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药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(2) ·255·
Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis
采用 RAPD 技术对人参属的亲缘关系和鉴别的分析 *
刘丽 1，2，肖炳燚 2，聂平 2，罗晖明 2，丁野 2，舒毕琼 2，孙辉 2，李玲 2，李文莉 1，2**
（1. 中南大学药学院，长沙 410013；2. 湖南省食品药品检验研究院，长沙 410001）
摘要　目的：分析人参属 3 种植物的亲缘关系及其可用于鉴别的特异性 DNA 片段。方法：采用随机扩增
多态性 DNA 分子标记技术（RAPD）对人参属 3 种药材的基因组 DNA 进行多态性分析，筛选特异性片
段并进行切胶回收、克隆及测序。结果：从 120 条随机引物中筛选出 12 条随机引物用于聚合酶链式反应
（PCR）扩增，共扩增出 111 条扩增片段，其中多态性位点 107，多态性百分率为 96.40%；从聚类分析图可
以看出：人参与西洋参的种间亲缘关系最近，聚为一类，而三七相对其他 2 种较远，单独聚为一类；将筛选
出的显性标记的特异性片段进行切胶回收、克隆并测序获得其 DNA 序列。结论：aRAPD 标记技术从分
子水平提示了人参属 3 种植物的亲缘关系，并为后期的特异性鉴别提供基础。根据序列设计用于鉴别人
参、西洋参、三七的特异性 PCR 引物，实现从理论研究向药材鉴别实际运用的转变。
关键词：DNA 分子标记技术；随机扩增多态性 DNA（RAPD）；人参属；亲缘关系；中药材基因；特异性
鉴别
中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2016）02-0255-06
doi：10.16155/j.0254-1793.2016.02.10
Analysis on genetic relations among 3 species and
identification of Panax by RAPD marker*
LIU Li1，2，XIAO Bing-yi2，NIE Ping2，LUO Hui-ming2，DING Ye2，
SHU Bi-qiong2，SUN Hui2，LI Ling1，2，LI Wen-li1，2**
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Central South University，Changsha 410013，China；
2.Hunan Institute for Food and Drug Control，Changsha 410001，China）
Abstract　Objective：To study the genetic relations of 3 species of Panax and specific DNA fragments for
identification．Methods：Random amplified polymorphic DNA （RAPD） technology was used to analyze
the polymorphism of DNA in the 3 species of Panax，and the specific fragments were selected for cutting-
gel collection，cloning and sequencing．Results：Totally 12 out of 120 random primers were selected for PCR
amplification and a total of 111 bands were amplified，among which 107 （96.40%） bands were polymorphic．
Cluster analysis indicated that Panax could be divided into 2 categories，Panax ginseng and Panax quinquefolium
for one categories，Panax notoginseng for the other categories．The specific fragments of the dominant markers
　　*　 国家科技重大专项课题，中药质量安全检测和风险控制技术平台 ( 编号：2014ZX09304307-002)；湖南省自然科学基金项目 ( 编号：
13JJ3132)
　　**　通信作者　Tel：(0731)82275866；E-mail：1838675867@qq.com
　　　　第一作者　Tel：18890393007；E-mail：416223012@qq.com
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·256· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(2)
Chinese
were selected and the DNA sequences were obtained by cloning and sequencing．Conclusion：At the molecular
level，RAPD marker indicates the relationships among 3 species of Panax and provides the basis for specific
identification in future.According to the acquired sequence，the specific polymerase chain reaction （PCR） primers
for the identification of Panax ginseng，Panax quinquefolium or Panax notoginseng can be designed，which
suggests the theoretical research could turn into the practical application to identification of medicinal materials.
Keywords：DNA molecular marker technology；random amplified polymorphic DNA （RAPD）；Panax；genetic
relation；Chinese herbal medicine gene；specificity identification
五加科人参属 Panax 主要药用植物为人参
Panax ginseng C.A.Mey.、西洋参 Panax quinquefolium
L. 和 三 七 Panax notoginseng （Burkill） F.H.Chen ex
C.Chow & W.G.Huang［1］。人参为五加科植物人参
Panax ginseng C.A.Mey. 的干燥根和根茎，多于秋季
采挖，洗净经晒干或烘干。人参按照生长方式可分
为野山参、园参、林下参等。野生的称为野山参；栽培
的称为园参；将园参种子或野生人参种子，人工播种
于山林之中，自然生长 10~20 年以上而成货者，则为
林下参，也称为籽海［2-3，9］。西洋参主产于美国威斯
康辛州和加拿大安大略省；我国市场上的西洋参主要
有进口与引进种植 2 种。三七主产于云南、广西［4］。
三者都是我国常用的珍贵药材，但其价格差异大，西
洋参的价格比人参高出几倍。所以，市场上经常出现
用人参充作西洋参，或其他根类药材如商陆根、紫茉
莉根、栌兰根等充作人参［5-6］。伪品不仅不具有药理
作用，甚至可能产生毒副作用。传统的分析鉴别方
法，是根据形态、组织结构特征和化学成分进行鉴别，
而这些传统的鉴别方法干扰因素较多，易受环境和植
物本身的影响和限制；而现代分子生物学方法，从分
子水平上客观地反映物种的基因片段差异，基因多态
性决定物种的遗传多样性，随着科学的不断进步，应
用 DNA 分子标记技术鉴定中药材及其饮片，取得了
快速发展［7］。所以，检测物种基因多态性的分子生物
标记可以对传统中药鉴别方法进行补充［8］，如中国药
典已收载蕲蛇、乌梢蛇、川贝母等药材的 DNA 分子鉴
别方法［2］72，349。詹鑫婕等［9］建立聚合酶链式反应 -
单链构象多态（polymerase chain reaction-single strand
conformation polymorphism，PCR-SSCP）技术鉴别人参
和西洋参。随机扩增多态性 DNA （random amplified
polymorphic DNA，RAPD）技术是基于聚合酶链式反
应（polymerase chain reaction，PCR）技 术 的 DNA 多
态性检测分子标记技术，通过 PCR 扩增分析基因的
DNA 指纹信息。RAPD 技术在物种种系的研究中，
被广泛地应用于植物种内变异及其亲缘关系的研
究［10-12］，本研究收集了不同类型的人参如林下参、园
参等，多个产地的西洋参与三七药材，采用 RAPD 标
记方法研究人参属 3 种药材的遗传关系，为其特异性
鉴别提供基础。
1　材料和方法
1.1　材料
本实验所用样本来源于野外采集和药材市场购
买，收集后放置硅胶干燥器中保存备用。样品共 29
份，分别为人参 10 份、西洋参 10 份、三七 9 份，均保
存于湖南省食品药品检验研究院，均经湖南省食品
药品检验研究院中药室主任丁野鉴定，样品信息详
见表 1。溶菌肉汤（Luria-Bertani，LB）培养基和 LB
固体或液体培养基（含 100 μg·mL-1 氨苄青霉素）
根据《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克 D.W 拉塞
尔著）进行配制，其中包括胰蛋白胨，酵母提取物，
氯化钠，琼脂和氨苄青霉素。
1.2　方法
1.2.1　DNA 提取　选取已干燥样本，用 70% 乙醇
擦拭样本表面，在液氮中预冻，并用高通量组织研磨
仪研成粉末，采用新型广谱植物基因组 DNA 快速
提取试剂盒（YuanPingHao Bio）提取总 DNA。采用
琼脂糖凝胶电泳和微量紫外 - 分光光度仪（Thermo
Nanodrop 2000）检测 DNA 质量、浓度及纯度。
1.2.2　RAPD 引 物 的 筛 选　RAPD 引 物 购 自 SBS
Genetech Co.，Ltd，共 120 条。先选取人参、西洋参
和三七各 2 个样本进行引物初筛，经过多次筛选，选
出扩增条带具有多态性、可重复的引物对所有样品
扩增分析，每个引物至少扩增 2 次。
1.2.3　PCR 扩 增 和 电 泳 检 测　PCR 扩 增 在 ABI
Veriti PCR 仪 上 进 行。 优 化 的 PCR 扩 增 反 应 体
系：总 体 积 25 μL，其 中 引 物（2.5 μmol·L-1） 2
μL，dNTPs （2.5 mmol·L-1） 2 μL，10×PCR Buffer
2.5 μL，Taq 酶（2.5 U·μL-1） 0 .4 μL，MgCl2
（25 mmol·L-1） 2.5 μL，模板 DNA 1 μL，其余以灭菌
ddH2O 补充至 25 μL。
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表 1　样本信息
Tab. 1　Sample information
序号
（No.）
品种名
（species name）
实验编号
（experiment number）
来源
（location）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
林下参（under-forest ginseng）
园参（planted ginseng）
园参（planted ginseng），
园参（planted ginseng）
园参（planted ginseng），
园参（planted ginseng）
园参（planted ginseng）
园参（planted ginseng）
园参（planted ginseng）
园参（planted ginseng）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
西洋参（Panax quinquefolium）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
三七（Panax notoginseng）
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9
R10
X1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
辽宁省本溪市（Benxi，Liaoning province）
吉林省集安市（Ji’an，Jilin province）
吉林省集安市（Ji’an，Jilin province）
吉林省集安市（Ji’an，Jilin province）
吉林省抚松县（Fusong county，Jilin province）
吉林省白山市（Baishan，Jilin province）
吉林（Jilin province）
东北（Northeast China）
东北（Northeast China）
吉林（Jilin province）
北京怀柔县（Huairou，Beijing）
山东省文登市（Wendeng，Shandong）
山东省文登市（Wendeng，Shandong）
山东省文登市（Wendeng，Shandong）
山东省文登市（Wendeng，Shandong）
吉林白山市（Baishan，Jilin province）
加拿大（Canada）
加拿大（Canada）
加拿大（Canada）
山东（Shandong）
云南（Yunnan）
云南（Yunnan）
云南（Yunnan）
云南（Yunnan）
云南省马龙县（Malong，Yunnan）
云南省建水县（Jianshui，Yunnan）
广西那坡县（Napo，Guangxi）
云南省洪河州（HongHezhou，Yunnan）
广西靖西县（Jingxi，Guangxi）
性片段，以已纯化的特征性 DNA 片段为模板，以筛
选的特征性引物进行二次 PCR 扩增，退火温度提高
2 ℃，对扩增产物进行电泳鉴定。
1.2.6　RAPD 特异片段与载体的连接及重组质粒
的筛选　将纯化回收的 PCR 产物与 pGM-T Vector
进行连接，pGM-T Vector （50 ng·μL-1）1 μL，PCR
产物 3 μL，T4 DNA Ligase （3 U·μL-1）1 μL，DNA
Ligation Buffer 1 μL，其 余 以 灭 菌 ddH2O 补 充 至
10 μL，加样完成后，充分混匀，1 000 r·min-1 离心
10 s，16 ℃水浴连接过夜。
将连接产物 10 μL 加入到 100 μL 的感受态
细胞中，轻敲小管使其混匀，冰浴放置 30 min，将离
心管置于 42 ℃下水浴 3 min；立即冰上放置 3 min
（不要摇动小管）。加入 1 mL 预冷的溶菌肉汤（Luria-
Bertani，LB）液体培养基，放入温控摇床培养箱，37 ℃，
250 r·min-1 下振荡培养孵化 1 h；1 000 r·min-1 离
心 30 s，去除 800 μL 上清液，吹打悬浮细胞在剩余
的上清液中；取 100 μL 菌液涂布于 LB 固体培养基
（含 100 μg·mL-1 氨苄青霉素）上，涂匀后，室温下
正面向上放置 0.5 h，待菌液完全被吸收后，将平板
PCR 扩增程序：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性
1 min，36 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，40 个循环，
72 ℃延伸 8 min。
PCR 扩增产物用 1.5% 琼脂糖凝胶检测，80 V
电压下电泳 1 h，在紫外光灯下观察，并用凝胶电泳
图像分析系统 SYNGENE 拍照并分析。
1.2.4　数据分析　于 SYNGENE 凝胶成像系统上
拍照后进行读带，以 D 2 000 为标准分子量，按同
一引物扩增的同一位置上电泳迁移率一致的条带
进行统计，有带（强带与弱带）记为“1”，无带记为
“0”，得到“0/1”二元数据矩阵，计算引物扩增的多
态性条带及多态性百分率，利用 NTSYS-pc 软件对
数据进行分析，计算遗传相似系数，按非加权组平
均（unweighted pair-group method arithmetic mean，
UPGMA）方法进行聚类分析，构建亲缘关系树状聚
类图。
1.2.5　特征性条带的筛选　根据不同引物 PCR 扩
增的电泳图谱中筛选出具有特异性条带并且稳定扩
增的引物，切胶并采用天根生化科技有限公司生产
的琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒进行回收纯化特征
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倒置 37 ℃温箱里过夜培养。
1.2.7　重组质粒的鉴定及特异片段核苷酸序列测
定　转化大肠杆菌 DH5α，在 LB 固体培养基（含有
氨苄青霉素）上进行筛选，用接菌针挑取 1 个单克
隆菌落于 2 mL LB 液体培养基（含 100 μg·mL-1 氨
苄青霉素）的试管中（分别各挑取 4 个单克隆菌），
37 ℃、250 r·min-1 下，摇床振荡培养过夜，用于质粒
的 DNA 提取。采用天根生化科技有限公司生产的
TIANprep Mini Plasmid Kit 质粒小提试剂盒提取质
粒 DNA，以质粒 DNA 为模板，用测序序列对 T7/SP6
对筛选出的６条 RAPD 特异性片段切胶、回收和克
隆后，经测序通用引物对 T7/SP6
（T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’；
SP6：5’-ATTTAGGTGACACTATAG-3’）
进行初步筛选，将筛选获得的阳性质粒进行测
序，以获得特异性片段的序列。
2　结果与分析
2.1　RAPD 扩增结果
120 条 RAPD 引物，经过多次 PCR 扩增，筛选
出具有多态性、可重复、条带清晰的引物共 12 条，引
物序列详见表 2。对 12 条引物扩增结果进行数据
统计分析，12 条引物共扩增出 111 条带，其中多态
性条带 107 条，多态性百分率为 96.40%，条带主要
集中于 250~1 500 bp 之间，平均每个引物扩增 9.25
条带。扩增条带数最多的引物是 D-20，扩增条带为
13 条；最少的引物是 F-7，扩增条带为 6 条；说明人
参、西洋参、三七采用随机引物扩增的谱带丰富，具
有丰富的多态位点，遗传多样性十分丰富，可以很好
地揭示人参、西洋参、三七三者的种间亲缘关系。
表 2　引物及其序列
Tab. 2　List of primers and their sequences
引物
（primer）
序列（sequence）
（5’~3’）
引物
（primer）
序列（sequence）
（5’~3’）
A-12
B-05
C-07
C-12
C-20
D-14
TCGGCGATAG
TGCGCCCTTC
GTCCCGACGA
TGTCATCCCC
ACTTCGCCAC
CTTCCCCAAG
D-20
E-04
E-05
F-01
F-07
F-08
ACCCGGTCAC
GTGACATGCC
TCAGGGAGGT
ACGGATCCTG
CCGATATCCC
GGGATATCGG
2.2　亲缘关系分析
采用 UPGMA 法进行聚类分析，构建了人参属 3
种药材的聚类分析图（图 1）。从图中可以直观地反映
出人参、西洋参和三七三者种间的亲缘关系，人参与西
洋参的种间亲缘关系最近，聚为一类，而三七相对其他
2 种的亲缘关系较远，单独聚为一类；虽然种内都有一
定程度的变异，但种间变异仍大于种内变异。
图 1　RAPD 标记聚类树状分析图
Fig. 1　Clustering analysis diagram based on RAPD marker
2.3　特征性条带的筛选
不同引物 PCR 扩增产物中，在某一位点处，仅
个别种出现稳定、清晰的特异性条带，且其他种扩增
不出现该条带，则可认为此条带是该种的分子鉴定
标记。根据不同引物的 PCR 扩增的电泳图谱中筛
选出６条扩增具有特异性条带的引物：引物 A-12，
引物 B-05，引物 C-07，引物 C-12，引物 F-07，引物
F-08。引物 F-07 和 C-12 可区分人参与西洋参、
三七的种间差异；引物 B-05 和 A-12 可区分三七；
引物 C-07 和 F-08 可区分西洋参。以引物 C-12 和
F-07 的扩增结果为例，其扩增结果如图 2、3 所示，
人参在 600 bp 和 488 bp 处有特异性标记，而西洋参
和三七则无此条带。
M. 凝胶电泳 DNA 分子标记（Marker D 2 000），从上至下依次为（from
top to bottom）：2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp
1~5. 人参样品（P. ginseng）　6~10. 西洋参样品（P. quinquefolium）
11~15. 三七样品（P. notoginseng）　16. 空白对照（blank）
图 2　引物 C-12 扩增的电泳检测
Fig. 2　Electrophoresis of primer C-12 PCR
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M. 凝胶电泳 DNA 分子标记（Marker D 2 000），从上至下依次为（from
top to bottom）：2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp
1~6. 人参样品（P. ginseng）　7~11. 西洋参样品（P. quinquefolium）
12~15. 三七样品（P. notoginseng）　16. 空白对照（blank）
图 3　引物 F-07 扩增的电泳检测
Fig. 3　Electrophoresis of primer F-07 PCR
2.4　特征性条带的电泳鉴定
将筛选出的６条 RAPD 特异性片段进行切胶、
回收纯化，以已纯化的特征性 DNA 片段为模板，以
筛选的特征性引物进行二次 PCR 扩增，对扩增产物
进行电泳鉴定（如图 4 所示）。其中泳道 1、2 分别
为使用引物 F-07、C-12 从人参基因组 DNA 扩增获
得的特异性片段；泳道 3、4 分别为使用引物 C-07、
F-08 从西洋参基因组 DNA 扩增获得的特异性片
段；泳道 5、6 分别为使用引物 B-05、A-12 从三七
基因组 DNA 扩增获得的特异性片段。
2.5　特异片段测序结果与分析
对筛选出的６条 RAPD 特异性片段切胶、回收
和克隆后，使用通用引物对 T7/SP6 进行 PCR 筛选，
鉴定结果如图 5 所示。图中 1~4 均为三七特异性
M. 凝胶电泳 DNA 分子标记（Marker D 2 000），从上至下依次为（from
top to bottom）：2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp
1、2. 人 参 特 异 性 片 段 F-07、C-12（specific fragment from P.ginseng
F-07 and C-12）　3、4. 西洋特异性片段 C-07、F-08（specific fragment
from P.quinquefolium C-07 and F-08）　5、6. 三七特异性片段 B-05、
A-12（specific fragment from P.notoginseng B-05 and A-12）
图 4　RAPD 特异片段电泳检测
Fig. 4　Electrophoresis of RAPD specific fragment
M. 凝胶电泳 DNA 分子标记（Marker D 2 000），从上至下依次为（from
top to bottom）：2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp
1~4、5~8、9~12、13~16、17~20 和 21~24 分 别 为 引 物 A-12、B-05、
C-07、C-12、F-07 和 F-08 的 4 个不同克隆（1~4，5~8，9~12，13~16，
17~20，21~24 represent four different colonies from primer A-12，B-05，
C-07，C-12，F-07，F-08，respectively）　25. 空白对照（blank）
图 5　质粒 DNA PCR 鉴定结果
Fig. 5　PCR identification of plasmid DNA
片段 A-12 的候选克隆，其中 3、4 为阳性克隆；
5~8 皆为三七特异性片段 B-05 的候选克隆，其中
5、7、8 为阳性克隆；9~12 均是西洋参特异性片段
C-07 的候选克隆，其中 12 号为阳性克隆；13~16 皆
是引物人参特异性片段 C-12 克隆；17~20 为人参
特异性片段 F-07 的候选克隆，只有 17 号为阴性；
21~24 为待鉴定的西洋参特异性片段 F-08 克隆，除
24 号为阴性外，其他均为阳性克隆。
将鉴定的已插入目的片段的重组质粒 DNA 送
去测序获得其 DNA 序列，通过序列比对验证了测
定序列的起始端 10 个碱基和末端 10 个碱基（为该
随机引物的反向结合位点）均为其相对应引物的序
列，证实克隆所得的片段为来自相应随机引物的扩
增产物。以特异片段 C-12 的测序结果为例，其序
列见图 6。
图 6　RAPD 特异片段 C-12 测序结果
Fig. 6　The sequence of RAPD specific fragment C-12
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Chinese
3　讨论
3.1　人参、西洋参与三七的亲缘关系
有文献认为，PCR 反应的温度、时间、反应体系
中各试剂的浓度等会影响 RAPD 技术的的稳定性和
重复性，导致科研人员对 RAPD 技术的可行性和可
靠性产生了疑问。本研究采用 RAPD 技术探讨人
参属三者之间的遗传距离和亲缘关系，部分引物扩
增图谱不仅带形丰富，而且差异明显，其聚类分析结
果表明，人参、西洋参和三七可以明显地区分，人参
与西洋参的种间亲缘关系最近，聚为一类，而三七相
对其他 2 种的亲缘关系较远，单独聚为一类。本研
究与前期 Shaw 等［10］的类似研究相比，采用了不同
的、数量达到 120 条的引物以及更多的样本量，两者
的研究结果一致，同时也与陈士林等［13］采用 DNA
条形码技术所得的结论也相一致。这表明，运用
RAPD 技术开展遗传多样性、种群遗传、数量遗传等
领域的研究结果是可靠的，也是可以重复的。
3.2　RAPD 技术可用于人参属药材的鉴别
RAPD 技术不仅可用于探讨人参属 3 种药材之
间的遗传距离和亲缘关系，还可从分子水平检测各品
种的差异，用于它们之间的真伪鉴别。如用引物 F-07
和 C-12 可区分人参与西洋参、三七的差异；引物 C-07
和 F-08 可区分西洋参；引物 B-05 和 A-12 可区分
三七。参照张南平等［14］的中药 DNA 分子鉴别标准研
究方法，扩大样本量，充分收集具有代表性的样品及其
伪品、近缘种以及其它中药材，把 RAPD 显性标记转化
为更稳定的序列特征化扩增区（sequence characterized
amplified region，SCAR）分子标记。本研究已将筛选
出的显性标记的特异性条带进行切胶回收、克隆并测
序获得其 DNA 序列，在后续工作中将设计用于鉴别人
参、西洋参或三七的特异性 PCR 引物，实现理论研究
向药品检验实际运用的转变。
参考文献
［1］ 　 中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志．第 54 卷
［M］．北京：科学出版社，1999：17
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（本文于 2015 年 3 月 25 日收到）