全 文 ：基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31070194)资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 9期，第 2015-2023页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.9, 2015-2023
柽柳属(Tamarix L.)隶属于堇菜目柽柳科(Tamari-
caceae)，世界分布约 90种，中国分布 18种 2变种，其
中新疆塔里木盆地分布 13种 1变种(庞新安等, 2008;
杨芳, 2011;王占林等, 2012;李小燕等, 2014)。我国
柽柳属植物主要生长在西北、华北各省区的荒漠或
半荒漠地带，是荒漠、半荒漠生态系统中的关键物种
技术主题
Technology Feature
塔里木盆地荒漠区柽柳属植物总 DNA提取及 RAPD体系优化
庞新安 1 白宝伟 2 姜喜 3 陈加利 3 焦培培 1*
1新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,阿拉尔, 843300; 2塔里木大学生命科学
学院,阿拉尔, 843300; 3塔里木大学植物科学学院,阿拉尔, 843300
*通讯邮箱, jiaopeipei2000@126.com
摘 要 本研究以干旱荒漠盐生植物柽柳的幼嫩叶片为实验材料，探究摸索其总 DNA 的提取方法与
RAPD-PCR的反应体系及扩增条件。结果表明，改良 CTAB-高盐沉淀法较好地提取出了柽柳植物的总
DNA，其产量、质量均有明显提高，比较适合于多数柽柳属植物的 DNA提取；同时，通过单因素试验比较优
化筛选出了适合于柽柳植物 RAPD分析的最佳的 PCR反应体系与扩增条件，其 25 μL的反应体系中包含有
Mg2+=2.5 mmol/L、dNTPs=0.25 mmol/L、引物=0.30 μmol/L、Taq DNA聚合酶=1.5 U、模板 DNA=200 ng；其最
适扩增条件为 95℃预变性 4 min，94℃变性 30 s、36℃退火 40 s、72℃延伸 1 min、40个循环；最终在 72℃下
延伸 10 min，4℃下保存；另外，通过 6条多态性引物的扩增效果证实该优化体系比较稳定，扩增条件比较合
适，能够满足多数柽柳植物分子多态性的检测要求。
关键词 塔里木盆地,柽柳属, DNA提取, RAPD体系优化
Total DNA Extraction and RAPD System Optimization of Tamarix Plants
in Tarim Basin Desert
Pang Xinan 1 Bai Baowei 2 Jiang Xi 3 Chen Jiali 3 Jiao Peipei 1*
1 Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin Xinjiang Production & Construction Corps, Alar, 843300; 2 Col-
lege of Life Science, Tarim University, Alar, 843300; 3 College of Plant Science, Tarim University, Alar, 843300
* Corresponding author, jiaopeipei2000@126.com
DOI: 10.13417/j.gab.034.002015
Abstract In this research, the extraction method for total DNA from young leaves of Tamarix plants growing in
arid, desert, saline-alkali habitat was expored and optimized their reaction system and amplification conditions of
RAPD-PCR. The results showed that the total DNA extracted had good quality by using the improved method
based on CTAB-high salt precipitation and its yield were also high significantly, so the method could be fit for the
total DNA extraction of most plants in Tamarix L.. At the same time, by one-factor comparative experiments, the
suitable RAPD-PCR system for Tamarix plants was developed as follows: in 25 μL PCR solution, including
2.5 mmol/L Mg2+, 0.25 mmol/L dNTPs, 0.30 μmol/L primer, 1.5 U Taq DNA polymerase, 200 ng DNA template.
Moreover, the amplification conditions were 95℃ for 4 min, 40 cycles of 94℃ for 30 s, 36℃ for 40 s, and 72℃
for 1 min and a terminal extension step at 72℃ for 10 min, and then kept at 4℃. In addition, through the confirmatory
test with six polymorphic primer pairs, the optimized reaction system could amplify stably and its amplification
conditions can meet the requirement for molecular polymorphic analysis of most Tamarix L. plants.
Keywords Tarim basin, Tamarix L., DNA extraction, RAPD Optimization
与重要建群种，在我国荒漠植被中占有重要地位(庞
新安等, 2009; 杨芳, 2011; 王占林等, 2012; 李小燕
等, 2014)。目前，国内外学者已对柽柳属植物的种属
分类、起源演化、形态特征、生态习性、生理特性以及
植物化学等多方面进行了相关研究 (翟诗虹等, 1983;
姜岩青和左春旭, 1988;张元明, 1998;冯缨和尹林克,
2000;曾凡江等, 2002;张道远, 2003;杨芳, 2011)。同
时，部分学者也研究了柽柳属植物部分种属的遗传
多样性(张娟等, 2003a;赵景奎, 2006;李锐, 2007;赵
景奎等, 2008; 蒋志敏, 2011; 张如华等, 2011; 张如
华, 2011;蒋志敏等, 2011)。
DNA分离提取是植物分子生物学研究的基础，其
质量好坏是所有分子实验成败的关键(王彦芹等, 2007)。
植物细胞中所含次生代谢产物种类、含量不同，而需
要采取不同的 DNA提取方法(侯艳霞等, 2009)。目前，
生长于干旱地区的木本盐生植物因其富含多糖、色
素、酚类等次生物质，其 DNA提取质量较差，尚无比
较成熟的提取方案。
RAPD技术是在 PCR基础上对整个未知序列基
因组进行分子多态性分析标记，以简便、快速、灵敏、无
需预知基因组 DNA序列特点，广泛应用于遗传多样
性检测与亲缘关系鉴定(焦培培等, 2012)。然而 RAPD
技术易受外界因素影响，稳定性与重复性较差，对于
RAPD应用而言，获取稳定可重复的反应体系至关重
要(代文娟等, 2013)。
柽柳属植物常年生长在干旱荒漠盐碱环境下，
叶片针形较硬，叶色浓绿，富含多糖、色素、多酚等次
生物质，其基因组 DNA不容易被较好地提取(张娟
等, 2003b;蒋志敏, 2011)。因此，获取适合于柽柳属
植物 RAPD分析的高质量 DNA与稳定的 PCR反应
体系是进一步探究柽柳属植物分子多态性与遗传多
样性的技术基础与前提条件。
本研究针对柽柳植物次生代谢物质含量高且复
杂的特点，运用改良的 CTAB法提取多种柽柳植物
的总 DNA，进而获取最佳的快速的适合于柽柳植物
DNA提取的方法。同时，对影响 PCR反应的引物、
Mg2+、dNTPs、模板 DNA浓度和 Taq DNA聚合酶进
行单因素实验，以期优化筛选出适合于柽柳植物
RAPD分析的 PCR反应体系与扩增条件。
1结果与分析
1.1 DNA提取与检测
1.1.1 DNA紫外检测
应用改良 CTAB 法提取的多种柽柳属植物总
DNA的 A260、A280、A260/A280及提取得率见表 1。结果表
明，改良 CTAB法提取的总 DNA的 A260/A280的比值
分别处于 1.81~1.85之间，得率在 4 450~5 145 ng/μL
之间，说明 DNA中所包含的杂质与 RNA含量较少，
纯度、浓度均比较高。
表 1改良 CTAB法提取柽柳 DNA的紫外检测
Table 1 The UV detection results of DNA extracted by improved
CTAB method for Taramix L.
编号
No.
1
2
3
4
5
6
试验材料
Material
多枝柽柳
T. ramosissima
多花柽柳
T. hohenackeri
刚毛柽柳
T. hispita
短毛柽柳
T. karelinii
长穗柽柳
T. elongata
细穗柽柳
T. leptostachys
A260
98.223
96.568
92.447
102.895
97.112
89.006
A280
54.267
53.059
50.243
56.848
52.493
48.637
A260/A280
1.81
1.82
1.84
1.81
1.85
1.83
浓度(ng/μL)
Content (ng/μL)
4 911.2
4 828.4
4 622.4
5 144.8
4 855.6
4 450.3
1.1.2 DNA电泳检测
应用改良 CTAB 法提取的多种柽柳属植物总
DNA 的凝胶电泳检测见图 1。结果显示，用改良
CTAB法提取的 6种柽柳属植物的总 DNA电泳图
没有明显拖尾，点样孔里比较干净、少有残留，说明
用该方法提取的 DNA片段较完整、无降解、少杂质。
电泳检测结果与紫外检测结果一致，进一步说明用
改良 CTAB法提取的柽柳属植物基因组 DNA的质
量较高。
1.2 RAPD-PCR体系单因素优化
1.2.1 Mg2+浓度对 RAPD-PCR的影响效应
不同浓度的 Mg2+在柽柳 RAPD-PCR扩增反应
中的影响效应见图 2。结果显示，泳道 1有 4条可辨认
的带，上下 2条清晰，中间 2条模糊；泳道 2至 5相对
泳道 1，具有 5条可辨认的带，即在小于 2 000 bp的区
域出现一条带，同时条带明显变亮，清晰度也增强，其
中泳道 4效果最好。
由此可见，Mg2+浓度显著影响 RAPD-PCR的扩
增效果，浓度过低会影响 Taq酶活性致使个别条带
产量太少进而无法显示条带，浓度过高则可影响模
板忠实性进而降低扩增特异性；因此，柽柳植物对Mg2+
塔里木盆地荒漠区柽柳属植物总 DNA提取及 RAPD体系优化
Total DNA Extraction and RAPD System Optimization of Tamarix Plants in Tarim Basin Desert
2016
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 1改良 CTAB法提取柽柳 DNA的凝胶电泳图谱
注: M: Marker DL15000; 1~6分别代表多枝柽柳,多花柽柳,刚
毛柽柳,短毛柽柳,长穗柽柳,细穗柽柳
Figure 1 Agarose gel electrophoretic of DNA extracted by im-
proved CTAB method for Taramix L.
Note: M: Marker DL15000; 1~6: T. ramosissima, T. hohenackeri,
T. hispita, T. karelinii, T. elongate, T. leptostachys
图 2不同浓度Mg2+对 RAPD-PCR结果的影响
注: M: Marker DL2000; 1~5 分别代表 Mg2+浓度 1.0 mmol/L,
1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L, 3.0 mmol/L
Figure 2 The effects on the RAPD-PCR results of different Mg2+
concentrations for Taramix L.
Note: M: Marker DL2000; 1~5 stands for Mg2+ concentrations of
1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L, 3.0 mmol/L
浓度有所要求，适宜的Mg2+浓度为 2.0~3.0 mmol/L。
本实验以 Mg2+浓度 2.5 mmol/L (泳道 4)作为后续筛
选的基础。
1.2.2 dNTPs浓度对 RAPD-PCR的影响效应
不同浓度的 dNTPs在柽柳 RAPD-PCR扩增反应
中的影响效应见图 3。结果显示，泳道 1至 6均有 5条
可辨认的带，整体而言也比较清晰。随 dNTPs浓度的
增加，各条带均有逐渐增亮的趋势，其中泳道 4的各
条带亮度适中且已清晰可辨。
由此可见，dNTPs浓度显著影响 RAPD-PCR的
扩增效果，即随着 dNTPs浓度的逐渐增高，PCR扩增
出的条带亮度逐渐增加，条带的清晰度也随之升高；
因此，柽柳植物对 dNTPs浓度有所要求，适宜的
dNTPs浓度为 0.20~0.35 mmol/L。本实验以 dNTPs浓
度 0.25 mmol/L (泳道 4)作为后续筛选的基础。
图 3不同浓度 dNTPs对 RAPD-PCR结果的影响
注: M: Marker DL2000; 1~6分别代表 dNTPs浓度 0.10 mmol/L,
0.15mmol/L, 0.20mmol/L, 0.25mmol/L, 0.30mmol/L, 0.35mmol/L
Figure 3 The effects on the RAPD-PCR results of different
dNTPs concentrations for Taramix L.
Note: M: Marker DL2000; 1~6 stands for dNTPs concentrations of
0.10mmol/L, 0.15mmol/L, 0.20mmol/L, 0.25mmol/L, 0.30mmol/L,
0.35mmol/L
1.2.3引物浓度对 RAPD-PCR的影响效应
不同浓度的引物在柽柳 RAPD-PCR扩增反应中
的影响效应见图 4。结果显示，泳道 1至 3中的条带扩
增较弱，且不清晰，难以分辨；泳道 4与 5相对泳道 1、
2、3而言，条带比较清晰明亮可辨且扩增充分完全，其
中泳道 5的效果最好。
由此可见，引物浓度显著影响 RAPD-PCR扩增
效果，即引物浓度过低会造成 PCR扩增不完全；因此
柽柳植物对引物浓度有所要求，适宜引物浓度为
0.25~0.35 μmol/L。本实验以引物浓度 0.30 μmol/L
(泳道 5)作为后续筛选基础。
1.2.4 Taq DNA聚合酶浓度对 RAPD-PCR的影响效应
不同浓度的 Taq酶在柽柳 RAPD-PCR扩增反应
中的影响效应见图 5。结果显示，泳道 1至 5均有 5条
图 4不同浓度引物对 RAPD-PCR结果的影响
注 : M: Marker DL2000; 1~5 分别代表引物浓度 0.1 μmol/L,
0.15 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.25 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.35 μmol/L
Figure 4 The effects on the RAPD-PCR results of different primer
concentrations for Taramix L.
Note: M: Marker DL2000; 1~5 stands for primer concentrations
of 0.1 μmol/L, 0.15 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.25 μmol/L, 0.3 μmol/L,
0.35μmol/L
2017
塔里木盆地荒漠区柽柳属植物总 DNA提取及 RAPD体系优化
Total DNA Extraction and RAPD System Optimization of Tamarix Plants in Tarim Basin Desert
可辨认的带，整体而言也比较清晰；但泳道 1 中
2 000 bp左右的条带扩增较强，造成大于该片段大
小的下部条带其可辨度降低，泳道 3与 4及 5中的
条带清晰可辨。
由此可见，Taq酶浓度显著影响 RAPD-PCR的扩
增效果，即随着 Taq酶浓度的逐渐增高，PCR扩增出
的条带逐渐清晰，其可辨识度逐渐增高；因此，柽柳植
物对 Taq 酶浓度有所要求，适宜的 Taq 酶浓度为
1.5~2.5 U。从经济学角度出发，本实验以 Taq酶浓度
1.5 U (泳道 3)作为后续筛选的基础。
1.2.5模板 DNA浓度对 RAPD-PCR的影响效应
不同浓度的模板 DNA在柽柳 RAPD-PCR扩增
反应中的影响效应见图 6。结果显示，泳道 1至 5中均
有 5条可辨认的带，上面 2条清晰明亮，下面 3条模
糊，其中泳道 2效果最好；泳道 3至 5相对泳道 1与
图 5不同浓度 Taq DNA聚合酶对 RAPD-PCR结果的影响
注: M: Marker DL2000; 1~5 分别代表 Taq DNA 聚合酶浓度
0.5 U, 1.0 U, 1.5 U, 2.0 U, 2.5 U
Figure 5 The effects on the RAPD-PCR results of different Taq
DNA polymerase concentrations for Taramix L.
Note: M: Marker DL2000; 1~5 stands for Taq DNA polymerase
concentrations of 0.5 U, 1.0 U, 1.5 U, 2.0 U, 2.5 U
2，条带逐渐模糊变淡，其中泳道 4中的中间条带辨识
度较低。
由此可见，模板 DNA浓度显著影响 RAPD-PCR
的扩增效果，即随着模板 DNA浓度的逐渐增高，PCR
扩增出的条带逐渐清晰可辨；同时，模板 DNA浓度过
高，容易带有杂质，影响扩增效果；因此柽柳植物对模
板 DNA浓度有所要求，适宜模板 DNA浓度为 200~
250ng，本实验选取 200ng模板DNA浓度(泳道 2)作为
后续筛选基础。
1.2.6柽柳 RAPD-PCR体系优化的效果验证
图 7为柽柳植物 RAPD优化体系 PCR验证的电
泳图谱。结果显示，泳道 1至 6中均出现扩增条带，同
时带型清晰可辨，3份柽柳植物 DNA样品在不同引
物扩增条件下表现出不同的多态性；由此可见，已获
取的 PCR优化体系扩增效果比较好，也较稳定，可以
满足多态性检测要求。
图 6不同浓度模板 DNA对 RAPD-PCR结果的影响
注: M: Marker DL2000; 1~5分别代表模板 DNA浓度 250 ng,
200 ng, 150 ng, 100 ng, 50 ng
Figure 6 The effects on the RAPD-PCR results of different tem-
plate DNA concentrations for Taramix L.
Note: M: Marker DL2000; 1~5 stands for template DNA concen-
trations of 250 ng, 200 ng, 150 ng, 100 ng, 50 ng
图 7柽柳 RAPD优化体系的 PCR验证
注 : M: Marker DL2000; 1~6 分别代表引物 H2, H4, H6, H9,
H10, H11,每条引物 3个样品重复
Figure 7 The PCR verification results of the optimized RAPD re-
action system for Taramix L.
Note: M: Marker DL2000; 1~6 stands for primer of H2, H4, H6,
H9, H10, H11 and 3 samples per primer
2讨论
2.1柽柳属植物总 DNA提取
柽柳属植物因适应干旱气候与沙漠环境，叶表皮
角质层较厚，细胞内富含多糖、多酚、单宁、纤维等次
生物质，这些次生物质容易在 DNA提取过程中与所
提 DNA形成粘稠胶状物沉淀，氧化褐变抑制酶活性，
严重影响所提 DNA产量与质量(赵景奎等, 2008)。因
此如何简便有效去除多糖、多酚以及抗氧化、防褐变
是提取柽柳 DNA的关键。
一般而言，DNA提取方法主要有 SDS法、CTAB
法或两者的改良型，如 SDS-高盐低pH法、CTAB-
高盐沉淀法、CTAB 裂解 - 硅珠吸附法等(张丽等 ,
2011;马帅等, 2014)。先前，国内学者分别通过 SDS-
2018
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
高盐低 pH法、CTAB-高盐沉淀法、CTAB裂解-硅
珠吸附法较好地提取了柽柳属同属植物刚毛柽柳、
白花柽柳、中国柽柳的 DNA(张娟等, 2003b;华丽和
潘伯荣, 2003; 赵景奎, 2006; 李锐, 2007; 赵景奎等,
2008; 蒋志敏, 2011; 张如华等, 2011; 张如华, 2011;
蒋志敏等, 2011)；然而，SDS-高盐低pH法并不能很
好地除尽单宁类物质，所获 DNA的得率较高，但杂
质较多；同时，CTAB裂解-硅珠吸附法虽因硅珠的
吸附纯化作用，可获得高纯度的 DNA，但得率较低，
难以大量制备；另外，这三种方法能否普遍适用于柽
柳属植物，即是否存在共性需要探索。
本实验所采用的 CTAB法主要是以高盐沉淀法
为基础，进一步改良以适用多数柽柳植物种的 DNA
提取。其中 CTAB作为阳离子去污剂，在低盐溶液中
与核酸形成复合物，这些复合物因溶解度降低而沉淀，
在高盐溶液中却与核酸解离反与多糖结合形成复合物
而不沉淀核酸，进而离心分离多糖获得 DNA上清液
(易庆平等, 2007)；同时氯仿-异戊醇反复抽提可导致
蛋白质变性、分层、沉淀，继而强效去除蛋白类物质；另
外聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、抗坏血酸(Vc)、β-巯基乙醇
可与多酚单宁类物质结合形成不溶性络合物，并使多
酚氧化酶失活，避免多酚单宁类化合物所介导的DNA
降解，有效防止 DNA褐变与被氧化，去除多酚单宁类
物质，进而提高DNA纯度与得率(王卓伟等, 2001)。
本实验应用改良的 CTAB-高盐沉淀法提取多
数柽柳植物(6种)的 DNA，紫外检测、电泳检测显示
其所提 DNA的产量、质量均有明显提高，同时经过
PCR检验表明其扩增效果也比较理想；因而，该方法
简便有效，比较适用于多数柽柳属植物种的 DNA提
取，并能够满足 RAPD或其他分子标记(SSR, ISSR,
RFLP)的要求，这为进一步研究柽柳属植物整体的遗
传多样性奠定了较好的技术基础。
2.2柽柳属植物 RAPD-PCR体系优化
RAPD-PCR属于微量操作，PCR反应体系中各
组分变化直接影响扩增效果，进而影响 RAPD结果。
因此有必要针对具体的植物材料优化摸索合适的反
应体系与条件。
一般而言，在 RAPD-PCR反应体系中，Mg2+的浓
度、dNTPs与引物的用量、DNA聚合酶的种类与用量、
模板 DNA的浓度与纯度、扩增程序与循环周期等均
会影响 PCR的扩增式样，可表现在产物丰度的增减、
弱带的不稳定甚至带谱的明显改变等(李立群等, 2011)。
虽然，已有部分学者运用 RAPD-PCR技术研究了柽
柳属同属植物刚毛柽柳与中国柽柳的遗传多样性，并
对其反应体系及条件进行了有益探索(张娟等, 2003a;
张娟等, 2003b;赵景奎, 2006;赵景奎等, 2008)；但是，
普遍适用于柽柳属植物多数物种的 RAPD-PCR反应
体系与条件则需要进一步的摸索与优化。
本实验通过单因素多水平设计试验，比较优化
了 RAPD-PCR最佳的反应体系与扩增条件。结果表
明Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶、模板 DNA的浓度
与纯度均能显著影响 RAPD-PCR的扩增效果，特别
是模板 DNA 的质量直接影响其扩增效果；同时，
PCR 反应的循环次数与退火温度也明显影响 PCR
的扩增效果。
2.3柽柳属植物总 DNA提取
通过对 CTAB-高盐沉淀法的进一步改良，添加
抗坏血酸(Vc)、提高盐浓度以及氯仿-异戊醇的多次
抽提，彻底去除了 DNA提取液中的多糖、多酚、单宁
等次生物质，同时防止了 DNA的褐变、氧化、降解，
进而提高了所提 DNA的质量与产量，同时经过 PCR
检验也表明其扩增效果比较理想；因而试验证明，该
方法简便有效，也比较适用于多数柽柳属植物的
DNA提取与 RAPD分析。
2.4柽柳属植物 RAPD-PCR体系优化
2.4.1最佳反应体系
选用 25.0 μL 体系，内含 Mg2+=2.5 mmol/L、
dNTPs=0.25 mmol/L、引物=0.30 μmol/L、Taq DNA聚
合酶=1.5 U、模板 DNA=200 ng。
2.4.2最适扩增条件
程序参数设定为 95℃预变性 4 min；94℃变性
30 s，36℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，40个循环；最终
在 72℃下延伸 10 min，4℃保存备用。
3材料与方法
3.1实验材料
本实验材料来自于新疆南疆阿拉尔周边地区的
柽柳属植物(多枝柽柳,多花柽柳,刚毛柽柳,短毛柽柳,
长穗柽柳,细穗柽柳)；野外采集柽柳植物当年生幼嫩
叶片，立即用变色硅胶彻底干燥，带回实验室备用。
3.2仪器与试剂
3.2.1仪器
高速冷冻离心机(5417R型,德国 Eppendorf公司)、
2019
恒温水浴锅(HHS型,江苏金坛医疗仪器厂)、紫外-可
见分光光度计(Ultrospec 4300 pro型,瑞典Amersham
Biosciences公司)、通用电泳仪(DYY-7C型,北京六一
仪器厂)、水平电泳槽(DYY-Ⅲ型,北京六一仪器厂)、智
能型热循环 PCR仪(Fcycler96孔型,美国 Bio-Rad公
司)、凝胶成像分析系统(Universal Hood I Gel2000型,
美国 Bio-Rad公司)等。
3.2.2试剂
Tris、HCl、EDTA、NaCl、硼酸、十六烷基三甲基
溴化铵(CTAB)、β-巯基乙醇、抗坏血酸(Vc)、聚乙烯
吡咯烷酮(PVP)、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇等
均为分析纯；PCR扩增试剂(Mg2+, dNTPs, 引物, Taq
DNA聚合酶)与 DNA Marker DL 2000、RNase A均来
自东盛生物公司。
(1)CTAB-free缓冲液由以下试剂组成：200mmol/L
Tris-HCl (pH8.0)、50mmol/LEDTA(pH8.0)、250mmol/L
NaCl。
(2) 2×CTAB 提取缓冲液由以下试剂组成：2%
(W/V,2g/100mL)CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、
20 mmol/L EDTA (pH 8.0)、1.4 mol/L NaCl，1% PVP，
2% β-巯基乙醇(使用前加入)。
(3) 50 ×TBE 缓冲液由以下试剂组成：54.0 g
Tris-Base、27.5 g 硼酸、20 mL 0.5 mol/L EDTA (pH
8.0)，加去离子水定容至 1 000 mL。
3.3 DNA提取
(1)称取已硅胶干燥的柽柳叶片 1.0 g，加入少量
石英砂、抗坏血酸(Vc)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)于研钵
中液氮环境下充分研磨，并时常添加液氮；研磨至粉
末状后，装入 50 mL已液氮预冷的离心管中，备用。
(2)于离心管中加入 4℃预冷的 CTAB-free缓冲
液 300 μL与 β-巯基乙醇100 μL，充分混匀；4℃，
12000r/min，离心 10min，舍弃上清液，保留沉淀，备用。
(3)于沉淀中加入 65℃预热的 2× CTAB提取缓
冲液 300μL与 β-巯基乙醇100μL，65℃水浴 60min，
不定时间隔颠倒摇匀；于 4℃下，以 11 000 r/min 离
心10 min，舍弃沉淀，保留上清液，备用。
(4)取上清液，加入 65℃预热的 2× CTAB提取缓冲
液 200μL，混匀 5min；再加入 200μL的氯仿 /异戊醇
(24:1)，缓慢翻转摇匀，静置 10min；4℃，11 000 r/min，离
心 10min，舍弃沉淀，留上清液，备用。
(5)取上清液，加入等体积的的氯仿 /异戊醇(24:1)，
缓慢翻转摇匀，静置 10 min；4℃，11 000 r/min，离心
10 min，弃沉淀，留上清液，备用。
(6)取上清液，加入等体积的的氯仿 /异戊醇(24:1)，
缓慢翻转摇匀，静置 10 min；4℃，11 000 r/min，离心
5 min，弃沉淀，留上清液，备用。
(7)取上清液，加入 2倍体积的预冷的(-20℃)异丙
醇，轻轻摇晃，充分混匀，静置 20min；4℃，10000 r/min，
离心 10 min，弃上清液，留沉淀(白色絮状)，备用。
(8)于沉淀中加入 70%乙醇浸泡清洗 2次，风干；再
加入一定体积的双蒸水(已灭菌)溶解，并添加 RNaseA
于 37℃消化 30min；-20℃保存，备用。
3.4 DNA质量检测
3.4.1紫外检测
运用紫外-可见分光光度计分别测定柽柳DNA
样品不同波长下的光吸收值(260 nm, 280 nm)，检测
样品内所含有的核酸、蛋白质；样品 DNA提取率通
过 A260值估算，样品 DNA纯度通过 A260/A280比值进
行判断。
3.4.2电泳检测
将所提取的柽柳 DNA样品在电压 110 V、1%琼
脂糖凝胶(内含 Gelview核酸染料 0.1 μL/mL)中电泳
60 min；采用凝胶成像系统观察柽柳 DNA的电泳条
带与大小及完整性，同时拍照记录。
3.5 RAPD-PCR体系优化
随机性抽取 1份柽柳 DNA样品(改良 CTAB法
提取)为模板，用引物 H4 (5-GTGACGTAGG-3)进
行 PCR扩增；并以基本反应体系(25 μL体系中:引
物=0.15 μmol/L, Mg2+=3.0 mmol/L, Taq DNA聚合酶
=1.0 U, dNTPs=0.2 mmol/L, 模板 DNA=150 ng)为基
础，通过单因素设计试验筛选优化。
3.5.1单因素优化设计
按表 2的单因素梯度设计引物、Mg2+、Taq DNA
聚合酶、dNTPs、模板 DNA浓度，以基本反应体系为
基础，每次改变该体系中的 1个因素，以确定该因素
对 PCR扩增结果的影响。
3.5.2优化体系的验证
随机选取 3份柽柳植物 DNA样品，运用已筛选
出的 6条多态性引物(表 3)，在已优化的 PCR反应体
系中进行 PCR扩增检测多态性，进而验证体系优化
的效果。
作者贡献
庞新安是本研究执行人，完成实验设计与数据
塔里木盆地荒漠区柽柳属植物总 DNA提取及 RAPD体系优化
Total DNA Extraction and RAPD System Optimization of Tamarix Plants in Tarim Basin Desert
2020
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表 2柽柳 RAPD-PCR反应体系单因素设计水平表
Table 2 The leverof the RAPD-PCR reaction system by single factor design for Taramix L.
序号
No.
1
2
3
4
5
因素
Factor
镁离子浓度(mmol/L)
Mg2+concentration (mmol/L)
dNTPs浓度(mmol/L)
dNTPs concentration (mmol/L)
引物浓度(μmol/L)
Primer concentration (μmol/L)
Taq DNA聚合酶浓度(U)
Taq DNA polymerase concentration (U)
模板 DNA浓度(ng)
Template DNA concentration (ng)
水平
Level
1
1.0
0.10
0.10
0.5
250
2
1.5
0.15
0.15
1.0
200
3
2.0
0.20
0.20
1.5
150
4
2.5
0.25
0.25
2.0
100
5
3.0
0.30
0.30
2.5
50
6
0.35
0.35
表 3柽柳 RAPD-PCR反应体系的引物信息表
Table 3 The primer information of the optimized RAPD-PCR reac-
tion system for Taramix L.
序号
No.
1
2
3
4
5
6
引物
Primer
H2
H4
H6
H9
H10
H11
序列(5-3)
Sequence (5-3)
TGAAGCCAAA
ATGTCCCGTG
CCCTAGTTAC
CCCGTTAGCT
AATTGCTACG
GGGACCTGTC
分析及论文撰写；白宝伟、姜喜和陈加利是本研究实
验材料提供者，参与实验材料野外采集与前处理；焦
培培是本研究通讯作者，主要负责实验方案构思与
论文修改及最后审阅。
致谢
本研究借助塔里木盆地生物资源保护利用重点
实验室分子平台完成，并由国家自然科学基金项目
(31070194)资助；同时塔里木大学 2012届本科生苗如
强同学与肖泽权同学参与了部分实验工作，在此一并
表示衷心感谢！
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