全 文 ：　 　第 38 卷　第 1 期
1999 年　1月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM
UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
　
Vol.38　No.1
Jan.　1999
　
文章编号:0529-6579 (1999)01-0098-101
陆均松不同居群的 RAPD分析
苏应娟1 , 王　艇1 , 黄　超2 , 朱建明1 , 周　勤1
(1中山大学生命科学学院 , 广州 510275;2湖北中医学院中药系)
摘　要:采用 RAPD技术分析了海南吊罗山产陆均松 9 个个体的遗传多样性.10个引物共检
测了 69 个位点 , 其中多态位点 23 , 占 33.30%.陆均松的个体间遗传距离平均值为 0.106 1 ,
与罗汉松相比 , 陆均松的遗传多样性丰富 , 推测过度砍伐是造成陆均松渐危的原因.
关键词:陆均松 , 不同居群 , RAPD分析
分类号:Q 949.662 , Q 7　　文献标识码:A
陆均松属 (Dacydium)是罗汉松科 (Podocarpaceae)的一个重要属 , 约 20个种 , 分布
于热带地区 , 多产南半球.我国仅有陆均松 (D.pierrei)1种 , 产海南省五指山 、吊罗山 、
尖峰岭等中低山上部海拔 500 ～ 1 600 m 地带 , 是常绿季雨林中的主要森林树种[ 1] .
RAPD技术提供了简便 、 快速分析生物体遗传多样性的途径.现已逐渐发展成为解决
属或属下水平动植物的分类 、 进化和遗传多样性问题的有力工具.本文通过对分布在海南
省吊罗山的陆均松进行遗传多样性的 RAPD分析 , 以期为进一步保护利用陆均松提供进化
分子遗传学依据.
1　材料与方法
1.1　材　料
陆均松 (D.pierrei)各个体均采自海南省吊罗山中 , 编号为 01 ～ 09 , 采摘地海拔高度
分别为650 , 750 , 500 , 730 , 1 300 , 1 250 , 530 , 1 000和 1 200 m.
1.2　主要试剂
10 mer寡核苷酸随机引物购自 Operon公司 (C组 、G 组 、 E组).RAPD试剂盒购自北
京通康生物技术有限责任公司.相对分子质量标记购自中山大学生物工程研究中心真核分
子生物学实验室.其余均为国产AR级试剂.
1.3　DNA的提取与浓度 、纯度检测
取0.5 g 植物新鲜叶片 , 在液氮中迅速研磨成粉末 , 分装于 4 个 1.5 mL 的 Eppendorf
管中 , 每管加 1 mL -20 ℃丙酮轻轻振荡1 min.5 000 r/min离心 10 min , 弃上清 , 重复一
基金项目:国家自然科学基金 (39500013 , 39700117);广东省自然科学基金 (950099 , 970176)
收稿日期:1998-10-15　　第一作者简介:苏应娟 , 女 , 33 岁 , 副教授
次.每管加入 60 ℃预热CTAB提取液 1mL , 充分混匀 , 60 ℃保温4 h.500μL氯仿∶异戊
醇(φ(氯仿)∶φ(异戊醇)=24∶1)抽提10 min , 13 000 r/min离心 10 min , 重复一次.取水
相 , 加入 2/3体积冷异丙醇 , 轻轻混合 , 可见絮状沉淀 , 2 000 ～ 3 000 r/min 离心 3 min ,
弃上清液取沉淀.每管加入 800 μL 清洗液 , 室温下作用 20 min , 1 000 r/min离心 10 min ,
弃上清 , 自然凉干.用 70μL TE溶解.w为 1.0%琼脂糖凝胶 (加溴乙锭至 0.5 μg/mL),
100 V稳压电泳 , 紫外灯下观察照相.752型分光光度计上 , 波长 260 和 280 nm 处测定吸
光度值 (A), 根据 A260/A280比值判断 DNA样品的纯度 , 由 A260的值估算浓度.
1.4　RAPD分析
扩增反应在 ERICOMP 公司 PCR仪上进行.反应体积 25 μL , 包括 H2O 16.5μL , PCR
缓冲液2.5 μL , dNTP 1μL , 引物 1 μL , 模板 2μL (50 ～ 160 μg), Taq 酶 2 μL (2.5×10-8
mol/ s), 反应混合物用 20μL石蜡油覆盖.扩增条件:95 ℃预变性200 s;94 ℃变性1 min ,
36 ℃复性 1 min , 72 ℃延伸2 min , 40个循环;72 ℃延伸 10 min.每次扩增反应均设置不
含DNA模板的空白对照.RAPD产物经 ρ为 1.4%琼脂糖凝胶电泳(加溴乙锭至 0.5 μg/
mL)分离 , 于紫外灯下观察照相.
1.5　数据处理
任意 2个样本间的遗传距离(D), D =1-F , F =2NXY/(NX+NY).其中 , NX 、NY 分别
是样本X和样本 Y扩增出的 DNA片段总数 , NXY是样本 X和样本 Y共有的 DNA 片段数.
根据遗传距离采用 UPGMA法进行聚类分析 , 构建树系图.
2　结果与讨论
2.1　陆均松总 DNA的提取
裸子植物由于其叶片中富含酚类 、 萜类 、多糖类化合物和一些特殊成分 , 按照常规的
DNA提取方法就很难制备到符合实验要求的 DNA样品.CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)
法是 80年代后期建立起来 , 现已被普遍采用的植物总DNA提取方法.但是在用该法提取
陆均松属植物 DNA时没有得到满意结果.在用异丙醇或乙醇沉淀 DNA时总是伴有大量粘
性物质析出 , 这类物质不仅干扰 DNA的溶解 , 而且在电泳时能阻滞 DNA 使其无法走出点
样孔 , 这样的DNA样品根本无法用于 RAPD分析.有报道指出在提取银杉(Cathaya argyro-
phylla)和欧洲云杉(Picea abies)的DNA时遇到同样的情况 , 提出对于有些物种 , 特别是裸
子植物 , CTAB法是失败的[ 2] .另外 , 采用 Edwards等[ 3]的方法及高盐低 pH 法[ 2]也未能制
备到理想的陆均松植物 DNA.
而用液氮将陆均松植物研磨成粉后 , 先用丙酮对粉末进行抽提 , 可以有效地去除粘性
物质对 DNA提取的干扰 , 随后再用 CTAB法提取 DNA可获得满意结果.DNA 清晰成带 ,
对应于23千碱基对片段附近.每 g 新鲜叶片可提取到 DNA 123 μg.作 RAPD分析时 , 一
次扩增反应所需的 DNA模板用量仅为 25 ～ 100 ng.所以采用本方法制备 DNA 样品只需mg
级的植物材料即可满足 RAPD分析的需要.对于一些珍稀物种或只能提供很少实验材料的
物种 , 此方法尤其显得有价值.
2.2　陆均松植物DNA的 RAPD分析
对Operon公司的 3 组 60个引物 (C1-20 , G1-20 , E1-20)进行筛选 , 其中 10 个引物
(表 2)的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳能得到分离良好并呈多态性的带型 (图 1).
99第 1 期　　　　　　　　　苏应娟等:陆均松不同居群的 RAPD分析
图 1　随机引物 C-06 (a), E-11 (b)的扩增产物
Fig.1　Amplification products of primer C-06 (a), E-11 (b)
1 ～ 9 陆均松;10 2 kb marker
表 2　引物名称 、碱基序列和扩增后每个样品产生的带型数
Tab.2　Name of primers , sequence and number of bands generated from each individual after amplification
名　称 序　列 植物材料
01 02 03 04 05 06 07 08 09 总计
OPC-06 5′-GAACGGACTC-3′ 2 4 4 3 5 3 4 6 3 7
OPE-12 5′-TTATCGCCCC-3′ 3 5 4 6 8 9 4 6 7 8
OPG-06 5′-GTGCCTAACC-3′ 5 5 5 6 5 5 5 4 2 8
OPE-17 5′-CTACTGCCGT-3′ 4 3 4 5 3 4 3 1 2 7
OPE-11 5′-GAGTCTGAGG-3′ 7 7 7 7 7 7 7 8 8 8
OPE-14 5′-TGCGGCTGAC-3′ 6 7 6 7 6 6 6 6 6 7
OPE-16 5′-GGTGACTGTG-3′ 6 7 7 7 6 6 7 7 6 7
OPC-08 5′-TGGACCGGTG-3′ 5 6 5 6 5 5 5 5 5 6
OPE-04 5′-GTGACATGCC-3′ 5 6 5 6 5 6 5 5 5 6
OPE-07 5′-AGATGCAGCC-3′ 4 4 4 5 4 5 4 4 5 5
该10个引物的 w(G+C)为 60%～ 70%, 每个引物扩增的 DNA 片段数为 1 ～ 9个 , 10
个引物共检测 69个位点 , 其中多态位点 23个 , 占 33.30%.这些 DNA片段的分子容量范
围在 278 ～ 2 423碱基对之间.选择清晰而且重复性好的谱带作为分子数据进一步分析.
根据任意 2个样本 RAPD图谱中共有的 DNA片段数和扩增出的 DNA 片段总数 , 求出
它们之间的遗传距离(表 3).应用 UPGMA法对遗传距离进行聚类分析得到树系图 (图 2).
　02
　04
　01
　03
　07
　05
　06
　08
　09
　
0.16 0.12 0.08 0.04 0.00
图 2　根据 RAPD数据 , 应用 UPGMA法构建的陆均松个体遗传树系图
Tab.2　Genetic dendrogram of individals of D.pierrei generated using UPGMA algorithm to cluster RAPD data
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表 3　任意 2个个体间的遗传距离 , RAPD图谱中共有的片段数和扩增片段总数
Tab.3　Genetic distance between any two individuals (above diaganol), the numbers of the shared
fragments and the total numbers of fragments amplified in RAPD patterns (below diaganol)
01 02 03 04 05 06 07 08 09
01 0.109 0.052 0.143 0.149 0.118 0.072 0.131 0.125
02 45/101 0.058 0.054 0.130 0.120 0.077 0.113 0.243
03 46/ 97 49/ 104 0.093 0.135 0.124 0.040 0.098 0.131
04 45/105 53/ 112 49/ 108 0.125 0.097 0.130 0.164 0.178
05 43/101 47/ 108 45/ 104 49/ 112 0.083 0.115 0.113 0.107
06 45/102 48/ 109 46/ 105 51/ 113 50/ 109 0.124 0.140 0.096
07 45/ 97 48/ 104 48/ 100 47/ 108 46/ 104 46/105 0.059 0.131
08 43/ 99 47/ 106 46/ 102 46/ 110 47/ 106 46/107 48/102 0.069
〗09 42/ 96 39/ 103 43/ 99 44/ 107 46/ 103 47/104 43/99 47/101
图2可得 , 9个陆均松个体可分为 2大群 , 第 1群包括 03 , 07 , 01 , 02 , 04等 5个个
体 , 可划分为 2个亚群;第 2群可划分为 2个亚群 , 包括08 , 09 , 05 , 06等4个个体.这
可能与陆均松的生境有关系 , 来自不同海拔高度的陆均松个体遗传 (P[ 4])差异较大 , 这
表明陆均松个体存在着地理上的遗传分化.目前对不同地理分布的陆均松尚未见形态学等
方面的报道.陆均松的 P 为 0.106 1 , 罗汉松的 P 为0.069 3 , 比陆均松小得多.罗汉松为
非濒危种 , 陆均松是渐危种[ 5] .相对罗汉松而言 , 陆均松的遗传多样性丰富.因此推测其
渐危原因不是由于本身遗传特性造成的 , 可能是过度砍伐导致的.
参考文献:
[ 1] 　郑万均 , 傅立国.中国植物志.第七卷.北京:科学出版社 , 1978
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1994 , 36:528 ～ 533
[ 3] 　EDWARDS K , EDWARDS K , JOHNSTONE C , et al.A simple and rapid method for the preparation of plant
genomic DNA for PCR analysis.Nucleic Acids Research , 1991 , 119 (6):1349
[ 4] 　汪小全 , 邹喻苹 , 张大明 , 等.银杉遗传多样性的 RAPD 分析.中国科学 (C), 1996 , 26 (5):
436～ 441
[ 5] 　国家环境保护局 , 中国科学院植物研究所.中国植物红皮书 稀有濒危植物 (第 1 册).北京:
科学出版社 , 1992
RAPD Analysis of Different Population of Dacydium pierrei
SU Yingjuan
, WANG Ting , HUANG Chao , ZHU Jianming , ZHOU Qin
Abstract:The genetic diversity of 9 individuals of Dacydium pierrei from Diaoluo Mountain in Hainan
province was investigated by RAPD.10 primers from 3 Operon Kits(KitC , KitE and KitG)amplified
69 bands , of which 23 are polymorphic ones.The mean value of the genetic distances between the in-
dividuals of D.pierre is 0.106 1.To compare with Podocarpus macrophyllus , the genetic diversity of
D.pierrei is much richer.It is postulated that over cutting is the main reason to make D.pierrei dan-
gerous.
Keywords:Dacydium pierrei , different population , RAPD analysis
101第 1 期　　　　　　　　　苏应娟等:陆均松不同居群的 RAPD分析
School of Life Sciences , Zhongshan University , Guangzhou 510275 , China