全 文 ：研究简报
RAPD技术在龙须菜
遗传多样性研究中的应用
Ⅰ 　总 DNA的提取及 RAPD反应条件的优化
李向峰　隋正红　张学成
(青岛海洋大学海洋生命学院 ,青岛 , 266003)
摘　要　比较两种从龙须菜中提取总 DNA的方法 ,这两种方法得到的染色体 DN A具有较好的完
整性 ,从 DN A的产量、蛋白质含量等指标可以看出 , CT AB法优于蛋白酶 K法。 实验对龙须菜
RAPD反应条件进行了优化: 在 25μL反应体系中 ,含有 Mg2+ 2. 5m mo l /L , dN TP100μmo l /L ,总
DN A 25ng ,引物 0. 2μmol /L和 Taq酶 1U ,经 94℃变性 1min, 35℃退火 1min, 72℃延伸 2min, 35
个循环 ,得到稳定的 RAPD扩增图谱。
关键词　龙须菜 ; 蛋白酶 K; 十六烷基三甲基溴化铵法 ( CTAB) ; 脱氧核糖核酸 ( DN A) ; 随机扩
增多态性 DNA( RAPD )
中图法分类号　 Q943; S644. 6+ ⑦
龙须菜是具有重要经济意义的红藻 ,除了在养殖方面的应用外 ,还广泛应用于生理 ,生化
和遗传学研究 [1 ] [2 ]。 RAPD技术 ( Random amplified polymo rphic DN As)称随机扩增 DNA多
态性分析 ,是 1990年由 Willams和 Welsh发明的基于 PCR原理的单引物扩增反应 [ 3] ,它能迅
速、有效地进行 DNA多态性检测 ,已广泛应用于基因组研究中。 但 RAPD技术在江蓠属海藻
中进行遗传多样性的研究尚未见报道。总 DNA提取是 RAPD技术关键的第一步 ,核酸样品的
质量直接关系到实验的成败。 虽然总 DNA的提取方法多种多样 ,但在实际操作中 ,我们发现
不同材料用不同方法提取的 DNA,从质量、数量上相差较大 ,国外也有人报道 [4 ] [5 ]。因此 ,我们
比较了蛋白酶 K法和十六烷基三甲基溴化铵法 ( Cetyl trimethyl ammonium bromide, CT AB)
法两种方法从龙须菜中提取 DNA的效果 ,并对龙须菜的 RAPD反应条件进行了优化。
1　材料和方法
1. 1材料
1. 1. 1野生型龙须菜 (Gracilaria lemaneiformis ) ,采自青岛湛山湾。
第 28卷　第 2期
1998年 4月　　
青 岛 海 洋 大 学 学 报
JOU RN AL OF OCEAN UNIVERSITY OF QIN GDAO
Vol. 28, No. 2
Apri l, 1998
国家“攀登计划 B”项目 ( PDB6- 4- 3)及曾呈奎海洋科学发展基金项目资助
收稿日期: 1997-04-08; 修订日期: 1997-11-04
李向峰 ,男 , 1971年 5月出生 ,硕士。
1. 1. 2 RAPD反应体系中引物 ,由上海生物工程中心合成 ,药品购自华美生物工程公司。
1. 2材料的处理　将样品用海水冲洗 ,刷去污物 ,用稀释的海水冲洗 2次 ,再用蒸馏水冲洗 1
次 ,切 5mm长的茎尖在阴凉处凉干。
1. 3总 DNA提取方法　蛋白酶 K法 [6 ]和 CTAB法 [7 ]
1. 4 RAPD反应体系　采用 25μL反应体系 ,其中含 MgCl22. 5m mo l /L, dN TP( dAT P、 d TT P、
dCTP、 dGT P)各 100μmol /L,总 DNA25ng,引物 0. 2μmol /L和 Taq DN A聚合酶 1U, DN A
扩增用稍加改造的中科院遗传所 90AD PCR扩增仪进行 ( 36℃复性槽外接恒温水浴锅 )。
RAPD反应过程包括 35个循环 ,每个循环包括在 94℃变性 1min, 35℃退火 1min, 72℃延伸
2min。 首次循环前于 94℃预变性 10min,最后一次循环于 72℃延伸 10min。
2　结果
2. 1总 DNA提取
2. 1. 1蛋白酶 K法和 CT AB法的比较
2. 1. 1. 1 DN A完整性　用蛋白酶 K法和 CTAB法提取的总 DNA经琼脂糖凝胶电泳情况看 ,
这两种方法得到的染色体 DNA均有较好的完整性。 但蛋白酶 K法提取的染色体 DNA有拖
带现象 ,而 CT AB法带型整齐 (图 1)。
2. 1. 1. 2 DN A不同提取方法产物质量的比较　蛋白酶 K法和 CT AB法提取 DNA测定数据
见表 1,我们比较了从 9株雄性藻体中提取的 DNA。由表 1可见 ,蛋白酶 K法提取的 DNA含
量平均为 30. 05μg /g (湿重 ) , C TAB法提取的 DNA含量平均为 37. 81μg /g (湿重 ) ;蛋白酶 K
法提取的 DNA中蛋白质浓度平均为 9. 46mg /g , CT AB法提取的 DNA中蛋白质浓度平均为
3. 31mg /g;蛋白酶 K法提取的 DNA的 A260 /280值平均为 1. 22, CTAB法提取的 DNA的
A260 /280值平均为 1. 90。表明蛋白酶 K法的 DNA得率比 CT AB法的低 ,蛋白质含量较高 , DN A
纯度低。对 DNA样品进行了 RAPD- PCR反应 ,蛋白酶 K法提取的样品 9个中有 3个未得到
扩增 ,而 CTAB法提取的 9个样品均得到扩增。
表 1　用 CTAB和蛋白酶 K法从龙须菜中提取的 DN A性质的比较
Table 1　 Comparison of DNA ex tr acted by CT AB and protein-K methods
方　法
M ethod
C TAB法
CT AB m ethod
蛋白酶 K法
Protein-K methods
样　品
Material
A260/280
DNA
(μg /g 湿重 )
DN A (μg /g)
蛋白质
( mg /g湿重 )
Protein
(mg /g)
RAPD
反应结果
Resul t of
RAPD
A260/280
DNA
(μg /g 湿重 )
DN A (μg /g)
蛋白质
( mg /g湿重 )
Protein
(mg /g)
RAPD
反应结果
Resul t of
RAPD
1 1. 75 32. 83 3. 75 √ 1. 00 26. 60 11. 85 ×
2 1. 92 44. 32 2. 70 √ 1. 21 35. 90 14. 72 ×
3 1. 85 53. 10 7. 05 √ 1. 37 38. 28 10. 87 √
4 1. 72 12. 46 3. 00 √ 1. 15 10. 59 3. 55 √
5 1. 92 34. 97 4. 70 √ 1. 34 27. 28 7. 82 ×
6 2. 07 37. 42 0. 00 √ 1. 11 28. 86 9. 99 √
7 2. 01 46. 98 2. 58 √ 1. 35 42. 60 9. 55 √
8 1. 94 43. 07 2. 70 √ 1. 26 33. 30 8. 14 √
9 1. 90 35. 17 3. 30 √ 1. 21 27. 00 8. 65 √
x±σ 1. 90± 0. 1137. 81± 11. 57 3. 31± 1. 89 1. 22± 0. 12 30. 05± 9. 21 9. 46± 3. 08
294 青　岛　海　洋　大　学　学　报 1 9 9 8年
2. 1. 2 CT AB法中 β -巯基乙醇对 DNA的影响　 CT AB法提取 DNA时 ,在 DNA的提取过程
中 β -巯基乙醇的存在与否对 DNA的产量几乎没有什么影响。但用不含 β -巯基乙醇的抽提液
提取的 DNA,经琼脂糖凝胶电泳变得模糊 (图 2)。
2. 2 RAPD条件的优化　对于不同的生物材料 ,不同的实验室 ,有不同的 RAPD条件 ,尤其是
在有关研究不太多的龙须菜中 ,更需 RAPD条件的优化。
2. 2. 1 Mg
2+ 浓度　 Mg2+ 浓度在 1. 0～ 3. 0m mol /L之间均扩增出相同的带谱 , 2. 5～ 3. 0m
mol /L条件下效果最好。浓度降低则酶的活性降低 ,扩增的带数目少 ,弱而且不清 , ;浓度高于
3. 0m mo l /L时则带谱明显改变失真 (图 3)。
2. 2. 2引物　引物浓度在 0. 1～ 0. 2μmol /L时 ,所扩增带型清晰可辨 ,有相同的带谱 ,引物浓
度达到 0. 2μmol /L以上时 ,虽带数目增加 ,但带型开始变的模糊不清不易辨认 (图 4)。
2. 2. 3模板 DNA　模板 DNA的含量在 20～ 30ng时得到最佳带型 , 30ng以上时 ,条带模糊带
谱不再出现 (图 5) ,我们在实验中用的是 25ng。
2. 2. 4循环次数　当 PCR循环数少于 30时 , DN A不能得到充分的扩增 ,扩增带少而模糊 ,循
环数超过 40时 ,扩增产物也不再增加 , 35个循环已得到足够清晰的带型 (图 6)。
据此我们建立了在龙须菜中进行 RAPD的反应条件 (见材料和方法 1. 4)
3　讨论
DNA的完整性对于 RAPD非常重要 ,当模板 DNA的平均长度大于 20kb时 ,即可符合
PCR扩增反应的要求 [8 ]。 本实验中 ,蛋白酶 K法和 CT AB法得到的染色体 DNA均有较好的
完整性 ,估计染色体条带约在 20kb以上 (图 1)。蛋白酶 K法提取总 DNA,有几项指标 ,如
DNA产量 , RAPD成功率却不如 CTAB法 , 比较纯的 DNA A260 /280比值在 1. 8～ 2. 0之间 ,
CT AB法的 DNA A260 /280值为 1. 89,而蛋白酶 K法的 DNA A260 /280值仅为 1. 24,说明前者蛋白
质含量少。 有报道说 RNA的存在并不影响 RAPD,而蛋白质的存在却有抑制作用 [5 ] ,因此从
A260 /280指标来看 , CT AB法更适合于 RAPD。 我们对 DNA样品进行了 RAPD- PCR反应 ,
CT AB法提取的 DNA的扩增成功率明显高于蛋白酶 K法 ,也证实了这一点 ,在 CT AB法中
加入 β-巯基乙醇可防止 DNA的降解 [5 ]。
在 DNA提取过程中可能夹杂多糖、鞣酸、多酚等 ,这些物质会干扰 RAPD反应的进行。藻
类比陆生植物含有更多的多糖且更不易去除。 在提取过程中 55～ 60℃温浴 ,可大大减少碳水
化合物的含量 [5 ]。 CT AB法中便有这一步骤 , C TAB可选择性地结合肽聚糖和蛋白质 ,由于该
法能去除藻类多糖 ,并能有效地降低蛋白质含量 ,因此适合用于藻类这样细胞中多糖含量高的
生物的 RAPD操作 [9 ]。
从图 1中可见 , CTAB法中除染色体条带外 ,在约 800bp以下有两条带 ,估计是质粒 ,从对
龙须菜不同品系扩增情况看 ,大多数产物在 800bp以上 ,不会是它们的产物 ,少数低于 800bp
的产物或许是由该质粒扩增而来。假若质粒序列与基因组序列相似 ,则由于基因组大 ,两者竞
争的结果必然是总 DNA占优势 ;若两者差别较大 ,则因为我们合成的引物是针对藻类
的 [4, 5, 6, 7, 9 ] ,更没必要担心质粒 ( 800bp)带会造成影响。
2952期 李向峰 ,等: RAPD技术在龙须菜遗传多样性研究中的应用Ⅰ .
图 1　用两种方法从龙须菜中提取的 DN A电泳图谱
Marker:λDN A /EcoRⅠ + HindⅢ
1、 2、 3、 4、 6、 7是蛋白酶 K法提取的 DN A
5、 8、 9是 C TAB法提取的 DN A
Fig. 1　 Electr opho r esis pho tog raph of DNA
ex tra cted by two methods. Lane: 1, 2, 3, 4, 6, 7DNA
ex tr acted by proteina se-K m eth od.
Lane: 5, 8, 9 DN A ex trac ted by CTAB method.
图 2　 CTAB法中 β -巯基乙醇
对 DN A的影响
Marker: λDN A/ HindⅢ　 1- 2: 不含 β -巯基乙醇
3- 4:含 β -巯基乙醇
Fig. 2　 Effect o f β -mercapto ethanol on DN A
sample ex t racted by CT AB me thod.
Lane 1- 2: without β -mereaptocthanol;
Lane 3- 4: with β -mcreaptocthanol
图 3　 Mg2+ 浓度对 RAPD反应体系的影响
Fig. 3　 Effect o f Mg2+ concentra tion on RAPD amplification of to tal DN As f rom lemaneiformis
Marke r: λDNA / HindⅢ , 1. 0. 5m mo l /L Mg2+ 　 2. 1. 0m mo l /L Mg2+ 　 3. 1. 5m mo l /L Mg2+
4. 2. 0m mol /L Mg2+ 　 5. 2. 5m mol / L Mg2+ 　 6. 3. 0m mol / L Mg2+ 　 7. 3. 5m mo l / L Mg2+
图 4　引物浓度对 RAPD反应的影响
Marker: λDN A/ HindⅢ , 1. 0. 1μmol /L　 2. 0. 2μmo l / L　 3. 0. 3μmo l /L
4. 0. 4μmo l / L　 5. 0. 5μmol /L　 6. 0. 6μmo l / L
Fig. 4　 Effect of primer concentr ation on RAPD amplifica tion o f
to tal DNAs fr om Gracilaria lemaneiformis.
296 青　岛　海　洋　大　学　学　报 1 9 9 8年
图 5　模板 DNA浓度对 RAPD反应的影响
Marker:λDN A /HindⅢ ,　 1. 80ng　 2. 70ng　 3. 60ng
4. 50ng　 5. 40ng　 6. 30ng　 7. 20ng
Fig . 5　 Effect of template DN A concentra tion
on RAPD amplifica tion o f to tal DNAs
fr om Gracilaria lemaneiformis
图 6　 PCR的循环扩增次数对 RAPD
反应体系的影响
Marker:λDN A/ HindⅢ , 1. 25　 2. 30　 3. 35
4. 40　 5. 45　 6. 50
Fig. 6　 Effect o f PCR cycle numbe rs on RAPD
amplification of to tal DN As f rom
Gracilaria lemaneif ormis
虽然 PCR方法已经很完善 ,但对不同物种 ,不同材料 ,甚至不同实验室会有不同的扩增参
数 ,如在 25μL的反应体系中 , Mg2+ 浓度有 1. 5m mo l /L, 2. 0m mo l /L, 2. 5m mol /L, 4m mol /
L;而模板用量可从 5～ 30ng不等 [4, 5, 7, 10, 11 ]。我们的结果说明在龙须菜中 RAPD的各项参数也
有些变化。
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Studies on Application of RAPD to Genetic
Diversity in Gracilar ia Lemaneiformis
Ⅰ . Extraction of DNA and Optimization of RAPD
Li Xiangfeng　 Sui Zhenghong　 Zhang Xuecheng
(College of Marine Lif e Sciences , Ocean University of Qingdao , Qingdao 266003)
Abstract　 Tw o methods of DN A ex traction f rom Gracilaria lemanei formis were com-
pared. The integ rity of chromosomal DN A molecules w as good fo r bo th of the methods.
Samples from CTAB method w ere bet ter than tha t f rom pro teinase-K method in DN A
production and pro tein content. Condi tions o f RAPD-PCR were optimized in the present
paper: RAPD reaction in 25μL reaction vo lumes ( containing 2. 5m mo l /L of M g2+ , 100μ
mol /L of dN TP, 25ng of tota l DN As, 0. 2μmol /L o f primer and 1 unit of Tag DN A
po lymerase) w as perfo rmed smoothly w ith 35 cycles of dena ture 1 min at 94℃ , a nneal-
ing 1 min at 35℃ and elonga tion 2 min at 72℃ , and stable RAPD amplification pat terns
w ere obtained.
Key words　 Gracilaria lemanei formis; pro teinase-K; CTAB; DN A; RAPD
海　洋　人　物
庞塞·德莱昂 , J. ( Juan Ponce de Leó n, 1460～ 1521)　西班牙探险家。 当过阿拉贡王室
宫廷侍从。 1493年参加过哥伦布第二次赴美洲的远航。 1502年到达过西印度群岛。 1508
～ 1509年去波多黎各岛勘察与探险。1513年去寻找传说中的比米尼米尼岛 ,该岛未找到 ,
是年春 ,却意外发现了佛罗里达半岛 ( 1514年被任命为总督 )。同年还去巴哈马群岛探险。
在海洋探险史上 , 1513年庞塞的领航员阿拉米诺斯 ( Alamino s)当航行到佛罗里达海峡
时 ,遇到了使船难以返航的强大海流 ,从而发现了墨西哥湾流。
(刘安国 )
298 青　岛　海　洋　大　学　学　报 1 9 9 8年