全 文 ：园　艺　学　报　2006, 33 (2):433 ～ 436
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2005 - 06 - 01;修回日期:2005 - 08 -09
基金项目:香港理工大学与浙江大学合作项目
*通讯作者 Au thor for correspondence (E-m ail: qyxhero@ z ju. edu. cn;bcyschan@ in et. poiyu. edu. hk)
羊蹄甲属 3种园艺树种分子鉴定及亲缘关系的 ISSR
分析
罗瑜萍 1　龚　维 1　邱英雄 1*　Yuk S ing G ibert Chan2*
(1浙江大学生命科学学院 , 杭州 310029;2香港理工大学应用生物与化学系 , 香港)
摘　要:利用 ISSR-PCR方法对香港羊蹄甲属 (Bauhinia) 中最常见 3种园艺树种:红花羊蹄甲 (B.
purpurea)、 宫粉羊蹄甲 (B. variegate) 和洋紫荆 (B. blakeana) 的遗传变异进行了研究 , 从 74个 ISSR引
物中筛选出 9个多态性引物用于正式扩增 , 共扩增出 80条 DNA带 , 平均每个引物扩增的 DNA带的数目为
8. 88条 , 多态性条带数目为 55条 , 占总条带数的 68.8%。其中 , 有 8个引物扩增出差异条带和特异条带 ,
并分别能准确地鉴定羊蹄甲属 3个园艺树种。本研究的结果表明 , ISSR - PCR的 DNA电泳谱带在检测香港
羊蹄甲 (B. blakeana) 品种的真实性方面非常有用。同时 , 通过对 3个种扩增条带的叠加性进行分析 , 证
实了洋紫荆杂交起源的父母本为红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲。
关键词:羊蹄甲属;洋紫荆;红花羊蹄甲;宫粉羊蹄甲; ISSR;指纹图谱
中图分类号:S 68　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2006) 02-0433-04
Dentification of Three Spec ies in Bauh in ia and Hybrid O rigin ofBauhinia
b lakeana Using ISSRM arkers
Luo Yuping
1 , GongWe i1 , Q iu Y ingxiong1* , and Yuk S ing G ibertC han2*
(1Laboratory of Sy stema tic and Evolutionary Botany and B iodiversity, College of Life S ciences, Zhejiang Un iversity, Hangzhou
310029, China; 2Departm ent of App lied B iology and Chem ical Technology, the Hongkong Polytechnic University, Hung Hom ,
Hongkong, China)
Abstract: In th is study, in ter-simp le sequence repeat(ISSR)was eva luated fo r its po ten tia l use in the
identifica tion o f Bauh in ia purpurea , B. blakeana and B. variega te. O f the 74 ISSR primers sub jec ted to
screening, 9 produced reproducible, po lymorphic and discrepant fragmen ts. Using these primers, 80 d iscerni-
b le DNA fragm entsw ere generated w ith 55 (68.8%) being po lymo rph ic bands. The average numbe r o fDNA
bands amp lified by each primerw as 8.88. DNA pro files based on 8 prime rs have revealed po tentia l diagnostic
fingerprin ts which could contribute to the iden tification o f 3 species inBauhinia. M eanwh ile, ISSR - PCR a-
nalysis revealed that the amplified fragments respective ly unique toB. purpurea andB. variega te showed addi-
tiv ity inB. blakeana. The molecu la r ev idence indicated thatB. blakeana was a hybrid orig in from B. pur-
purea andB. variegate.
Key words:Bauhinia;B. blakeana;B. purpurea;B. variegate;ISSR;DNA fingerprint
1　目的 、 材料与方法
洋紫荆 (Bauhinia blakeana)、 红花羊蹄甲 (B. purpurea)、宫粉羊蹄甲 (B. variega te)为苏木科
(Caesalpin iaceae)羊蹄甲属 (Bauhinia)植物 , 是热带和亚热带常见的园艺树种 。虽然三者在开花时
间和花的形态上有区别 , 但在非开花期或苗期却很难以形态标准将其鉴别开来 。近年来香港特区从内
地购买 、引种香港洋紫荆苗木时 , 常混杂有红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲幼苗 。大多数学者认为香港洋紫
荆杂交起源的父母本为红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲〔1 ～ 3〕。现利用 ISSR分析技术对洋紫荆 、 宫粉羊蹄甲 、
园　　艺　　学　　报 33卷
红花羊蹄甲进行研究 , 根据筛选出的分辨率高和重复性好的引物构建 3种羊蹄甲的 DNA指纹图谱 ,
以便为其苗期鉴定提供准确 、 快捷的方法;同时通过对洋紫荆 、 红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲之间的遗传
关系分析 , 探讨香港洋紫荆的起源问题。
表 1　供试材料及其主要形态特征
Table 1　P lantma terials used for ISSR analysis in this study and theirm orphologica l characters
种
Species
样品编号
Specim en No.
采集地点
Locality
雄蕊数
No. of stam en
果实有无
Fru it
花瓣颜色
C olor of petal
红花羊蹄甲 P1 香港理工大学 H ongkong Poly technic Un iv. 3 有 Yes 淡紫 Pale purp le
B. pu rpurea P2 香港筲箕湾 H ongkong X iaoqiw an 3 有 Yes 粉红 P ink
P3 香港沙田 H ongkong S hatian 3 有 Yes 桃红 P ink ish
P4 香港理工大学 H ongkong Poly technic Un iv. 3 有 Yes 粉红 P ink
洋紫荆 B1 香港理工大学 H ongkong Poly technic Un iv. 5 无 No 紫红 Deepm agen ta
B. blakeana B2 香港理工大学 H ongkong Poly technic Un iv. 5 无 No 紫红 Deepm agen ta
B3 香港植物园 H ongkong B otan ical Park 5 无 No 紫红 Deepm agen ta
B4 香港筲箕湾 H ongkong X iaoqiw an 5 无 No 紫红 Deepm agen ta
宫粉羊蹄甲 V1 香港沙田 H ongkong S hatian 5 有 Yes 白 W hite
B. variega te V2 香港沙田 H ongkong S hatian 6 有 Yes 白 W hite
供试 3种羊蹄甲采自香港 (表 1)。采集植株的幼嫩叶片 , 用硅胶充分干燥 , 取 0.1 g, 用 Fast-
prep (B io101 , USA)粉碎 , 采用改良 CTAB法 〔10〕提取总 DNA , 1.0 %琼脂糖电泳检测 DNA质量 ,
根据紫外吸收法估计 DNA的浓度和纯度。 ISSR反应体系经过优化确定为:25 μL体系中含约 60 ng
模板 DNA , 1.25 U Taq酶 , 1.5 mmo l L - 1 MgC l2 , 0.25 mmo l L - 1 dNTPs, 0.3 μmo l L - 1引物。
PCR扩增条件:94℃预变性 5 m in;94℃变性 1 m in, 52℃复性 45 s, 72℃延伸 2 m in, 45个循环;最
后 72℃延伸 5m in。 PCR产物在含有 EB的 2 %琼脂糖凝胶中电泳 , 以 100 bpM arke r (GeneRu le r100
ladde r, Fermentas UAB , Inc. )作为标准分子量对照 , EPSON (Japan)紫外自动成像仪照相。用 FR-
980电泳图象分析系统 (复日科技 )计算扩增片段的分子量 , 扩增位点的命名由所用引物和条带分子
量来确定。电泳图谱的每条带 (DNA片段 )均为 1个分子标记 (Marker), 代表 1个引物的结合位
点 。根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据 , 有带 (显性 )记作 1, 无带 (隐性 )
记为 0, 强带和弱带均赋值 , 根据 0 , 1矩阵建立 3个种的 DNA指纹图谱 。采用 RAPD istance软件计
算所有个体的 N eis遗传距离 , 利用 NTSYSpc-1.80版软件的 UPGMA (unwe ighted pair-g roup me thod
w ith arithmetic ave rages)构建所有个体的遗传关系树状图 , 分析 3个种的遗传关系。
2　结果与分析
2.1　引物筛选和 ISSR -PCR扩增结果
ISSR引物是根据加拿大 B ritish Co lumb ia大学公布的序列设计 , 由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成 。从 74个引物中筛选出 9个扩增条带较多 、 信号强 、 背景清晰的引物用于 ISSR - PCR反
应 。结果显示:9个引物对所有样品进行 PCR扩增 , 共扩增得到 80条 DNA条带 , 其中多态性条带
55条 , 占总条带数的 68.8%;平均每个引物扩增的 DNA带的数目为 8.88条 , 对红花羊蹄甲 、 洋紫
荆和宫粉羊蹄甲扩增得到的条带分别为 54、 62和 52条;红花羊蹄甲与洋紫荆共有的条带为 18条 ,
占总条带数的 22.5%, 宫粉羊蹄甲和洋紫荆共有的条带为 14条 , 占总条带数的 17.5% (表 2)。图 1
示部分引物扩增所得的 DNA电泳图谱 。
2.2　羊蹄甲属 3种植物的 DNA指纹图谱
ISSR分析的结果表明 , 8个引物扩增得到的 DNA指纹图谱均检测到种间差异性的特征条带 (表
2)。例如引物 UBC811在红花羊蹄甲中扩增出分子量为 1 360、 426、 365 bp的特征条带 , 在宫粉羊蹄
甲中扩增出分子量为 1 130、 767、 529 bp的特征条带 , 而在洋紫荆中则扩增出上述的 6条谱带 , 因
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　2期 罗瑜萍等:羊蹄甲属 3种园艺树种分子鉴定及亲缘关系的 ISSR分析　
此 , 引物 UBC811能将红花羊蹄甲 、 宫粉羊蹄甲和
洋紫 荆三 者 区分 开 来。同样 引 物 UBC815、
UBC817、 UBC818、 UBC835、 UBC848、 UBC855和
UBC856也能单独区分 3种羊蹄甲。因此 , 可以利
用上述 8个引物扩增的 3种羊蹄甲植物的 DNA电
泳谱带作为种间鉴定的指纹图谱。引物 UBC866在
对红花羊蹄甲的基因组 DNA进行扩增时 , 并没有
扩增出宫粉羊蹄甲和洋紫荆的 3条共有条带
(UBC866-1550、 UBC866-888、 UBC866-676), 因此 ,
图 1　用引物 UBC811 (A)、 UBC848 (B) 和 UBC866 (C)对
红花羊蹄甲 、 洋紫荆和宫粉羊蹄甲进行 ISSR-PCR分析
供试个体代码见表 1, M表示 marker, 箭头
所指为特异性条带。
Fig. 1　ISSR-PCR profiles ofB. purpurea, B. b lakeana and B. variega te
w ith prim er UBC811 (A), UBC848 (B) and UBC866 (C)
No. stands for individual code listed in Tab le 1, M indicates DNA
m arker. The arrow ind icates th e sp ecific bands.
表 2　洋紫荆 、 宫粉羊蹄甲和红花羊蹄甲的 DNA指纹图谱比较
Tab le 2　C om parison of DNA fingerprints o f
B. blak eana, B. var iega te and B. purpurea
序号
C ode
标记编号
No. of marker
红花羊蹄甲
B. purpurea
洋紫荆
B. b lakeana
宫粉羊蹄甲
B. va riegate
1 UBC811-1360 + + -
2 UBC811-1130 - + +
3 UBC811-767 - + +
4 UBC811-426 + + -
5 UBC811-365 + + -
6 UBC815-1867 - + +
7 UBC815-1455 + + -
8 UBC815-1253 + + -
9 UBC817-1140 + - +
10 UBC817-901 - + +
11 UBC817-595 + + -
12 UBC817-386 + + -
13 UBC818-1194 - + +
14 UBC818-949 - - +
15 UBC818-858 + - +
16 UBC818-712 - - +
17 UBC818-463 - + +
18 UBC818-401 + + -
19 UBC818-342 - - +
20 UBC818-261 - - +
21 UBC835-1908 - - +
22 UBC835-1351 + + -
23 UBC835-984 + + -
24 UBC835-808 + + -
25 UBC835-716 - + +
26 UBC835-469 + + -
27 UBC835-351 + + -
28 UBC835-307 - + +
29 UBC848-1568 + + -
30 UBC848-880 - + +
31 UBC848-842 + + -
32 UBC848-645 + + -
33 UBC848-418 - + +
34 UBC855-1877 + - -
35 UBC855-1766 + + -
36 UBC855-1124 - + +
37 UBC855-1039 + + -
38 UBC855-953 + + -
39 UBC856-1257 + + -
40 UBC856-1079 - + +
41 UBC856-821 + + -
42 UBC856-726 - + +
43 UBC856-391 + + -
44 UBC866-1550 - + +
45 UBC866-888 - + +
46 UBC866-676 - + +
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园　　艺　　学　　报 33卷
该引物只能将红花羊蹄甲与宫粉羊蹄甲 、洋紫荆
区分开来 , 而不能区分宫粉羊蹄甲与洋紫荆。
2.3　羊蹄甲属 3种植物的亲缘关系分析
在以 上的 9 个 引 物中 , 引 物 UBC811、
UBC815、 UBC848和 UBC856在对红花羊蹄甲和
宫粉羊蹄甲的基因组 DNA进行扩增时 , 所扩增出
的两个种间的差异条带在洋紫荆的电泳图谱中都
表现了严格的叠加 (表 2), 从而证实了洋紫荆为
红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲的杂交后代 。图 2可以
看出 , 3个种的所有样本在树状图上聚为 3支 ,
分别为红花羊蹄甲 、 洋紫荆和宫粉羊蹄甲 。由此
说明 , 这 3个种在 DNA水平出现了一定程度的遗
传分化 。本研究结果表明 , 取自于不同地点的洋
紫荆个体间 (表 1)的遗传距离为 0, 这与洋紫
荆只能进行营养繁殖的繁育特点是一致的。红花
羊蹄甲和宫粉羊蹄甲异花传粉的繁育机制则使得
图 2　洋紫荆 、 红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲间的 ISSR遗传
关系树状图 (UPGMA)
F ig. 2　D endrogram for B. b lakeana, B. purpurea, and
B. variega te based on ISSR markers (UPGMA)
种内个体间产生了一定程度的遗传变异 , 红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲的种内遗传变异为进一步选育优良
的园艺品种提供了基础。此外 , 由树状图可知 , 洋紫荆与红花羊蹄甲的遗传距离较近 , 与 Lau等 〔3〕认
为洋紫荆与宫粉羊蹄甲亲缘关系更近的结论并不一致 , 这可能是由于选用的不同引物对羊蹄甲基因组
DNA不同区域进行扩增所致。为了进一步确定洋紫荆的父母本 , 本实验室正在利用 cpDNA-RFLP分
析方法进行深入研究 。
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