全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2013)02 － 0691 － 06
收稿日期:2012 － 04 － 26
基金项目:国家自然科学基金(30860035) ;农业部公益性行业
科技项目(201103037)
作者简介:杨正松(1977 －) ，男，大学本科，助理研究员，主要从
事经济植物、小浆果开发利用研究，E-mail:muzi91_1@ 163． com，
* 为通讯作者，E-mail:hejw4522@ 163． com。
悬钩子属野生种及品种亲缘关系的 ISSＲ分析
杨正松1，和志娇1，2，和加卫1* ，程在全2，毕海林1，王朝文1
(1．云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南 丽江 674100;2．云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明
650223)
摘 要:利用 ISSＲ分子标记方法，对 39 份悬钩子属(Ｒubus L．)野生种或变种及 17 份栽培品种进行分析，探讨这 56 份材料间亲缘
关系的远近。通过试验从 35 个引物中筛选出 12 个能扩增出清晰带型并具多态性的引物，共扩增出 166 条 DNA 片段，分子量在
250 ～ 2300 bp之间，平均每条引物扩增出 13． 83 条 DNA片段，多态性比率为 96． 33 %，然后采用 NTSYS-pc软件和 UPGMA 法构建
了系统树。聚类分析结果将野生种分成 5 大类群，其中 15 份栽培品种包含在内，而有 2 份栽培品种(酷它它和宝森)另成一类，区
别于其他 54 份材料。试验认为 ISSＲ分子标记技术适合作悬钩子属植物组间亲缘关系的分析。
关键词:悬钩子属;ISSＲ;聚类分析;亲缘关系
中图分类号:S663． 2 文献标识码:A
Genetic Ｒelationship Analysis between Wild Species and
Cultivars of Ｒubus L． by ISSＲ Marker
YANG Zheng-song1，HE Zhi-jiao1，2，HE Jia-wei1* ，CHENG Zai-quan2，BI Hai-lin1，WANG Chao-wen1
(1． Institute of Alpine Economic Plant，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Lijiang 674100，China;2． Ｒesearch Institute of
Biotechnology ＆ Genetic Germplasm，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Kunming 650223，China)
Abstract:Genetic relationship of 39 Ｒubus L． wild species or varieties and 17 cultivars were studied using inter-simple sequence repeat(IS-
SＲ)marker． 12 primers，which were screened out from 35 primers，could get clear and polymorphic fragments． A total of 166 DNA frag-
ments ranging from 259 bp to 2300 bp were got through PCＲ by these 12 primers． The average number of DNA fragments produced by each
primer was 13． 83． The polymorphic rate was 96． 33 % ． A dendrogram of showing genetic relationships was constructed by using the NTSYS-
pc software and UPGMA． The 39 wild species and 15 cultivars were divided into 5 groups by clustering analysis，and other 2 cultivars(Kota-
ta and Boysen)belonged to another groups and differented from the 54 a materials． The results showed that ISSＲ molecular marker technique
was suitable for analyzing the Ｒubus interspecific relationship．
Key words:Ｒubus L．;ISSＲ;Cluster analysis;Genetic relationship
悬钩子属(Ｒubus L．)又名树莓属，属于蔷薇科，
由多年生落叶常绿灌木、半灌木或多年生匍匐草本
植物组成，现约有 750 余种［1 ～ 2］，全世界树莓品种有
200 多个，但主栽品种不过 30 多个，被誉为“第三代
新兴水果”［3］的悬钩子属植物具有很高经济价值和
药用价值，在医药、食用色素、天然香料、食品加工等
方面有着广泛的用途。
悬钩子属是蔷薇科中的一个大属，对属的范围
及属下等级的划分至今仍不统一。L． H． Bailey 在
研究北美洲悬钩子植物的过程中，基本上同意了
W． O． Fork 的对属内类群划分为亚属的处理，而中
国学者俞德浚、陆玲娣等对悬钩子属植物进行了分
组处理，并未采用亚属等级［2］，其主要原因是悬钩
子属植物本身存在着广泛的杂交、多倍体化和无融
合生殖，使种间和种内分化复杂多样、类型变异繁
多，而对该属植物系统演化长期以来仅局限于形态
学、细胞学和孢粉学等方面的研究［4 ～ 6］，这些都是对
遗传物质的间接鉴定，给悬钩子属植物的分类带来
了困难，无法进行更深入的研究。目前中国还没有
统一的树莓品种分类系统，现有的分类是不考虑与野
生种之间的亲缘关系和系统关系而进行的大致分类。
196
2013 年 26 卷 2 期
Vol. 26 No. 2
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2013.02.067
随着分子生物技术的发展，给这一问题的解决
带来了契机，DNA分子标记技术已成功应用于悬钩
子属植物种间亲缘关系的研究［7 ～ 19］、品种间的快速
鉴定［10 ～ 12］以及优良基因的定位和筛选［13］等方面。
表 1 悬钩子属野生种的种名及采集地
Table 1 The wild species name and collecting place of Ｒubus L．
组
Sections
编号
Codes
种
Species
拉丁名
Latin names
采集地
Collections
海拔(m)
Altitude
空心莓组
Sect． Idaeobatus Focke 1 华中悬钩子 Ｒ． cockburnianus Hemsl． 维西 3162
2 拟复盆子 Ｒ． idaeopsis Focke 德钦 2541
3 红泡刺藤 Ｒ． niveus Thunb． 丽江 2356
4 三对叶悬钩子 Ｒ． trijugus Focke 丽江 3219
5 桔红悬钩子 Ｒ． aurantiacus Focke 丽江 3138
6 椭圆悬钩子 Ｒ． ellipticus Smith 永胜 1911
7 栽秧泡 Ｒ． ellipticus Smith var． obcordatus Focke 大理 1908
8 红果悬钩子 Ｒ． erythrocarpus Yü et Lu 维西 3233
9 美饰悬钩子 Ｒ． subornatus Focke 维西 3318
10 黑腺美饰悬钩子 Ｒ． subornatus Focke var． melanadenus Focke 维西 3327
11 粉枝莓 Ｒ． biflorus． Buch． -Ham． ex Smith 丽江 2665
12 刺萼悬钩子 Ｒ． alexeterius Focke 丽江 2578
13 红花悬钩子 Ｒ． inopertus Focke 贡山 2105
14 红毛悬钩子 Ｒ． pinfaensis Levl． et Vant． 大理 2156
15 插田泡 Ｒ． coreanus Miq． 丽江 2450
16 毛叶插田泡 Ｒ． coreanus Miq． var． tomentosus Card． 维西 2450
17 直立悬钩子 Ｒ． stans Focke 贡山 3183
18 针刺悬钩子 Ｒ． pungens Camb． 维西 3127
19 线萼针刺悬钩子 Ｒ． pungens Camb． var． linearisepalus Yü et Lu 维西 3409
20 细瘦悬钩子 Ｒ． macileutus Camb． 福贡 1986
21 棱枝细瘦悬钩子 Ｒ． macileutus Camb． var． angulatus Delav 丽江 2864
22 三叶悬钩子 Ｒ． delavayi Franch． 丽江 1900
23 掌叶悬钩子 Ｒ． pentagonus Wall． ex Focke 大理 2554
24 山莓 Ｒ corchorifolius L． f． 贡山 2118
25 单茎悬钩子 Ｒ． simplex Focke 丽江 2490
26 光滑悬钩子 Ｒ tsangii Merr． 维西 3450
27 绢毛悬钩子 Ｒ． lineatus Ｒeinw． 碧江 2408
木莓组
Sect． Malachobatus Focke 28 云南悬钩子 Ｒ． yunnanicus Ktze． 云龙 1758
29 网纹悬钩子 Ｒ． cinclidodictyus Card． 贡山 2784
30 羽萼悬钩子 Ｒ． pinnantisepalus Hemsl． 洱源 2146
31 锈叶悬钩子 Ｒ． fuscifolius Yü et Lu 贡山 2134
32 大花悬钩子 Ｒ． wardii Merr． 维西 2968
刺毛莓组
Sect． Dalibardastrum
(Focke)Yü et Lu
33 三色莓 Ｒ． tricolor Focke 大理 2116
34 刺毛悬钩子 Ｒ． multisetosus Yü et Lu 大理 2174
矮生莓组
Sect． ChamaebatusFocke 35 齿萼悬钩子 Ｒ． calycinus Wall． ex D． Don 维西 3146
匍匐莓组
Sect． CylactisFocke 36 凉山悬钩子 Ｒ． fockeanus Kurz 中甸 3089
37 委陵悬钩子 Ｒ． potentilloides W． E． Evans 贡山 3113
38 矮生悬钩子 Ｒ． clivicola Walker 贡山 2958
39 红刺悬钩子 Ｒ． rubrisetulosus Card． 维西 3115
296 西 南 农 业 学 报 26 卷
Hong等用 ISSＲ标记研究了韩国黑莓(Ｒ． coreanus)
的遗传多样性［14］，Samir 用 ISSＲ 标记对 48 个野生
黄莓(Ｒ． chamaemorus L．)无性系进行了遗传多样性
分析，并认为 ISSＲ标记技术的使用有助于加拿大野
生黄莓亲本的选育［15］。本研究采用 ISSＲ标记分析
悬钩子属不同野生种和栽培品种之间的亲缘关系，
以期为悬钩子属植物系统分类、树莓栽培品种的合
理利用及品种改良提供参考和依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
供试的 39 份野生种采自滇西北不同地区，17
份栽培品种采自云南省农科院高山经济植物研究所
资源圃，试验材料基本信息见表 1 及表 2。在采样
地每个种随机选取 3 ～ 5 株，每株分别采集树冠外围
1 年生健康幼嫩叶片，用硅胶干燥，编号保存于 － 20
℃下备用。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 总 DNA 的提取 采用改良的 CTAB 法［16］
提取供试样品(每个种 3 ～ 5 个个体)的植物基因组
DNA，即采取苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比 25∶ 24∶ 1)
抽提 2 次，加 2 倍体积的无水乙醇(－ 20 ℃预冷)和
1 /10 体积 3 M NaAc(pH 5． 2)混匀，－ 20 ℃保持 20
min，使核酸沉淀，然后将提取的 DNA用 1
表 2 栽培品种的种名及采集地
Table 2 The name and collecting place of cultivars
编号
Codes
品种名
Species or cultivars
采集地
Collection
海拔(m)
Altitude
40 乔克多 Choctaw 丽江 2417
41 切斯特 Chester 丽江 2417
42 酷它它 Kotata 丽江 2417
43 托乐米 Tulameen 丽江 2417
44 奇里考特 Chilcotin 丽江 2417
45 金丰 Goldenharvest 丽江 2417
46 布里斯托 Bristol 丽江 2417
47 秋金 Fallgold 丽江 1247
48 来味里 Ｒeville 丽江 2417
49 哈瑞太兹 Heritage 丽江 2417
50 米克 Meeker 丽江 2417
51 丰满红 Fengmanhong 丽江 2417
52 宝森 Boysen 丽江 2417
53 红宝玉 Boyne 丽江 2417
54 缤纷 Ｒoyalty 丽江 2417
55 赫尔 Hull 丽江 2417
56 维拉米特 Willamette 丽江 2417
× TE溶解并用 ＲNA酶除去 ＲNA。总 DNA 采用 0．
8 %的琼脂糖凝胶电泳检测质量，并用紫外分光光
度计(DU640)测 DNA浓度，然后稀释至 25 ng /μl用
于 ISSＲ-PCＲ反应。
1． 2． 2 ISSＲ及其产物检测 从所提取的 56 份供
试样品的植物基因组总 DNA 中选出 2 个材料的
DNA进行 ISSＲ 扩增体系的优化、模板 DNA 的定量
和引物的筛选。从 35 个 ISSＲ引物中筛选出扩增条
带清晰、多态性好和反应稳定的 ISSＲ 引物对 56 个
试验材料进行 PCＲ 扩增，PCＲ 扩增在 PTC-200(MJ
Ｒesearch，tNC)型 PCＲ 仪上进行，扩增体系和循环
参数如下:PCＲ反应包括模板 DNA溶液(25 ng /μl)
6． 95 μl，10 × Buffer(Mg2 +)1． 05 μl，dNTP(2． 5
μM/L)0． 8 μl，引物(12． 5 μM/L)0． 1 μl，Taq 聚合
酶(5 U /μl )0． 1 μl加 ddH2O，一滴石蜡油覆盖。反
应热循环程序为:首先 94 ℃预变性 4 min，然后进入
循环，每个循环为 94 ℃变性 30 s，48 ～ 52 ℃退火 l
min，72 ℃延伸 90 s，共 40 个循环，最后 72 ℃延伸
10 min，4 ℃冷却取出。反应产物以 Maker DL 2 000
为分子量标准，取 5 μl PCＲ 产物用含 EB 的 1． 5%
琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外分光透射仪下观察拍
照。
1． 2． 3 数据统计与分析 在 ISSＲ 扩增结果电泳图
谱中每一扩增条带代表引物的一个结合位点，视为
有效的分子标记［17］，用 Maker DL 2 000 作为分子量
的标准，同一引物，同一位点，根据各扩增片段的迁
移距离和大小，将 ISSＲ扩增产物的电泳结果中稳定
出现的条带(无论强弱)的有或无赋值为 0 和 1，在
相同迁移位置，有带记为 1，无带记为 0，以 0，1 格式
构成 ISSＲ 表型数据矩阵，利用 NTSYS-pc2． 1 软
件［18］计算样品之间的 Nei 氏遗传距离和相似系数，
根据遗传距离用 UPGMA 法(unweighted pair group
mean average)聚类分析，构建系统树。
2 结果与分析
2． 1 扩增产物的多态性分析
对 56 份供试材料用 ISSＲ 标记进行 PCＲ 扩增，
且每个种或品种做 3 个个体 ISSＲ-PCＲ 扩增，3 个个
体间的扩增结果一致。从 35 个 ISSＲ引物筛选出的
12 个引物见表 3，由表 3 可知，12 个引物共扩增到
166 个条带，其分子量在 250 ～ 2300 bp之间，其中多
态性条带 160 个，多态性条带百分率为 96． 33 %，不
同引物扩增出的清晰带数在 10 ～ 16 之间，平均每个
引物扩增出的片段条带数为 13． 8 条，扩增的多态性
条带数范围为 9 ～ 15 之间，每个引物的多态性百分
率为 90． 00 % ～100． 00 %，平均每个 ISSＲ引物扩
3962 期 杨正松等:悬钩子属野生种及品种亲缘关系的 ISSＲ分析
表 3 56 个试验材料的 ISSＲ引物扩增
Table 3 Amplification information of ISSＲ primers for 56 samples
引物
Primers
序列
Sequence
(5→3)
退火温度(℃)
Annealing
temperature
片段大小
Size range
of bands(bp)
扩增条带数目
No． of bands amplified
总数 Total 多态 Polymorphic
多态位
点百分比
PPB
(%)
811 (GA)8 C 50 375 ～ 2000 14 14 100． 00
826 (AC)8 C 52 250 ～ 2000 14 14 100． 00
835 (AG)8YC 52 250 ～ 2000 14 14 100． 00
841 (GA)8YC 52 250 ～ 1800 16 15 93． 75
844 (CT)8ＲC 52 375 ～ 2200 15 14 93． 33
846 (CA)8ＲT 52 400 ～ 2200 14 14 100． 00
848 (CA)8ＲG 52 375 ～ 2200 14 14 100． 00
856 (AC)8YA 52 375 ～ 2000 14 13 92． 86
873 (GACA)4 48 500 ～ 2300 16 15 93． 75
880 (GGAGA)3 50 375 ～ 2000 12 12 100． 00
890 VHV(GT)7 52 375 ～ 1800 10 9 90． 00
891 HVH(TG)8 52 375 ～ 2000 13 12 92． 30
总计 Total 166 160 96． 33
增出的多态性条带的数目为 13． 33 条。图 1 为引物
S844 对 56 份材料的 ISSＲ扩增电泳图谱。
2． 2 亲缘关系分析
对 56 份材料用 ISSＲ标记进行 PCＲ 扩增，扩增
结果通过 NTSYS-pc 软件计算样品之间的 Nei 氏遗
传距离和相似系数，根据遗传距离 UPGMA 法聚
图 1 引物 S844 对 56 份材料的 ISSＲ扩增电泳图谱
Fig． 1 Electrophoresis parameter of 56 samples tested by ISSＲ to u-
sing primer S844
类分析，构建系统树，初步探讨了部分悬钩子属植
物野生种与栽培品种之间的亲缘关系。
从图 2 可看出，结合线在 0． 1732 处黑莓品种酷
它它和宝森与其他悬钩子野生种和栽培品种分开单
独聚为一类，余下的 54 份材料在 0． 1900 处基本上
分成两大类群。
第 1 类群中，属于空心莓组的 26 个种为一个亚
类群聚在一起，其中，悬钩子野生种插田泡和毛叶插
田泡、华中悬钩子和红泡刺藤、椭圆悬钩子和椭圆悬
钩子变种栽秧泡、细瘦悬钩子和棱枝细瘦悬钩子、美
饰悬钩子和黑线美饰悬钩子、粉枝莓和刺萼悬钩子、
针刺悬钩子和线萼针刺悬钩子、三叶悬钩子和掌叶
悬钩子、直立悬钩子和山莓及红花悬钩子和红毛悬
钩子有较近的亲缘关系;另一亚类群包括木莓组、刺
毛莓组、匍匐莓组。而属于黑莓品种的乔克多、切斯
特和赫尔与空心莓组有较近的亲缘关系。
第 2 类群中，匍匐莓组中的 4 个为一个亚类群
聚在一起，而除酷它它和宝森以外的几个栽培品种
为另一亚类群聚在一起，说明除酷它它和宝森以外
的 15 个栽培品种与匍匐莓组有较近的亲缘关系。
3 讨 论
ISSＲ标记具有快捷、灵敏、稳定性好、多态性高
等优点，被广泛应用于植物种内遗传多样性［19 ～ 21］和
亲缘关系的研究中［22］。从试验结果看，ISSＲ 分子
标记适合于悬钩子属亲缘关系的研究，组间水平的
分类与形态学分类相吻合。属于空心莓组的插田泡
496 西 南 农 业 学 报 26 卷
1 ～ 56 的样品编号同表 1 和表 2
Material codes(1 － 56)are the same as the table 1 and table 2
图 2 56 份供试材料的 UPGMA聚类图
Fig． 2 Dendrogram of 56 samples using UPGMA clustering analysis
和毛叶插田泡、美饰悬钩子和黑线美饰悬钩子、细瘦
悬钩子和棱枝细瘦悬钩子、粉枝莓和刺萼悬钩子、针
刺悬钩子和线萼针刺悬钩子及匍匐莓组的委陵悬钩
子和矮生悬钩子之间有较近的种间亲缘关系，这些
分析结果基本上与俞德浚、陆玲娣等［1 ～ 2］根据形态
学特征进行悬钩子属植物分类结果相一致。遗传距
离和遗传相似系数作为种群间遗传分化程度的统计
参数，与种群的遗传分化存在着一定的对应关系。
匍匐莓组凉山悬钩子与空心莓组华中悬钩子、红泡
刺藤、椭圆悬钩子、细瘦悬钩子之间的相似系数较
小，说明草本类型和木本类型亲缘关系较远，这正好
与俞德浚和陆玲娣 ［1 ～ 2］等认为草本类型比木本类
型进化而应区别对待的观点相印证。但是，属于空
心莓组中 26 个悬钩子属植物并不是都按亚组的形
式聚在一起，如伞房序亚组的桔红悬钩子与绒毛叶
亚组的红果悬钩子、美饰悬钩子和黑线美饰悬钩子
聚在一起，这可能是由于悬钩子属植物本身存在广
泛的杂交、多倍化和无融合生殖使种间和种内分化
复杂多样的原因造成，有待进一步深入研究。
从通过 UPGMA 聚类分析构建系统树可看出，
赫尔 Hull、乔克多 Choctaw 和切斯特 Chester 与空心
莓组悬钩子的亲缘关系较近，这与张清华、王彦辉
等［22］根据黑莓类群所作研究结果相符合。秋金
Fallgold与金丰 Goldenharvest的亲缘关系最近，并与
红树莓类型的托乐米 Tulameen、米克 Meeker、哈瑞
太兹 Heritage的亲缘关系较近，这正好验证了黄树
莓类群是红树莓的变异类型。紫树莓缤纷 Ｒoyalty
与红树莓维拉米特 Willamette 和红宝玉 Boyne 的亲
缘关系较近，并与黑树莓的宝森 Boysen 和酷它它
Kotata的亲缘关系相近，原因是紫树莓是红树莓和
黑树莓的杂交种。另外，从聚类图看出，除黑莓酷它
它和宝森在聚类图中成为独立的一个组外，其他树
莓栽培品种并不与悬钩子空心莓组的亲缘关系近，
这不符合树莓栽培品种中把黑树莓、红树莓、黄树莓
和紫树莓归入空心莓亚属，而把黑莓归入实心莓亚
属的观点。王彦辉等［23］人也提到这种仅凭特征进
5962 期 杨正松等:悬钩子属野生种及品种亲缘关系的 ISSＲ分析
行分类的树莓品种的分类系统，是不考虑与野生种
的亲缘关系和系统关系而大致分类，本研究结果也
验证了这一点。
分子标记是通过多个不同的引物给出覆盖整个
基因组的多态性信息，并且直接从 DNA分子中检测
碱基序列的变化，所以分子标记比形态学标记更能
有效的对悬钩子属植物进行遗传多样性分析。但是
因为不同基因组的进化速度不一，对悬钩子属植物
的系统发育和亲缘关系的研究需要综合形态性状、
核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组的信息，才
能得到更科学的系统进化结论。
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( 责任编辑 王家银)
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