全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 30( 2): 191～ 196, 2004
Journal of Zhejiang Un iversity ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2003-06-24
基金项目: 国家自然科学基金 ( 39270060) ; 浙江省自然科学基金资助 ( 397057) .
作者简介: 姜维梅 ( 1970— ) ,女 ,山东龙口人 ,硕士 ,现主要从事植物发育生物学方面的研究 . Tel: 0571-86971373;
E-mai l: wmjiang@ zju. edu. cn.
通讯作者: 丁炳扬 ,男 ,教授 ,从事植物系统学和生物多样性的研究 . Tel: 0571-85913912. E-mail: dingby@ mai l. h z. zj. cn.
文章编号: 1008-9209( 2004) 02-0191-06
国产菱属植物亲缘关系的 RAPD分析
姜维梅 , 丁炳扬
(浙江大学 生物科学系 ,浙江杭州 310029)
摘　要: 利用随机扩增多态性 DNA( RAPD)技术对国产菱属 ( Trapa L. )植物 10个种 16个样品的遗传
变异进行了研究 . 从 50个 10碱基随机引物中筛选出 18个多态性引物用于正式扩增 ,共扩增出 205条
DNA带 ,其中多态性带为 165条 ,占 79. 5% . 根据 DN A扩增结果计算了菱属各种间的 Nei s遗传一致
度和遗传距离 ,并采用 UPGM A构建了聚类树状图 .根据 RAPD分析的聚类结果 ,结合野外观察和形态
学性状的聚类分析我们建议: ( 1)将国产菱属植物划分为 3个种 ,即欧菱 ( T . natans L. )、野菱 ( T . incisa
Sieb. et Zucc. )和细果野菱 ( T. max imowicz ii Korsh. ) ; ( 2)除细果野菱外 ,其余 2个种中果实角的数目
均有从四角转变为二角的 ,所以把角刺数目作为菱属种间划分的主要依据这一点值得商榷 ; ( 3)欧菱、丘
角菱可能是栽培菱的野生种或近缘种 ; ( 4)细果野菱为现存菱属中最原始的种 .
关　键　词: 菱属 ; RAPD分析 ; 遗传变异 ; 种间关系
中图分类号: Q949　　　文献标识码: A
JIAN G Wei-mei, DING Bing-yang (Dept. of Biology Sciences, Zhejiang University , Hangz hou 310029,
China )
Genetic relationship among Trapa species assessed by RAPD markers. Journal o f Zh ejiang Univ er sity
( Ag ric. & Life Sci. ) , 2004, 30( 2): 191-196
Abstract: T o assess the genetic r ela tionship be tween 10 species o f genus Trapa , 16 samples w ere used
fo r RAPD assay. 18 primer s were sc reened f rom the 50 random primer , and a to tal o f 205 DN A bands
were amplified, among which 165( 79. 5% ) we re po lymprphic. Based on the RAPD da ta , Nei s genetic i-
dentity and genetic dia tance among the samples w ere calculated and a dendrog ram w as constr ucted by
using U PGM A s method. Acco rding to the RAPD analysis combined with field observ a tion and the
cluster analysis of mo rpho logical charac ters, w e suggest that Trapa plants in China can be classified in-
to 3 species, namely T . natans L. , T . incisa Sieb. et Zucc. and T . max imowicz ii Korsh. The usual
four-horn cha racte ristic of the fruits in T . natans and T . incisa , but not in T . max imowiczii , can be
changed under certain conditions so a s to assume the shape o f fr uits with only tw o instead o f four
ho rns. Ther efo r e, the reasonableness and reliability o f taking the number o f fr uit ho rns as a c riterion
fo r discrimination betw een differ ent species of Trapa a re open to question. T . natans and T . japoni-
caare a re most probably the wild o r congener species from w hich the cultiv ated Trapa w ere evo lv ed.
The T . max imow iczii is believ ed to be the most o rigina l species of Trapa presently existing.
Key words: Trapa; RAPD analysis; genetic v ariation; r ela tionship among species
　　菱属植物分布于欧、亚、非洲的温带至热带
地区 ,以东亚的种类最为丰富 .由于其独特的形
态结构和生长习性 ,菱属植物在双子叶植物的
系统发育研究中具有重要地位 .
　　林奈在 1753年建立菱属时 ,只有一种 ( T .
natans ) ,随着调查研究的深入 ,不断有新种发
表 ,至今已有近百个种级名称 .随着新的研究方
法和实验技术的改进 ,对菱属植物的认识有了
很大的提高 ,但对菱属植物的种类划分至今仍
有较大的争议 . 如 Vassi ljev认为全世界有 70
余种 [1 ] , Tutin认为只有 1多形种 [2 ] ,而较多学
者持折中观点 ,认为有 30种左右 [ 3, 4] . 因此 ,
Cook在《世界水生植物》修订版中记载菱属为
“具 1多形种或约达 20种” ,就是其分类现状的
反映 [5 ] . 菱属的分类学问题引起许多学者的兴
趣 ,已开展的研究工作主要集中于运用数量分
类学 [6, 7 ]、细胞分类学 [ 8]、花粉形态学 [9 ]以及更
多地应用野外调查和形态分类的方法 [10, 11 ]对
菱属的形态变异和种类划分作过研究 . 万文豪
在《中国植物志》中记载了我国菱属植物有 15
个种和 11个变种 [12 ] ,但由于没有对形态性状
的分类学价值进行深入研究 ,其种类划分依据
在实际应用中遇到很大困难 .
　　近年来 ,随着分子生物学技术的飞速发展 ,
人们已能从遗传物质本身来探讨物种起源与进
化问题 . RAPD标记是建立在 DNA水平上的
分子标记 ,由于其操作相对简单 ,取材不受发育
时期、取样部位和环境条件的影响 ,已被广泛应
用于遗传多样性检测、品种鉴定和亲缘关系的
研究 [13 ] . 笔者采用 RAPD分析手段 ,研究了国
产菱属植物种内的遗传变异和种间的亲缘关
系 ,拟为建立合理的菱属分类系统和种间演化
关系提供理论依据 .
1　材料和方法
1. 1　实验材料
　　供试的 16个菱属居群材料采自全国各地 ,
本处的居群采用地方居群 ( local population)的
概念 [14 ] . 种类鉴定参考了颜素珠 [3 ]和方云
亿 [ 15] . 其名称、来源见表 1,其中四角菱 ( T .
quadrispinosa )、乌菱 ( T . bicornis )供、二角菱
( T. bispinosa )和南湖菱 ( T . acornis ) 4个种为
栽培种 ,其余通常野生 . 供提取 DNA的试材均
来自菱的幼叶 ,经硅胶干燥后置于低温干燥处
保存 . PCR扩增所用引物为 Sangon公司生产
表 1　用于 RAPD分析的菱属材料
Table 1　Materials of Trapa used in RAPD analysi s
编号 中文名 学名 采集地点 凭证标本
1 细果野菱 T .maximowicz ii 安徽 巢湖 Chaohu , B. Y. Ding 6221
2 细果野菱 T . max imowiczi i 浙江 杭州 Hangzh ou, B. Y. Ding 2001
3 南湖菱 T . acornis 浙江 嘉兴 Jiaxing , B. Y. Ding 4906
4 四角菱 T . quadr ispinosa 浙江 嘉兴 Jiaxing , B. Y. Ding 4907
5 四角菱 T . quadr ispinosa 浙江 绍兴 Sh aoxing, B. Y. Ding 2191
6 乌 菱 T . bicornis 云南 大理 Dali , B. Y. Ding 6247
7 二角菱 T .bispinosa 浙江 萧山 Xiaosh an, B. Y. Ding 2202
8 欧 菱 T .natans 江西 永修 Yongxiu , T. Huang 6288
9 欧 菱 T .natans 江西 九江 无
10 丘角菱 T . japonica 江西 永修 Yongxiu , T. Huang 6287
11 丘角菱 T . japonica 江西 九江 无
12 野 菱 T . inci sa 浙江 宁波 Ning bo, B. Y. Ding 6210
13 野 菱 T . inci sa 云南 大理 Dali , B. Y. Ding 6248
14 格 菱 T . p seudoincisa 浙江 宁波 Ning bo, B. Y. Ding 6208
15 格 菱 T . p seudoincisa 山东 微山 Weishan, B. Y. Ding 6346
16 耳 菱 T . potan inii 黑龙江 哈尔滨 Harbin, C. Z. Zh eng 6334
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的十聚体核苷酸 . dN TP、 TaqDNA聚合酶均购
自宝生物技术有限公司 .
1. 2　方　法
1. 2. 1　菱叶片总 DNA提取　　对供试的 16
个样品 ,每个样品取 10个单株 ,混合后采用
CT AB法提取总 DNA.
1. 2. 2　 PCR扩增　　 PCR反应在 PE480型
PCR仪上进行 . 25μL的反应体系中包含 10
mmol /L Tris-HCl( pH8. 3) , 10 mmol /L KCl,
2. 0 mmo l /L MgCl2 , 0. 2 mmol /L dN T P, 0. 4
μmo l /L随机引物 , 1. 2 U TaqDN A聚合酶 , 20
ng模板 . 反应程序为 94℃先变性 4 min, 然后
进行以下 45个循环: 94℃变性 15 s, 38℃退火
30 s, 72℃延伸 75 s,最后于 72℃延伸 7 min.
对扩增产物进行 1. 5%琼脂糖凝胶电泳 .
1. 2. 3　数据分析　　对 DNA条带进行标记 ,
将有带赋值为 1,无带赋值为 0.用 Popgen程序
计算样品之间的 Nei s遗传一致度和遗传距
离 ,按 PHYLIP 3. 5软件包中的 U PGMA方法
进行聚类分析 .
2　结果与分析
2. 1　引物的筛选及 DNA扩增结果
　　用 50个 S系列随机引物分别扩增 4个样
品 ,筛选出 18个扩增条带清晰且多态性好、反
应稳定的引物用于 16个样品的正式扩增 . 18
个引物共扩增出了 205条带 (表 2) ,每个引物
扩增条带 7～ 17条 ,平均为 11条 ,其中样品间
具有多态性的扩增带有 163条 ,占总扩增带数
的 79. 5% . 每一引物检测的 RAPD多态性平
均数为 9. 1. 不同引物得到了各自不同的
RAPD产物图谱 , S37引物的 RAPD产物图谱
如图 1.
表 2　 18个引物的序列及其在 16个样品中的扩增结果
Table 2　 Sequences of 18 primers and thei r ampli fications on 16 samples of Trapa
引物 序列 5 -3 DN A条带数 多态性条带数 引物 序列 5 -3 DN A条带数 多态性条带数
S4 GGACTGGAGT 11 8 S28 G TGACGTAGG 10 9
S7 GG TGACGCAG 13 11 S31 CAATCGCCGT 13 12
S11 GT AGACCCGT 9 8 S34 T CTG TGCTGG 8 5
S14 TCCGCTCTGG 11 10 S37 GACCGCT TGT 12 10
S20 GGACCCTT AC 13 10 S39 CAAACGTCGG 10 7
S21 CAGGCCCT TC 7 4 S43 GT CGCCGTCA 13 10
S23 AGT CAGCCAC 13 7 S45 TGAGCGGACA 17 14
S25 AGGGGTCTT G 12 11 S47 T TGGCACGGG 12 11
S26 GGTCCCTGAG 9 9 S48 GT GTGCCCCA 12 7
数字对应样品参照表 1, M-DN A标准分子量 , 100 bp DNA Ladder plus.
图 1　引物 S37扩增的 RAPD产物图谱
Fig. 1　 RAPD pat tern am plifi ed by primer S37
193　第 2期 　 姜维梅 , 丁炳扬: 国产菱属植物亲缘关系的 RAPD分析 　 　　　　
2. 2　国产菱属植物种间的遗传变异
　　根据 DNA扩增结果 ,利用 Popgen32程序
计算各样品间的 Nei s相似性系数及遗传距离
(表 3) . 利用遗传距离矩阵 ,按 PHY LIP 3. 5
UPGMA方法进行聚类分析 ,建立系统聚类分
析树状图 (图 2) .
表 3　 16个样品之间的 Nei s遗传一致度与遗传距离
Table 3　Matrix of genetic identi ty and gen etic dis tance for 16 Trapa samples based on RAPD
　　注:右上角为遗传一致度 ,左下角为遗传距离 .
图 2　菱属 16个样品的聚类分析图
Fig. 2　 Dend rog rams d erived f rom an UPGM A clus ter analysis for 16 Trapa samples by using N ei s
genetic dis tance based on RAPD mark ers
　　从聚类图可以看出 ,在遗传距离为 0. 289
处可将 16个菱属材料划分成 3组 ,第 1组仅包
括细果野菱 1个种的 2个居群 ,第 2组包括野
菱、格菱和耳菱 3个种的 5个居群 ,第 3组包含
了野生的欧菱、丘角菱 2种的 4个居群和栽培
的四角菱、南湖菱、乌菱、二角菱 4个种的 5个
居群 .
　　聚类结果为我们提供了几点有意义的启
示:①细果野菱 2个居群首先聚合 ,最后再与其
他种聚合 ,表明其是一个区别明显的种 ,在系统
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发育上处于孤立的地位 ;②同一个种的两个居
群并不总是首先聚合 ,如四角菱的一个居群与
二角菱先聚合 ,另一个居群则先与南湖菱聚合 ,
表明传统分类划分的种可能是人为的 ;③无论
是栽培种还是野生种 ,都没有出现与果实角刺
数目相一致的聚类结果 . 如图中的第 3-2组包
括了四角刺的欧菱和二角刺的丘角菱 ,第 3-1
组则包括了四角刺的四角菱、二角刺的二角菱
和乌菱、无角刺的南湖菱 ,说明角刺数在分类上
并没有以往人们认为的那样重要 .
3　讨　论
3. 1　角刺数目的分类学价值
　　在传统分类中通常将菱属植物果实角的数
目作为最重要的种间分类性状 ,常依据角的数
目编制检索表 ,但 RAPD分析结果与形态性状
的数量分类研究均不支持将角的数目作为菱属
种间划分的依据 .野外考察时我们经常发现 ,四
角的欧菱与二角的丘角菱、四角的野菱与二角
的格菱混生在一起 ,它们之间除了角的数目外 ,
其它形态性状几乎没有什么区别 ,甚至两种果
实会同时出现在同一植株上 . 因此角的数目的
减少是平行演化的结果 ,即欧菱→丘角菱、野菱
→耳菱→格菱、四角菱→二角菱和乌菱、四角菱
→南湖菱 ,故菱属角数目不能作为种间划分的
依据 ,而只能作为种下分类群的划分依据 .
3. 2　菱属植物种类划分的依据
　　菱属植物由于形态变异较大 ,不同研究者
所选用的分类性状不同 ,从而导致菱属植物属
下分类系统不能被普遍地接受 .以 Vassiljev为
代表的细分观点会为菱属的分类造成混乱 ,而
Tutin一个复合种的观点则忽视了明显的种间
界限 ,因此选择既稳定又能反映其演化关系的
分类学性状十分重要 . 熊治廷 [16 ]认为菱体型大
小的变异是菱属植物形态演化的主要方面 ,于
丹 [11 ]认为菱属果实的形状、角的数目、果体雕
饰甚至成熟叶的形状、大小和颜色等均可作为
分种的依据 . 胡仁勇 [17 ]认为应以果体大小、果
冠大小和形状、果颈长短及花色为主要分种依
据 ,而将角的数目作为次要分种依据或划分变
种的依据 . 本文所使用的 RAPD分析结果支持
不将角的数目作为分种的主要依据 .
3. 3　欧菱和丘角菱与栽培菱的关系
　　欧菱、丘角菱虽然角的数目不同 ,但在果实
大小、形状、果冠和果颈形态、花色等方面均体
现出二者间的相似性 ,这与胡仁勇通过形态性
状聚类分析的结果相吻合 ,但胡仁勇认为欧菱、
丘角菱与野菱类亲缘关系较近 , Nakano[18 ]认为
欧洲的欧菱与东亚的四角菱非常接近 ,本文的
分析结果支持 Nakano的观点 ,认为这二者与
栽培菱类亲缘关系较近 ,是栽培菱的野生种或
近缘种 .
3. 4　南湖菱的分类地位
　　我们的 RAPD结果的聚类分析表明四角
均退化的南湖菱首先与四角菱而不是与二角菱
聚合 ,表明它是从四角菱选育而来的 .这一研究
为南湖菱的分类地位及其与近缘种亲缘关系的
确定提供了分子水平的证据 . 因为南湖菱的分
类地位和亲缘关系仍有争议 , Nakano[18 ]、颜素
珠 [ 3]、方云亿 [ 15]等认为是独立的种 ;熊治廷 [ 6]将
其降级为乌菱的变种 ,认为是四角菱通过二角
菱演化而来 ;而我们在分子水平上的研究结果
与丁炳扬 [9 ]报道的通过花粉扫描电镜的研究结
果一致 ,也与胡仁勇 [1 7]通过菱属 31个分类学
性状的聚类分析相吻合 .
3. 5　国产菱属植物的类群划分
　　从 RPAD分析的聚类图可以看出 ,角刺数
目相同的种并不是首先聚合 ,而角刺数目不同
其余形态性状没什么差别的种对 (姐妹种 )反而
先聚合在一起 ,例如 T . quadrispinosa与 T . a-
cornis、 T . quadrispinosa 与 T . bispinosa、 T .
natans与 T . japonica、 T . incisa与 T. pseu-
doincisa等 ,似乎表明这些种类的划分是人为
的 .根据聚类结果 ,结合野外观察和形态学性状
的聚类分析 [17 ] ,建议将本文涉及的国产菱属植
物划分为 3个种 , 即: 欧菱 ( T . natans L. )、野
菱 ( T . incisa Sieb. et Zucc. )和细果野菱 ( T .
max imowicz ii Korsh. ) ,前 2个种还可根据果
实大小和角的数目等划分为 2至数个变种 .
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