全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（2）：269–276
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–04–10；修回日期：2010–01–08
基金项目：北京市人才强教—拔尖创新人才计划项目（PXM2007-014207-044560）；北京市农业科技项目（20070101）；北京市科技新星
人才培养项目（2006B25）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail: yaoyc_20@126.com）
苹果属观赏海棠 McCHS 基因的克隆及实时定量
表达
宋婷婷，沈红香，姚允聪*，田 佶
(北京农学院植物科学技术系，北京 102206)
摘 要：以苹果属观赏海棠‘王族’品种叶片提取的总 RNA 为模板，通过 RT-PCR 与 RACE 扩增，获
得一个 1 529 bp 的查尔酮合成酶（Chalcone sythase，CHS）基因的 cDNA 序列，其基因编码区共 1 167 bp，
编码 389 个氨基酸，命名为 McCHS。使用实时荧光定量 PCR 和紫外可见光分光光度计，对 3 类不同叶色的
观赏海棠品种‘火焰’（Malus‘Flame’，叶片绿色）、 ‘绚丽’（Malus‘Radiant’，新叶红色）、‘高原之火’
（Malus‘Prairifire’，新叶红色）和王族（Malus‘Royalty’，叶片紫色）幼叶和功能叶中的 McCHS 表达及
其花色苷含量进行测定分析，结果表明：McCHS 在 4 个品种的幼叶和功能叶中均有表达, 其幼叶表达量的变
化与叶片中花色苷含量的变化一致；除‘绚丽’外的功能叶表达量变化和花色苷含量变化也一致，‘绚丽’
功能叶的特殊情况可能涉及花色苷合成途径中的其他酶和转录因子。
关键词：苹果属；观赏海棠；查尔酮合成酶基因；花色苷；荧光定量
中图分类号：S 685.99 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2010)02-0269-08

Studies on Cloning and Real-time Expression of McCHS Gene in Malus
Crabapple
SONG Ting-ting，SHEN Hong-xiang，YAO Yun-cong*，and TIAN Ji
（Department of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China）
Abstract: Using the total RNA from the leaves of Malus crabapple‘Royalty’as the template, the full
cDNA of CHS（Chalcone synthase）gene（1 529 bp）was cloned by reverse transcription polymerse chain
reaction（RT-PCR）and rapid-amplification of cDNA ends（RACE）. The gene was named McCHS, containing
an open reading frame（1 167 bp）and encoding a protein of 389 amino acids. The expression of McCHS and
the content of anthocyanin was determined by Real-time quantitative PCR and spectrophotometer
respectively in the mature and young leaves of ‘Flame’（green young and mature leaf），‘Radiant’（red
young leaf and green mature leaf），‘Prairifire’（red young leaf and green mature leaf），‘Royalty’（purple
young and mature leaf）. The results showed that McCHS was expressed in both mature leaves and young
leaves of the above four cultivars. It was in the young leaves of all the four cultivars that the variation in the
McCHS expression was similar to that in the anthocyanin content. The same trend was found in the mature
leaves of most cultivars with the exception of ‘Radiant’, which may have other enzymes and transcription

DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2010.02.016
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factors involved in the anthocyanin synthesis in its mature leaves.
Key words: Malus；crabapples；chalcone synthase；anthocyanin；real-time quantitative PCR


苹果属观赏海棠（Malus crabapples) 是苹果属植物中最具观赏价值的类型，其花有红、白、粉
色之分；果有红、绿、黄色。其叶可分为绿色叶类，常色叶类红、紫叶，新叶有色类红叶和秋色叶
类红、黄叶等类型，色泽变化幅度大，观赏期长，所以叶色是观赏海棠品种改良的重要目标之一。
花色苷是广泛存在于被子植物中的一类重要的类黄酮化合物。它是植物花朵、叶片和果实中几乎所
有色泽形成的物质基础（Joseph et al., 1998；Gillian, 2001）。查尔酮合成酶（chalcone sythase，CHS)
是类黄酮和花色素苷次生代谢途径中的第一个关键酶（孟繁静，2000），催化香豆酰辅酶 A 和丙二
酰辅酶 A 合成查尔酮（Holton, 1995）。查尔酮分子的异构化和功能基团的进一步取代都能导致黄酮、
异黄酮和花色素苷的合成，从而使花色、叶色和果实色泽发生变化（Li et al.，2005）。查尔酮合成
酶基因是这一代谢途径中的关键酶基因。近年来许多研究者围绕着花色苷生物合成，在一年生和多
年生草本植物如苜蓿（Ferrer et al., 1999）、矮牵牛（Koes et al., 1989）、欧芹（Herrmann et al., 1988）
等植物中，对查尔酮合成酶基因克隆、功能分析和遗传转化进行了研究，初步明确了它在植物花色
苷代谢中的重要作用。
作者从‘王族’中克隆获得查尔酮合成酶基因，并对其基因及其编码蛋白序列进行分析，同时，
采用实时荧光定量PCR技术和分光光度技术分别对不同叶色的品种中查尔酮合成酶基因表达量和花
色苷含量进行检测和分析，以期为苹果属观赏海棠叶色形成的分子机理研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以苹果属观赏海棠（Malus crabapples）品种中具有典型叶色的 4 个品种为试验材料，即叶片为绿
色类的‘火焰’（‘Flame’）；幼叶红色、功能叶为绿色的 ‘绚丽’（‘Radiant’）和‘高原之火’（‘Prairifire’）；
叶片为常色紫色的‘王族’（‘Royalty’）。于 2008 年春季，选取树势和生长势相似的植株，采摘枝条
顶端萌芽后 7 d 的幼叶和枝条 5 ~ 6 节处萌芽 50 d 的功能叶，液氮速冻后–80 ℃保存备用。
1.2 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
用改良热硼法（陆旺金和蒋跃明，2003） 提取‘王族’幼叶总 RNA。以提取的总 RNA 为模板，
利用 Clontech SMARTTM Library 试剂盒（购自 Clontech）合成 3′-RACE 和 5′-RACE cDNA 第一链。
1.3 McCHS 基因序列的克隆
根据GenBank中公布的植物查尔酮合成酶基因保守片段设计一对兼并性引物用于CHS保守序列的
扩增，CHS1：CACTYGACATGTGCGTAATC和CHS2：GGGCCYAGYGAYACCCAYCTTG，以王族
幼叶RNA反转的cDNA为模板进行PCR扩增。
基于得到的 CHS 片段序列测序结果，分别设计了 3′和 5′端引物 CHS3：GGACATCTCCGTGAAGT
AGGG 和 CHS4：CGGGAAGAATGGTTTGTGCTGCT；UPM 通用引物由 RACE 试剂盒提供，根据试
剂盒说明，转录产物的 3′末端用 CHS3 和 UPM 引物扩增，其 PCR 反应条件为 94 ℃预变性 5 min、94
℃变性 1 min，64 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 2 min，30 个循环；72 ℃延伸 5 min。转录产物的 5′末端使
用 CHS4 和 UPM 引物扩增，其 PCR 反应条件为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 1 min，60 ℃退火 30 s，
2 期 宋婷婷等：苹果属观赏海棠 McCHS 基因的克隆及实时定量表达 271

72℃延伸 1 min，30 个循环，72 ℃延伸 5 min。PCR 产物经回收、纯化，与 pUC18-T Vector（购自宝
生物工程公司）连接，转化 DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选后测序（上海生工生物工程技术服务有限
公司）。用 DNAMAN5.2.2 软件拼接以上序列得到苹果属观赏海棠查尔酮合成酶基因全长 cDNA 序列。
1.4 实时荧光定量 PCR 分析
分别提取‘绚丽’、‘火焰’、‘高原之火’、‘王族’品种的幼叶和功能叶 RNA（陆旺金和蒋跃明，2003），
使用 M-MuLV First cDNA Synthesis Kit（购自 Promega 公司)合成第一链 cDNA 备用。
按照 Real Master Mix（SYBR Green）PCR 试剂盒（购自天根生化科技有限公司）操作指导, 采用
实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）方法，检测基因的相对表达量（Ficko et al.,
2005）。扩增目标 McCHS 基因引物被设计为 CHS-F：GGGCTTACATTTCACCTTCT 和 CHS-R：
GGCCAACTTGGACTCTACTT，预测产物长度是 171 bp，适用于荧光定量 PCR；以 Malus domestica 18S
ribosomal RNA基因GenBank（序列号：DQ341382）作为内参基因，其引物 18SR-F：ACACGGGGAGGTA
GTGACAA 和 18SR-R：CCTCCAATGGATCCTCGTTA 预测产物长度是 80 bp 适用于荧光定量 PCR。
对反转录所得的cDNA分别进行 5倍梯度稀释（1、1︰10、1︰100、1︰1 000、1︰100 000），实
施荧光定量反应，然后绘制相对标准曲线。McCHS基因 RT-qPCR扩增的反应体系为20 μL，包括：9 μL
Real Master Mix混合液、2 μL cDNA、1 μL CHS-F（10 μmol · L-1）、1 μL CHS-R （10 μmol · L-1）、7
μL ddH2O。反应程序为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 20 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸30 s，40 次
循环，每次循环第 3步进行荧光采集，最后 95 ℃变性1 min，退火至 55 ℃（每隔10 s上升0.15 ℃）后
保温1 min，接着检测其荧光值，绘制熔点曲线。内参基因的18S rRNA PCR扩增的反应体系为20 μL, 包
括：9 μL Real Master Mix混合液、2 μL cDNA、 1 μL 18SR-F（10 μmol · L-1）、1 μL 18SR-R（10 μmol · L-1）、
7 μL ddH2O。其反应程序与McCHS基因的反应程序相同。标准品cDNA和待测样品均设置3次重复。
1.5 花色苷含量测定
花色苷相对含量的提取根据何弈昆等（1995）的方法略有改动。称取 1.0 g 叶片剪碎（2 ~ 3 mm），
置于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 1%的盐酸甲醇，常温下浸泡 20 h。取上清液，以提取液作空白，
采用 UNICO UV-2100 型紫外可见分光光度计在 520 nm 处测定吸光度。花色素苷相对含量 A（色素单
位）以每克鲜样质量在 10 mL 提取液中的 OD 值为一个色素单位，即 A = OD520。
2 结果与分析
2.1 McCHS 基因的克隆与序列比较
以‘王族’幼叶RNA反转录的cDNA为模板，扩增出一条490 bp的单一特异性条带（图1）。回收
纯化产物后经测序并进行序列同源性比较表明，该片段与马铃薯（gi:1470059）和烟草（EF421432）
的该家族基因分别具有89%和88%的氨基酸序列同源性，证明该扩增产物是查尔酮合成酶基因片段，
这是进一步通过RACE法克隆McCHS基因全长序列的前提条件。
根据 3′ RACE 和 5′ RACE 测序结果（图 2）拼读出苹果属观赏海棠查尔酮合成酶基因，全长序列
为 1 529 bp，命名该基因为 McCHS（登录号：FJ599763）。对该基因的序列进行分析表明，其含有一
个编码 389 个氨基酸的完整阅读框架，包括起始密码子和终止密码子。利用 DNAMAN5.2.2 软件，分
析 McCHS 基因编码的氨基酸序列，认为该基因具有完整的 3′和 5′末端，是苹果属观赏海棠查儿酮合
成酶基因的全长序列（图 3）；同时具有 CHS 基因所必需的活性位点，这些活性位点使底物能够和查
尔酮合成酶结合发生催化反应，其位点是：Try169、Leu309、Val342。
272 园 艺 学 报 37 卷
图 1 McCHS 基因片段的 PCR 扩增结果
M. DNA marker; 1. PCR 扩增产物。
Fig. 1 The PCR result based on McCHS gene fragment
M. DNA marker; 1. Product of PCR.






图 3 苹果属观赏海棠McCHS基因cDNA的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
起始密码子和终止密码子用下划线表示，阴影处是蛋白活性位点。
Fig. 3 The complete cDNA sequence of McCHS and its predicted amino acid sequence
The translation start code and the stop codon are indicated in underline; an asterisk marks. The Shadow are active sites.
图 2 McCHS 基因的 3′ RACE 和 5′ RACE PCR 扩增结果
M. DNA marker；1. 3′ RACE 扩增产物；2. 5′ RACE 扩增产物。
Fig. 2 The PCR results of 3′RACE and 5′RACE for McCHS
M. DNA marker; 1. PCR product of 3′RACE;
2. PCR product of 5′RACE.
2 期 宋婷婷等：苹果属观赏海棠 McCHS 基因的克隆及实时定量表达 273

2.2 McCHS 基因编码产物的功能分析与同源性比较
根据InterProScan 在线软件对编码氨基酸分子量、编码蛋白的结构域和功能位点进行分析表明，
McCHS main ORF 编码389个氨基酸（pI 5.96）的分子量约为42.4 kD，其编码的蛋白具有3个CHS蛋白
的保守结构域：第1个是N-末端结构域（从Val2到Pro228），由于N -末端结构域的不同，CHS基因的活
性也不同，在这段蛋白质序列的中央部分有一个保守的半胱氨酸残基Cys164，属于催化功能的必需氨
基酸。第2个是C-末端结构域（从Glu238到Gly388），查尔酮合酶的该段结构域富含活性位点（张艳和胡
银岗，2008）；第3个是ACP（酰基载体蛋白）聚合酶Ⅲ结构域（从Leu283到His386），这是一段在ACP
聚合酶Ⅲ中发现的结构域，ACP聚合酶Ⅲ在植物和细菌中主要负责脂肪酸合成酶链式反应的应答。
利用DNAMAN5.2.2软件进行多重序列比对发现（图4），CHS基因的main ORF 十分保守，3个功
能结构域也高度保守，显示查尔酮合成酶进化的保守性。除甘薯外，其他植物C-末端长度基本一致。

图 4 苹果属观赏海棠 McCHS 基因main ORF推导的氨基酸序列的多重比对分析
* 表示催化功能必需氨基酸。
Fig. 4 Alignment of the predicted amino acid sequences of McCHS main ORF in Malus crabapples and those of several other plants
Asterisks indicate the essential amino acids for CHS function.
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图 5 苹果属观赏海棠McCHS氨基酸序列与不同来源
CHS氨基酸序列的系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of CHS from various species
including McCHS
利用MEGA 4.0软件，对McCHS与已知植物
CHS结构域蛋白进行进化树分析，可以看出Mc-
CHS编码的氨基酸序列具有较高同源性。其与梨
（DQ901397）、 草莓（AB201756）、 马铃薯
（U47738）和胡萝卜（D16256）的CHS的同源性
分别为96%、93%、89% 和85%。基于氨基酸序
列的系统进化树可以看出其氨基酸的进化与植物
的进化基本一致，同科植物在进化树上处于同一
分 支 。 McCHS 与 梨 （ DQ901397 ）、 草 莓
（AB201756）、红叶李（DQ856583）、柑橘
（AB009350）、杜鹃（AJ413277）的CHS具有更
近的亲缘关系（图5）。
2.4 McCHS基因在不同叶色品种中的表达分析
由iCycleriQTM自动测出的苹果属内参基因
18S rRNA 的回归方程、PCR扩增效率和相关系数
分别为：Y =–3.409X + 35.857、96.5%和0.997*；
测出的苹果属McCHS的回归方程、PCR扩增效率
和相关系数分别为：Y =–3.325X +39.073、99.9%
和0.996*。说明该试验具有良好的重复性和较高
扩增效率。熔点曲线分析出的18S rRNA和McCHS
均只有1个Tm值, 分别为88 ℃和85 ℃， 表明
18S rRNA和McCHS所用引物具有高度特异性, 其
PCR扩增产物均为目的片段，不含引物二聚体。
McCHS基因在4个苹果属观赏海棠品种叶片中表达模式如图6。以表达量最高的王族幼叶的表达量
定为“1”。按照相对定量公式 2-△△Ct作图。由图6可以看出，McCHS基因在4个观赏海棠品种的幼叶
和功能叶中均有表达，其中观赏海棠品种‘王族’幼叶中的表达量最高，同时其幼叶花色苷含量也远
远高于其他品种幼叶；‘王族’功能叶中McCHS表达量与其相对应的花色苷含量也高于其他品种功能
叶；‘火焰’幼叶和功能叶所对应的McCHS表达量和花色苷含量分别低于其他品种。除‘绚丽’外各
品种的功能叶McCHS表达量均低于其幼叶的表达量。
图 6 苹果属观赏海棠叶片中McCHS基因相对表达量及对应花色苷的含量的关系
Fig. 6 Relative copy numbers of McCHS expression levels and change of anthocyanin
in the leaves of different Malus crabapples
2 期 宋婷婷等：苹果属观赏海棠 McCHS 基因的克隆及实时定量表达 275

3 讨论
大量研究表明CHS与植物的色彩形成关系密切，其基因表达量的增加或者减少都可能导致植物器
官颜色变异（Ingrid et al.，1990）。在mRNA 水平上分析了矮牵牛Red Star（Koseki，2005）6 个花色
苷生物合成过程中的重要基因, 发现只有CHS基因的表达受到抑制而使花冠形成红白相间的现象；将
彩叶草CHS基因转入烟草中，烟草叶片出现了色斑（祝钦拢，2006）；Coen等（1986）对金鱼草的花
色突变体研究表明，突变体花色变淡可能受CHS基因所控制。因此，作者在苹果属观赏海棠中克隆CHS
基因并对该基因的编码信息进行分析是对观赏海棠叶色、花色分子调控机理进行研究的重要基础。
本研究中序列分析的结果，McCHS具有植物CHS典型的结构特点，如C-端、N-端保守序列、与脂
肪酸合成酶链式反应有关的ACP结构域和活性位点，说明所克隆的McCHS基因是具有生物学功能的。
N-端结构域是CHS功能活性的关键部位，在这段蛋白质序列的中央部分有一个保守的半胱氨酸残基
Cys164，对于查尔酮合成酶的催化活性和香豆酰辅酶A（查尔酮的前体物质）结合位点的活性起着至关
重要的作用（Dangl et al., 1989；Grotewold，2006）。
结合实时荧光定量PCR数据和花色苷含量测定数据可以看出，在4个观赏海棠品种的幼叶中，花色
苷含量的变化与McCHS基因相对表达量变化相一致。这说明在叶片的发育初期McCHS基因与花色苷的
含量是密切相关的。紫色的王族幼叶与绿色的火焰幼叶片相比，其McCHS基因的表达量和花色苷的含
量明显高于火焰幼叶。红色的绚丽、高原之火幼叶中McCHS基因的相对表达量和花色苷含量也高于火
焰叶片。这表明McCHS基因在苹果属观赏海棠叶片早期发育阶段的颜色形成过程中可能起主要作用，
同时也证实了此阶段McCHS基因在花色苷合成途径中的重要地位，是花色苷合成途径的主要限速酶。
在功能叶中，除绚丽外其它品种McCHS基因的表达量均低于幼叶，而花色苷含量却明显高于幼叶，这
可能是由于在功能叶中，虽然花色苷合成减弱，但是在整个叶片形成过程中，已经有大量花色苷在叶
片中积累，造成McCHS基因表达量比幼叶低但花色苷总量却比幼叶高的现象。
研究表明，在大部分植物当中CHS存在多拷贝，在同源基因之间的表达呈现差异特性。例如拟南
芥中CHS基因在花、叶、果中都有表达（Hartmann et al., 1998），而矮牵中的CHSA和CHSJ只在花粉囊
和花冠中特异表达（Koes et al.，1989）。在一些植物中CHS在不同的发育时期表达的位置也不相同。
一些植物的早期发育阶段，CHS出现在叶片组织中（Knogge et al.，1986），而成熟植株中主要限于花
组织中表达（Koes et al.，1986）。所以我们推测，CHS的相对表达量在整个叶片的发育过程中会逐渐
发生改变或者发生不同部位、器官的特异表达。在叶片发育的初级阶段，CHS相对表达量较多，并且
对叶片中花色苷的合成及叶色的形成具有直接的影响；而在叶片成熟即形成功能叶以后，CHS基因相
对表达量减少，花色苷合成途径中的其他酶以及转录因子可能对花色苷的合成产生了更多的影响（Lee，
2002；Lee & Kevin, 2002；Richard et al.，2007）。
在叶片生长的过程中，除花色苷的积累外，温度、光照、叶绿素的积累等更多复杂因素共同作用
影响功能叶叶色（Jez & Noel，2000; 常小丽，2008），所以CHS的作用机理还需要进行进一步的研究。

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