浓度 0． 2 mmol /L为适宜浓度。
表 1 用于 TＲAP标记应用研究的 20 份柿属试材
编号 基因型 学名 倍性
脱涩
类型
起源
1 鄂柿 1 号 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 中国
2 四方甜柿 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 中国
3 宝盖甜柿 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 中国
4 铜盆柿 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCA 中国
5 磨盘柿 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCA 中国
6 郧阳冻柿 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCA 中国
7 湘西甜柿 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
8 华柿 1 号 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PVA 日本
9 富有 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
10 前川次郎 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
11 花御所 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
12 晚御所 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
13 阳丰 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
14 西村早生 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PVNA 日本
15 赤柿 D． kaki Thunb 2n = 6x = 90 PVNA 日本
16 平核无 D． kaki Thunb． 2n = 9x = 135 PVA 日本
17 粉叶柿 D． glaucifolia Metc． 2n = 2x = 30 － 中国
18 骏河 D． kaki Thunb． 2n = 6x = 90 PCNA 日本
19 油柿 D． oleifera Cheng 2n = 2x = 30 － 中国
20 君迁子 D． lotus L． 2n = 2x = 30 － 中国
注:PCNA(Pollination － Constant and Non － Astringent，完全甜柿) ;
PVNA(Pollination － Variant and Non － Astringent，不完全甜
柿) ;PVA(Pollination － Variant and Astringent，不完全涩柿) ;
PCA(Pollination － Constant and Astringent，完全涩柿)。
表 2 本实验用到的随机引物序列
编号 引物序列 来源
Em1 GACTGCGTACGAATTAAT Li and Quiros(2001)
Em2 GACTGCGTACGAATTTGC Li and Quiros(2001)
Em3 GACTGCGTACGAATTGAC Li and Quiros(2001)
Em4 GACTGCGTACGAATTTGA Li and Quiros(2001)
Em5 GACTGCGTACGAATTAAC Li and Quiros(2001)
Em6 GACTGCGTACGAATTGCA Li and Quiros(2001)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Li and Quiros(2001)
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Li and Quiros(2001)
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Li and Quiros(2001)
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Li and Quiros(2001)
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Li and Quiros(2001)
2． 3 不同固定引物和随机引物浓度比对 TＲAP 反应
的影响 图 3 结果显示不同固定引物和随机引物浓度
比对 PCＲ扩增影响差异不大，当浓度比为 2∶ 1时，出现
部分主带缺失，进而从扩增条带清晰度考虑固定引物
和随机引物浓度比为 11∶ 1适宜(固定引物浓度为 1． 65
μmol /L，随机引物浓度为 0． 15 μmol /L)。
2． 4 不同 Taq DNA聚合酶对 TＲAP反应的影响 从
图 4 可以看出实验范围的各个 Taq DNA聚合酶用量均
有扩增产物，且主带带型类似，考虑到节约成本及主带
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外的条带数，Taq DNA聚合酶为 0． 5 U最为适宜。
表 3 本实验用到的固定引物序列及信息
编号 引物序列 靶标 EST名称 登录号
DK1 TTCCACCTTGCTTTTCCT 花青素合酶 DC587983 179690970
DK2 CCACCTTGCTTTTCCTGA 花青素合酶 DC587983 179690970
DK3 TCCTGAAGAAAAGCGTGAC 花青素合酶 DC587983 179690970
DK4 GGTCCTTTCCGTGCTTTC 花青素合酶 DC587983 179690970
DK5 GCCCACTTCTACTGGTTCT 无色花色素还原酶 DC586464 179682365
DK6 GGGACCCTGACAATAAGAA 无色花色素还原酶 DC586464 179682365
DK7 GAGGACGCATTGCTTACA MYB转录因子 DC587740 179696106
DK8 CGATGTGGAAAGAGTTGC MYB转录因子 DC587740 179696106
DK9 CAGGTTTACGATTCAAGGC 漆酶 DC585535 179688156
DK10 CTCTTCCTTTCCATTCCC 漆酶 DC585535 179688156
表 4 TＲAP － PCＲ 反应体系各组分浓度优化条件设计
反应成分 浓度优化
Mg2 + /(mmol /L) 0． 5 0． 8 1． 1 1． 4 1． 7
dNTPs /(mmol /L) 0． 20 0． 25 0． 30 0． 35 0． 40
固定引物 /随机引物 2∶ 1 5∶ 1 8∶ 1 11∶ 1 14∶ 1
Taq DNA聚合酶 / U 0． 5 1． 0 1． 5 2． 0 2． 5
M:DL 2000 marker;1 ～ 2 分别代表君迁子和黑柿，
a ～ e分别代表 Mg2 +浓度 0． 5、0． 8、1． 1、1． 4、1． 7 mmol /L
图 1 TＲAP － PCＲ的Mg2 +浓度梯度实验
M:DL 2000 marker;1 ～ 2 分别代表君迁子和黑柿，
a ～ e分别代表 dNTPs浓度 0． 2、0． 25、0． 3、0． 35、0． 4 mmol /L
图 2 TＲAP － PCＲ的 dNTPs浓度梯度实验
M:DL 2000 marker;1 ～ 2 分别代表君迁子和黑柿，a ～ e分别代表
固定引物和随机引物浓度比 2∶ 1、5∶ 1、8∶ 1、11∶ 1和 14∶ 1
图 3 TＲAP － PCＲ的固定引物和
随机引物浓度比梯度实验
M:DL 2000 marker;1 ～ 2 分别代表君迁子和黑柿，
a ～ e分别代表 Taq DNA聚合酶用量 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 U
图 4 TＲAP － PCＲ的 Taq DNA 酶浓度梯度实验
2． 5 TＲAP引物的筛选 在由 10 条固定引物和 11 条
随机引物组成的 110 对引物组合中，首先利用琼脂糖
凝胶电泳检测筛选出 84 个引物组合的扩增条带清晰
且易于识别，并且在 6 个柿基因型中具有一定的多态
性。其他的引物组合，因扩增条带不清晰或未检测出
多态性条带而被淘汰。进一步通过变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳筛选获得扩增效果好、条带清晰且多态性高的 6
个固定引物(DK5、DK6、DK7、DK8、DK9、DK10)及 6 个
39 期 罗纯等:部分柿属植物 TＲAP标记反应体系的建立与引物筛选
随机引物(Em1、Em2、Em3、Em4、Em5、Em6)的组合共
36 对引物(图 5)。
从上至下，从左至右依次为 DK5 + Em1，DK5 + Em2，DK5 +
Em3，DK5 + Em4，DK5 + Em5，DK5 + Em6;编号 1 ～ 6 分别为罗田甜
柿、磨盘柿、次郎、前川次郎、丹城柿和君迁子;M:DL2000 marker
图 5 部分筛选 TＲAP引物的扩增图谱
2． 6 TＲAP标记在柿属植物中的扩增 利用上述 36
对引物构建 20 份柿属植物遗传图谱。图 6 为 DK7 +
Em1 和 DK9 + Em5 引物组合的扩增谱带。36 对引物
的扩增产物在不同材料间具有明显的多态性，共检测
出 2184 条谱带，其中 94． 87%(2072 条)具有多态性。
单对引物扩增可产生 33 ～ 110 条清晰可辨的条带，其
中引物组合 DK6 + Em3 扩增条数最少(33 条) ，引物
DK7 + Em1 扩增条带数最多(110 条) ，平均每对引物
扩增条带数为 60． 67 条。对于每对引物，扩增的多态
性条带数在 31 ～ 108 之间，多态性条带比例为 85． 71%
～100%(表 5)。
3 讨论
稳定性、重复性和特异性是评价 PCＲ 扩增体系的
几个要素，而影响 PCＲ扩增效果的因素很多，对于不同
物种的 DNA样品，PCＲ反应中各种成分加入量均不一
致。本实验建立了适于柿属植物的 TＲAP － PCＲ 反应
体系，对影响 PCＲ 结果的主要反应参数如 Mg2 +、
dNTPs、引物浓度和 Taq 聚合酶进行了浓度筛选，这对
于获得清晰稳定的电泳结果十分必要。Mg2 + 对 PCＲ
扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCＲ 反
应中，Mg2 +浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩
增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产
物减少。本实验中，当 Mg2 +浓度为 0． 5 mmol /L时无扩
增产物，说明浓度过低，适于柿 TＲAP反应的 Mg2 +浓度
为 1． 4 mmol /L。dNTPs 含有磷酸根，能与 Mg2 +结合，
使游离的 Mg2 +浓度降低，由于一般 PCＲ 体系 Mg2 +浓
度为 1． 5 ～ 2． 0 mmol /L，本实验适宜的 Mg2 +浓度较低，
为保证适当游离的Mg2 +，从而保证 Taq聚合酶的活性，
应选择较低的 dNTPs用量，实验结果证实了这点，适于
柿 TＲAP反应的 dNTPs浓度为 0． 2 mmol /L。典型 PCＲ
反应混合物中，常用 Taq 聚合酶范围为 1 ～ 4 U /100
μL。由于 DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件
的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特
异产物的增加。本实验采取的 15 μL 体系，约需 0． 15
～ 0． 6 U。本实验所设置的几个用量梯度对 PCＲ 结果
影响不大，出于经济考虑，选择最低用量 0． 5 U。
表 5 36 个 TＲAP引物组合扩增信息
固定
引物
退火温
度 / ℃ 随机引物 总条带数
多态性条
带数
多态性
比例 /%
DK5 51． 2 Em1 43 43 100． 00
Em2 39 37 94． 87
Em3 39 37 94． 87
Em4 66 62 93． 94
Em5 56 50 89． 29
Em6 46 44 95． 65
DK6 51． 9 Em1 58 57 98． 28
Em2 34 32 94． 12
Em3 33 31 93． 94
Em4 70 66 94． 29
Em5 84 83 98． 81
Em6 65 65 100． 00
DK7 52 Em1 110 108 98． 18
Em2 54 50 92． 59
Em3 84 80 95． 24
Em4 45 39 86． 67
Em5 50 48 96． 00
Em6 49 45 91． 84
DK8 51． 1 Em1 78 74 94． 87
Em2 54 49 90． 74
Em3 64 59 92． 19
Em4 58 57 98． 28
Em5 57 51 89． 47
Em6 42 41 97． 62
DK9 53． 1 Em1 79 76 96． 20
Em2 55 48 87． 27
Em3 64 59 92． 19
Em4 77 66 85． 71
Em5 99 95 95． 96
Em6 90 84 93． 33
DK10 51． 3 Em1 70 70 100． 00
Em2 88 88 100． 00
Em3 59 59 100． 00
Em4 53 48 90． 57
Em5 33 33 100． 00
Em6 39 38 97． 44
TＲAP标记一次扩增可以产生 30 ～ 100 条谱带，在
本研究中每对引物可扩增 33 ～ 110 条清晰可辨的条
带，信息量非常大，多态性比例高。一般而言，理想的
标记除了应该具备容易使用、多态性高和扩增条带数
目丰富等特点外，可靠和重复性好也是非常必要的。
本研究中 TＲAP 技术使用的引物较长(固定引物长度
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不小于 18 bp) ，这样就提高了扩增程序的退火温度，使
扩增产物更加稳定，从而就增加了实验的可重复性。
因此，我们认为 TＲAP 标记具有多态性高、稳定性强的
特点，是一种经济有效的分子标记技术。但由于一次
TＲAP 反应中，扩增的条带较多，有时产生的多态性
DNA电泳图谱比较复杂，会给实验分析和谱带统计带
来一定的困难，因此，严格筛选主带易于区分的引物十
分重要。
编号 1 ～ 20 代表材料见表 1，M:pBＲ322 DNA /MspI marker
图 6 TＲAP引物组合 DK7 + Em1(A)和 DK9 + Em5(B)在 20 份柿基因型中的扩增图谱
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( 责任编辑:周 军)
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