全 文 ：收稿日期:2008-04-18
基金项目:苏州大学校青年基金(Q3132401)
作者简介:陆叶(1974-), 女 , 黑龙江林甸人 , 在读博士研究
生 ,主要从事中药鉴定方面的研究。 Email:t luye
@suda.edu.cn
野老鹳草 DNA的提取方法及 RAPD分析
陆　叶 ,陈玲玲 ,孙　萌 ,刘春宇
(苏州大学 药学院 ,江苏 苏州 215123)
摘　要　目的:以野老鹳草(GeraniumcarolinianumL.)的茎 、叶为材料 , 研究野老鹳草 DNA的提取方法及 RAPD的
分析。方法:采用 CATB法 、高盐低 pH法和 SDS法分别提取野老鹳草的基因组 DNA, 并对 3种方法进行了一些改
进。通过 RAPD分析所提取的 DNA, 比较所用的提取方法。结果:比较 DNA产量 、质量等 , 确定了高盐低 pH法较
佳。结论:干燥的材料和新鲜的材料均可提取得到 DNA,高盐低 pH法提取的效果优于 CTAB和 SDS法。
关键词　野老鹳草;基因组 DNA;RAPD分析
中图分类号:Q523　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-9690(2009)01-0055-04
TheextractionofTotalDNAfromGeraniumcarolinianumL.
LuYe, ChenLingling, SunMeng, LiuChunyu
(ColegeofPharmacy, SoochowUniversity, Suzhou215123, China)
Abstract　Objective　TostudythemediumforextractionoftotalDNAofGeraniumcarolinianumL..
Methods　TheCTAB(cetyltrimethyleammoniumbromide)method, LowpHmediumwithhighsaltand
SDS(Sodiumdodecylsulfate)methodwereusedtoextractgenomicDNAfromdiferenttissueofGeranium
carolinianumL..TheDNAsamplesobtainedbythemethodPCR.Results　Thediferenceinyield,
qualityofDNAsamplesfromthetwomethodswerecomparedtofindmethodoflowpHwithhighsaltbet-
terthanCTAB.Conclusion　WeobtainedtotalDNAfromfreshanddrymaterialandlowpHmedium
withhighsaltisconsideredtobeafast, inexpensiveandreliabletechniqueamongthethreemethods.
Keywords　GeraniumcarolinianumL.;GenomicDNA;RAPD
　　2005年版中国药典将牻牛儿苗科牻牛儿苗及
老鹳草属植物老鹳草及野老鹳草作为药材老鹳草的
正品来源 [ 1] 。性味苦 ,辛 , 平。其主要功效:祛风 ,
活血 ,清热解毒。近年来对老鹳草属植物研究较多
的是化学成分和药理活性等方面。对于老鹳草在分
子方面的鉴别研究未见报道。而老鹳草属植物种类
较多 ,传统鉴别有时难以区分 。我们以牻牛儿苗科
老鹳草属野老鹳草作为研究对象 ,以冰冻的老叶 、嫩
叶 、茎以及干燥的老叶 、嫩叶 、茎等作为 DNA提取材
料 ,分别采用 CTAB法(溴化十六烷基三甲基铵)、
高盐低 pH法和 SDS法(十二烷基硫酸钠)提取其总
的基因组 DNA,以期从中筛选出提取高纯度 、高产
率 DNA的方法 ,并初步进行 RAPD(随机扩增多态
性 DNA)分析。随着 RAPD技术应用的广泛 ,许多
研究人员发现 , RAPD分子标记技术并非像理论上
所想的那么 “简单易行”。许多植物体内含物(如单
宁 、酚类及色素类物质)直接会影响 Taq-DNA聚合
酶的活性 ,导致扩增反应的失败[ 2-3] 。故高质量的
DNA的提取是决定 RAPD技术成功的关键 ,通过我
们的研究希望为以后进一步研究老鹳草属植物种间
的亲缘关系以及对于药材老鹳草的鉴别奠定重要的
基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
—55—
第 28卷第 1期
2009年 2月 　　　　　　　　　　　　　 中 国 野 生 植 物 资 源ChineseWildPlantResources　　　　　　　　　　 　Vol.28 No.1Feb.2009
1.1.1　实验材料
2008年 4月 26号于苏州大学独墅湖校区附近
的路边采集野老鹳草的嫩叶 ,老叶 ,茎 ,然后用 70%
的乙醇擦拭材料的表面 ,自然晾干。取其中一份放
置于 -70℃冰箱中冷冻保存备用 ,另一份放置于变
色硅胶中进行干燥脱水备用。
1.1.2　主要试剂的配制
(1)CTAB提取缓冲液:取 50 mL的 1 mol/L
Tris(pH8.0)(在 250 mL的双蒸水中溶解 30.285 g
Tris)溶液 ,加入 20 mL的 0.5 mol/LEDTA(pH8.0)
(在 250 mL的双蒸水中溶解 46.53 gEDTA)溶液 ,
依次加入 400 mL的双蒸水 , 40.908 gNaCl, 10 g
PVP, 10 g的 CTAB,在磁力搅拌器上剧烈搅拌 ,用氢
氧化钠(NaOH)调节溶液的 pH值至 8.0然后定容
至 500 mL,分装后高压灭菌。
(2)高盐低 pH提取液:400 mL双蒸水中依次
加入 14.61 gNaCl, 4.1015 gNaAc, 0.5 mol/LEDTA
50 mL, 10 gPVP, 7 gSDS,然后用磁力搅拌器进行搅
拌 ,用盐酸调节 pH至 5.5定容至 500 mL,分装后高
压灭菌 。
(3)SDS提取液:①100 mmol/LTris.Cl(pH
8.0), 50 mmol/LEDTA(pH 8.0), 500 mmol/L
NaCl, PVP少量。 ② 20%SDS(W/V)③ 5 mol/L
NaAc溶液(pH4.8)。
1.2　方法
1.2.1　CTAB法[ 4]
取 1 000 μL的 CTAB提取液于 1.5 mL的离心
管中 ,于 65℃水浴预热。称取材料 100 mg左右 ,加
入少许 PVP共研 ,研成细粉状 (新鲜材料则成泥
状),将研碎的组织移入提取液中 ,混匀 ,于 65℃水
浴 50 min,其间不断颠倒混匀溶液。加入 450 μL氯
仿 +异戊醇(241), 轻缓颠倒混匀溶液。 12 000 r/
min离心 2 min,分相后将上清液移至干净的离心管
中 ,再用 450 μL12 000 r/min下离心 5 min,弃去上
清液 ,再加入 100μL70%乙醇洗涤沉淀 , 12 000 r/
min离心 5 min,弃去上清液 。除去残留的乙醇 ,待
沉淀自然干燥后 ,将 DNA沉淀溶于 100 μL的 TE缓
冲液中 。于 -20℃保存备用 。
1.2.2　高盐低 pH法 [ 5]
取 750 μL提取液于 1.5 mL的离心管中。称取
100 mg左右的材料 ,加入少量的 PVP共同研磨 ,成
粉状(干燥材料)或者细泥状(新鲜材料)转至装有
提取液的离心管中 , 混匀 , 置于 65℃水浴保温
40 min,其间不断混匀。 12 000 r/min离心 10 min,
弃去沉淀 。将上清液移置干净的离心管中 ,加入等
体积的 2.5 mol/LNaAc(pH4.8)溶液混匀 , 0℃放
置 30 min沉淀蛋白质 , 12 000 r/min离心 2 min。
弃去沉淀 ,加入 2/3体积的氯仿 +异戊醇(24∶1),颠
倒混匀后 , 12 000 r/min离心 2 min,再用 2/3体积的
氯仿 +异戊醇抽提离心 1次。将上清液转于干净的
离心管中 ,然后加入 2/3体积的无水乙醇 ,颠倒混匀
几次于 -20℃冰箱中放置 60 min,沉淀核酸 ,室温下
8 000 r/min条件下离心 5 min,弃去溶液 ,并用 70%
的乙醇洗涤沉淀 2次 。室温自然挥干 , 取 100 μL
TE溶解沉淀 , -20℃保存备用。
1.2.3　SDS法 [ 6]
称取 100 mg左右的材料 ,加入少量的 PVP共
同研磨 ,成粉状(干燥材料)或者细泥状(新鲜材料)
转至装有提取液 900 μL的离心管中 ,混匀 ,加入
20%的 SDS充分混匀 , 置于 65℃水浴保温 10 ～
15 min,其间不断混匀。加 5 mol/LNaAc(pH4.8)
100 μL充分混匀 , -20℃冰箱中放置 20 min。 4℃
12 000 r/min离心 15min。将上清液移置干净的离
心管中 ,加入等体积的氯仿 +异戊醇 ,轻轻颠倒离心
管数次 , 4℃放 5 min。 4℃ 8 000 r/min离心 10 min。
上清液移置干净的离心管中 ,加 -20℃预冷的异丙
醇混匀 ,放置 30 min。 4℃ 8 000 r/min离心 10 min。
弃上清 ,将沉淀用 70%乙醇洗 2次。自然干燥 ,溶
于 100 μLTE缓冲液中 。 -20℃保存备用。
1.3　DNA质量检测
1.3.1　基因组 DNA电泳检测
取 10 μL基因组 DNA加入适量的上样缓冲液 ,
用 0.5 ×TAE、1%琼脂糖凝胶电泳 ,以 10 V/cm稳
定电压下电泳 20 min左右 ,然后在紫外线透射仪上
观察 ,拍照 。
1.3.2　基因组 DNA浓度测定
DU730核酸蛋白分析仪检测 DNA质量和浓度:
将提取的 DNA用 TE稀释 50倍 ,然后在波长 260 nm
和波长 280 nm下分别测吸光度 。
1.3.3　RAPD分析
—56—
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷
PCR25 μL反应体系:模板 DNAXμL, 引物
(100 μM)(引物序列见表 1)2 μL, 2 ×TaqMaster
Mix12.5 μL,无核酸酶的水 10.5 -XμL,总体积
25 μL。
表 1　随机引物序列及编号
编号 序列(5※ 3)
1 GGGTAACGCC
2 CAGGCCCTTC
3 AATCGGGCTG
4 GTGACGTAGG
5 AGGGGTCTTG
6 CAAACGTCGG
7 TCGGCGATAG
8 CAGCACCCAC
9 ACTCAGCCAC
10 TGCCGAGCTG
　注:随机引物由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR反应条件:94℃预变性 4 min, (94℃变性
50s, 40℃复性 50s, 72℃延伸 2 min共 28个循环)
72℃延伸 10 min, -20℃保存。
3　结果与分析
3.1　不同方法提取的野老鹳草 DNA电泳检测
图 1　样品 1-8(见表 2)基因组 DNA电泳结果
(8未去除 RNA)
3.2　不同方法提取的野老鹳草 DNA纯度及浓度分
析
表 2　样品 DNA的质量和浓度
样品 OD260 /OD280 DNA浓度 /μg·mL-1
1(鲜茎) 2.915 199.55
2(干茎) 4.961 63.3
3(干老叶) 2.168 251.65
4 (鲜老叶) 2.149 2307.4
5 (鲜嫩叶) 2.047 321.05
6 (干嫩叶) 1.993 259.15
7 (鲜嫩叶) 2.154 1567.1
8 (鲜嫩叶) 2.150 83
　注:1-6样品采用 CTAB法提取 , 7采用高盐低 pH法提取 , 8采用
SDS法提取。表中数据为 3次平均值。
3.3　不同方法提取的野老鹳草 DNA的 RAPD分析
4　结　论
(1)由表 2分析得:茎和叶均可以提出基因组
DNA,新鲜嫩叶样品提取的基因组 DNA产率明显高
于干燥样品 ,叶提取的基因组 DNA产率高于茎。高
盐低 pH法提取的 DNA产率及质量较 CTAB和 SDS
提取法略好。
—57—
第 1期　　　　　　　　　　　　　陆　叶 ,等:野老鹳草 DNA的提取方法及 RAPD分析　　　　　　　　　　　　　
(2)由图 1可以看出样品 1、5、7、8的 3条条带
较清晰 ,样品 2、6的 DNA条带较淡 ,样品 3、样品 4、
其条带模糊并前有拖尾 ,表明样品中的 DNA有所降
解 。但是在图 3中仍可看到较清晰的扩增条带 ,表
明 DNA有部分降解时 ,对 DNA的 RAPD-PCR扩
增影响不大 。
(3)由图 2可知筛选的 10个随机引物中 ,均对
CTAB法提取的材料能扩增出多于 3条条带并较清
晰 。其中 1、2、8号引物较好 ,再分别用这 3个引物
进行对所有样品的 PCR扩增 ,发现 1号引物对所有
样品的 RAPD-PCR扩增的条带多且较清晰 ,表明 1
号引物对于野老鹳草的 RAPD分析较好 ,可用于下
一步种间的多态性分析及亲缘关系研究等 。
(4)对样品的 RAPD扩增的反应体系和反应条
件的优化 ,结果表明适宜的退火温度为 40℃,延伸
时间为 2 min。
5　讨　论
野老鹳草含有鞣质 ,酚类等多种代谢产物 ,这些
代谢产物会影响 DNA提取分离 ,尤其是酚类物质会
与 DNA结合 ,甚至将 DNA的颜色变成棕褐色 。针
对这些问题 ,对这 2种方法进行了适当的改进 ,尽可
能消除这些物质对 DNA提取的影响。例如 ,在植物
的组织进行研磨粉碎时 ,加入 2% ～ 6%(w/v)的聚
乙烯吡咯烷酮(PVP)不仅利于研磨的进行 ,还可以
防止 DNA的氧化 。PVP的浓度必须适量 ,过高会把
DNA变粘稠;增加氯仿 +异戊醇(24∶1)的抽提次
数 ,可以提高除去蛋白质的效果。实验中样品除了
6号其他均是 RNA含量偏高 ,我们也用 RNA酶在
65 ℃消化 20 min去掉 RNA,并对比消化 RNA前后
的 RAPD-PCR扩增结果 ,对扩增没什么影响。
在 PCR反应体系中 ,本实验选择使用了 2 ×Taq
MasterMix试剂(购自南京博尔迪生物科技有限公
司),该体系较好 ,不需要进行优化条件的探索 ,大
大减少时间。在 PCR反应条件的优化中发现当复
性温度为 40 ℃时 ,延伸时间为 2 min时扩增的效果
稳定 。由于 2 ×Taq活性极强故循环数不可超过 28
个。
DNA模板浓度对 RAPD结果的影响 , Devos和
Gale认为在 200 ～ 400 μg/L间获得一致的扩增产
物 , Elsworth等认为模板的最适浓度为 12 ～ 40 mg/
L,汪小全等认为 0.4 ～ 10 mg/L为适宜浓度 [ 7] 。我
们在 4 ～ 40 ng模板量中进行筛选时 ,发现 10 ng模
板量就可以扩增出清晰稳定的条带。
参考文献:
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部)[ M] .广州:广东科技出版社和化学工业出版社 , 2005:80.
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中 国 野 生 植 物 资 源　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷