全 文 ：第 32 卷 第 2 期
2010 年 3 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol. 32，No. 2
Mar.，2010
收稿日期:2009--02--25
基金项目:教育部科学技术研究重大项目(109022)。
第一作者:郭丽琴。主要研究方向:林木遗传育种。电话:13811787315 Email:guoliqin123@163. com 地址:100083 北京市清华东路 35 号北
京林业大学 812信箱。
责任作者:张金凤，博士，教授。主要研究方向:林木分子遗传育种。电话:010--62338415 Email:zjf@ bjfu. edu. cn 地址:100083 北京市
清华东路 35 号北京林业大学生物科学与技术学院。
本刊网址:http:∥www. bjfujournal. cn;http:∥journal. bjfu. edu. cn
均匀设计优化杨属的 SRAP--PCR反应体系
郭丽琴1 卫尊征1 张金凤1 王 欢1 李 贤1 郭 军2
(1 北京林业大学林木育种国家工程实验室，林木花卉遗传育种教育部重点实验室
2 河南泌阳县马谷田镇农业服务中心)
摘要:采用均匀设计方法，对影响杨属 SRAP--PCR体系的 MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分
别进行了 U16(4
5)和 U12(3
5)两轮优化，建立了适用于杨属的 SRAP--PCR 反应体系。在 25 μL 反应体系中，MgCl2
3. 5 mmol /L、dNTPs 0. 20 mmol /L、引物 0. 44 μmol /L、TaqDNA聚合酶 1. 50 U、模板浓度 28 ng /L为最适条件。在此
基础上又对退火温度进行了摸索，结果发现，扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属 3 派 10
个种共 16 个单株的 DNA 进行扩增验证，结果获得的 DNA 条带清晰，多态性比较丰富。说明这一优化的 SRAP--
PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。
关键词:杨属;均匀设计;SRAP--PCR;扩增体系优化
中图分类号:S792. 11;S718. 46 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2010)02--0034--05
GUO Li-qin1;WEI Zun-zheng1;ZHANG Jin-feng1;WANG Huan1;LI Xian1;GUO Jun2. Optimization
of SRAP-PCR amplification system for Populus by uniform design. Journal of Beijing Forestry
University (2010)32(2)34--38［Ch，16 ref.］
1 National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest
Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education，Beijing Forestry University，100083，P. R.
China;
2 Magutian Agricultural Service Center in Biyang County，Henan Province，463721，P. R. China.
A uniform design was applied to optimize the SRAP-PCR (sequence-related amplified polymorphism-
polymerase chain reaction) system in Populus. Five factors in this SRAP-PCR， including MgCl2，
primers，dNTPs，TaqDNA polymerase and a DNA template，were tested using two uniform designs
U16(4
5)and U12(3
5). A suitable SRAP-PCR system for Populus was established. To 25 μL SRAP-PCR
amplification reaction solution，3. 5 mmol /L MgCl2，0. 20 mmol /L dNTPs，0. 44 μmol /L primer，1. 50
U TaqDNA polymerase and a 28 ng /L template were added. The annealing temperature had no clear
effect on the amplification results. By using this optimal system，genomic DNAs from 10 species of
Populus were tested and DNA bands were clear and showed high polymorphism. It suggests that the
improved SRAP-PCR system can be used to study genetic relationships，systematic evolution and genetic
diversity in Populus.
Key words Populus;uniform design;SRAP-PCR;optimization of amplification system
SRAP(sequence related amplified polymorphism)
是由美国加洲大学的 Li等［1］于 2001 年开发的一种
建立在 PCR基础上的新型分子标记系统，其主要是
根据基因中外显子、内含子及启动子碱基含量不同
的特点而设计的特异性引物进行扩增。这种新型分
子标记除具有一般分子标记所具有的诸如均匀分布
在基因组中，操作方便简单、结果稳定、成本低等相
似的优点外，还要比它们拥有更丰富的多态性和信
DOI:10.13332/j.1000-1522.2010.02.032
息量，更强大的检出效率和区分能力以及更有效地
反映历史进化信息等特点。如 Budak 等［2］通过比
较了 RAPD、SSR、ISSR 和 SRAP 4 种分子标记在野
牛草(Buchloe dactyloides)的多态性情况，发现 SRAP
具有最丰富的多态性和最强的区分能力;Riaz 等［3］
在桃(Prunus persica)和油桃(Prunus persica var.
nectarina)品 种 鉴 定 以 及 Ruiz 等［4］ 在 番 茄
(Lycopersicon esculentum)品种鉴定中，也分别证实了
SRAP要比 SSR 更具有优越性。另外，Ferriol 等［5］
通过比较南瓜(Cucurbita pepo)栽培种和野生种的
SRAP与 AFLP标记所反映的信息量，发现 SRAP 标
记的聚类结果要比 AFLP 更相似于形态学分析结
果，并且能更好地反映出南瓜的生物进化历程。目
前，SRAP标记已经广泛应用于我国的农作物［6--7］和
蔬菜［8
--10］等的遗传多样性分析、品种鉴定、遗传连锁
图的构建、指纹图谱构建以及基因克隆和定位的研
究，但对于我国林木特别是在杨树研究应用的相关
报道还相对较少。
均匀设计是由我国著名数学家方开泰和王元院
士于 1978 年共同发明的一种试验设计方法。相对
于正交设计的“均匀分散”及“整齐可比”的特点，均
匀设计只考虑试验点在试验范围内均匀散布，因而
使试验更具均匀性、代表性，可大大地减少试验次
数，现已广泛地应用于多因素、多水平的试验设计。
本试验利用均匀化设计以杨属(Populus)中小叶杨
(P. simonii)为优化对象，对其 SRAP反应体系中的
MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA 聚合酶和模板等 5 因
素进行优化分析，并对其优化体系在杨属的其他种
间进行验证。通过建立杨属基因组 DNA 的 SRAP--
PCR反应体系，从而为估计我国杨属种内和种间的
亲缘关系、系统进化和遗传多样性水平，以及它们的
保存、利用和遗传改良提供帮助。
1 材料与方法
1. 1 材 料
供试的优化体系对象为青杨派的小叶杨，产自
内蒙古通辽，于 2007 年秋取枝条后沙藏，2008 年春
季扦插于北京林业大学温室苗圃内。验证材料取自
杨属 10 个种共 16 个单株，其中包括白杨派的毛白
杨(P. tomentosa)雌雄株、山杨(P. davidiana)雌雄
株以及银白杨(P. alba)雌雄株，青杨派的冬瓜杨
(P. purdomii)、三脉青杨(P. trinervis)、青杨(P.
cathayana)雌雄株、大青杨(P. ussuriensis)雌雄株以
及藏川杨(P. szechuanica var. tibetica)，黑杨派的欧
美杨(P. × euramericana)和美洲黑杨(P. deltoides)
雌雄株。
1. 2 方 法
1. 2. 1 DNA提取及检测
取杨属不同种的幼嫩叶片用 QIAGENE 试剂盒
提取基因组 DNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
质量后，稀释至所需浓度(20 ng /L)，－ 20℃保存
备用。
1. 2. 2 SRAP--PCR反应体系的优化及检测
首先，针对 25 μL 反应体系中的 5 个因素
(MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA 聚合酶、模板)设定 4
个水平，按照 U16(4
5)均匀设计表安排试验进行第 1
轮优化，见表 1。其中，MgCl2、dNTPs和 TaqDNA聚合
酶均购自天根公司。正反向引物在参照 Li等［1］、Riaz
等［3］和 Ferriol等［5］的基础上由上海生工公司合成，
如表 2所示。随机选用其中的引物 Me1 和 Em6 组合
配对后，对小叶杨进行体系优化，试验重复 2次。
表 1 小叶杨 SRAP反应的第 1 轮均匀设计表
Tab. 1 First uniform design for P. simonii SRAP reaction system
因 素
MgCl2 /
(mmol·L－1)
dNTPs/
(mmol·L－1)
引物/
(μmol·L－1)
Taq DNA
聚合酶/U
模板/
(ng·L－1)
1 1 (1. 0) 4 (0. 36) 2 (0. 32) 2 (1. 5) 3 (40)
2 2 (2. 0) 4 (0. 36) 3 (0. 30) 3 (2. 0) 1 (20)
3 3 (3. 0) 4 (0. 36) 1 (0. 24) 4 (2. 5) 3 (40)
4 4 (4. 0) 4 (0. 36) 2 (0. 32) 1 (1. 0) 1 (20)
5 1 (1. 0) 3 (0. 28) 4 (0. 48) 2 (1. 5) 3 (40)
6 2 (2. 0) 3 (0. 28) 1 (0. 24) 4 (2. 5) 1 (20)
7 3 (3. 0) 3 (0. 28) 2 (0. 32) 1 (1. 0) 3 (40)
8 4 (4. 0) 3 (0. 28) 4 (0. 48) 2 (1. 5) 1 (20)
9 1 (1. 0) 2 (0. 20) 1 (0. 24) 3 (2. 0) 4 (50)
10 2 (2. 0) 2 (0. 20) 3 (0. 30) 4 (2. 5) 2 (30)
11 3 (3. 0) 2 (0. 20) 4 (0. 48) 1 (1. 0) 4 (50)
12 4 (4. 0) 2 (0. 20) 1 (0. 24) 3 (2. 0) 2 (30)
13 1 (1. 0) 1 (0. 12) 3 (0. 30) 4 (2. 5) 4 (50)
14 2 (2. 0) 1 (0. 12) 4 (0. 48) 1 (1. 0) 2 (30)
15 3 (3. 0) 1 (0. 12) 2 (0. 32) 2 (1. 5) 4 (50)
16 4 (4. 0) 1 (0. 12) 3 (0. 30) 3 (2. 0) 2 (30)
表 2 用于小叶杨 SRAP反应的引物及其序列
Tab. 2 Primer sequences used in SRAP reaction
system for P. simonii
编号 正向引物 编号 反向引物
Me1 5′--TGAGTCCAAACCGGATA--3′ Em1 5′ --GACTGCGTACGAATTAAT--3′
Me2 5′--TGAGTCCAAACCGGAGC--3′ Em2 5′ --GACTGCGTACGAATTTGC--3′
Me3 5′ --TGAGTCCAAACCGGAAT--3′ Em3 5′ --GACTGCGTACGAATTGAC--3′
Me4 5′ --TGAGTCCAAACCGGACC--3′ Em4 5′ --GACTGCGTACGAATTTGA--3′
Me5 5′ --TGAGTCCAAACCGGAAG--3′ Em5 5′ --GACTGCGTACGAATTAAC--3′
Me6 5′ --TGAGTCCAAACCGGTAA--3′ Em6 5′ --GACTGCGTACGAATTGCA--3′
Me7 5′ --TGAGTCCAAACCGGTCC--3′ Em7 5′ --GACTGCGTACGAATTGAG--3′
Me8 5′ --TGAGTCCAAACCGGTGC--3′ Em8 5′ --GACTGCGTACGAATTGCC--3′
Em9 5′ --GACTGCGTACGAATTTCA--3′
其次，在第 1 轮试验的基础上，筛选出优化的组
合并以此作为第 2 轮优化的依据。第 2 轮均匀设计
的因素和水平见表 3，表 3 为均匀设计表 U12(3
5)，
试验重复 2 次。
53第 2 期 郭丽琴等:均匀设计优化杨属的 SRAP--PCR反应体系
表 3 小叶杨 SRAP反应的第 2 轮均匀设计表
Tab. 3 Second uniform design for P. simonii
SRAP reaction system
因素
MgCl2 /
(mmol·L－1)
dNTPs/
(mmol·L－1)
引物/
(μmol·L－1)
TaqDNA
聚合酶/U
模板/
(ng·L－1)
1 1 (3. 0) 6 (0. 20) 8 (0. 30) 9 (2. 00) 10 (24)
2 2 (3. 5) 12 (0. 20) 3 (0. 44) 5 (1. 75) 7 (24)
3 3 (4. 0) 5 (0. 16) 11 (0. 30) 1 (1. 50) 4 (24)
4 4 (3. 0) 11 (0. 16) 6 (0. 44)10 (1. 50) 1 (24)
5 5 (3. 5) 4 (0. 12) 1 (0. 36) 6 (2. 00) 11 (28)
6 6 (4. 0) 10 (0. 12) 9 (0. 44) 2 (1. 75) 8 (28)
7 7 (3. 0) 3 (0. 20) 4 (0. 36)11 (1. 75) 5 (28)
8 8 (3. 5) 9 (0. 20) 12 (0. 44) 7 (1. 50) 2 (28)
9 9 (4. 0) 2 (0. 16) 7 (0. 36) 3 (2. 00) 12 (32)
10 10 (3. 0) 8 (0. 16) 2 (0. 30)12 (2. 00) 9 (32)
11 11 (3. 5) 1 (0. 12) 10 (0. 36) 8 (1. 75) 6 (32)
12 12 (4. 0) 7 (0. 12) 5 (0. 30) 4 (1. 50) 3 (32)
PCR扩增在 PTC--200 PCR 仪上进行。扩增程
序:94℃预变性 5 min;前 5 个循环为 94℃变性 50 s，
35℃复性 50 s，72℃延伸 90 s;后 30 个循环仅将复
性温度升为 50℃;最后 72℃延伸 10 min。于 10℃
保存。
1. 8%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，经溴化
乙锭(EB)染色后于 Gel 2000 凝胶成像系统上采集
图像。
1. 2. 3 SRAP--PCR扩增程序退火温度的优化
以第 2 轮均匀设计优化的反应体系为基础，对
小叶杨 SRAP 扩增程序中的退火温度进行筛选优
化，退火温度范围为 48 ～ 55℃，变化梯度为 1℃。
1. 2. 4 SRAP--PCR优化体系的确立和验证
根据上述均匀化试验设计所优化的小叶杨的反
应体系，用杨属的白杨派、青杨派和黑杨派的 10 个
种共 16 个单株进行验证，从而进一步确定最优的杨
属 SRAP--PCR扩增体系。
2 结果与分析
2. 1 SRAP体系的均匀优化
第 1 轮 5 因素 4 水平的均匀设计共 16 个处理
组合的 SRAP 体系的扩增结果见图 1。从图 1 可以
看出:以 Me1和 Em6组合为引物，不同因素水平组合
的 SRAP体系的扩增结果有差异;除组合 8、12、15 和
16扩增显著，10 和 14 有微弱扩增外，其他的组合完
全没有条带;而扩增明显的 4 个组合中，8 和 15 虽然
有条带，但是拖带现象比较严重，辨别困难;综合扩增
带谱的数目、强弱、清晰度和可分辨率等指标确定组
合 16是比较理想的扩增模式体系。因此，初选的 25
μL体系中包括MgCl2 4. 0 mmol /L、dNTPs 0. 12 mmol /
L、引物 0. 30 μmol /L、TaqDNA聚合酶 2. 0 U、模板 30
ng /L作为第 1轮均匀设计优化的结果。
M. 100 bp DNA ladder;1 ～ 16. 第 1 轮优化不同试验处理结果
图 1 第 1 轮均匀设计的扩增结果
Fig. 1 Amplification result of first uniform design
在第 1 轮筛选中组合 8、15 有明显的拖带现象，
其中组合 8 可能是由于 dNTPs和引物浓度较高而出
现拖带现象;组合 15 则可能因为模板浓度太高，而
且 TaqDNA 聚合酶活性的必需因子 Mg2 +浓度也较
少而出现拖带现象。所以在以最优组合 16 对应的
因素水平为基础的前提下，综合考虑，进行了第 2 轮
5 因素 3 水平的均匀设计筛选。
第 2 轮 5 因素 3 水平均匀设计共 12 个处理组
合，以 Me1 和 Em6 组合为引物 SRAP--PCR 体系的
扩增结果见图 2。通过综合比较，由图 2 可以看出，
组合 8 不但扩增条带多，而且相对较清晰。故可确
定 25 μL体系中，含 MgCl2 3. 5 mmol /L、dNTPs 0. 20
mmol /L、引物 0. 44 μmol /L、TaqDNA 聚合酶 1. 50
U、模板 28 ng /L为第 2 轮均匀设计优化结果。
M. 100 bp DNA ladder;1 ～ 12. 第 2 轮优化不同试验处理结果
图 2 第 2 轮均匀设计的扩增结果
Fig. 2 Amplification result of second uniform design
2. 2 不同退火温度对小叶杨扩增的影响
从图 3 小叶杨的扩增情况可以看出，退火温度
在 48 ～ 55℃范围内时，退火温度的变化对扩增影响
不明显。这表明在合适的扩增体系中，由于 SRAP
引物较高的通用性，解链温度大都在 50℃左右的缘
故而造成扩增情况对退火温度波动的不敏感。
M. 100 bp DNA ladder;1 ～ 8.退火温度为 48 ～ 55℃
图 3 不同退火温度对小叶杨扩增结果的影响
Fig. 3 Effect of different annealing temperatures on
SRAP-PCR amplification of P. simonii
63 北 京 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
2. 3 SRAP体系在杨属不同种间的扩增
根据上述均匀设计试验的优化结果，利用 Me1
和 Em6 的引物组合来对杨属其他种的 16 个单株的
DNA进行扩增，以进一步验证 SRAP--PCR扩增反应
体系的效果。由图 4 可以看出，引物 ME1 和 EM6
不但在 16 个单株中均能扩增出较好的谱带，而且它
们之间也存在着很明显的多态性条带。由此也说明
了所优化的扩增体系比较可靠，比较适合杨属植物
的 SRAP分析研究。
M. 100 bp DNA ladder;1 ～ 2.毛白杨雌雄;3 ～ 4.山杨雌雄;
5 ～ 6.银白杨雌雄;7.冬瓜杨;8.三脉青杨;9 ～ 10.大青杨雌雄;
11 ～ 12.青杨雌雄;13.藏川杨;14.欧美杨;
15 ～ 16.美洲黑杨雌雄
图 4 Me1 和 Em6 引物在杨属不同种间的扩增
Fig. 4 SRAP-PCR amplification profiles of different Populus
species with Me1 and Em6 primers
3 结论与讨论
3. 1 均匀设计方法的应用
均匀设计［11］是我国数学家王元和方开泰将数
论与多元统计相结合而创造的一种能解决多因素、
多水平的全新的试验设计方法。其主要是从试验的
均匀性角度出发，将试验点均匀分散在试验范围内，
然后通过建立多元回归方程来考察各因素水平与结
果之间作用关系的一种试验方法。均匀设计法与其
他的试验设计方法相比，最大的特点是大大减少了
试验次数。它不但能利用最少的试验次数来揭示出
各因素对指标的影响程度和规律，而且还能从多个
因素中找出影响试验结果的各主要因素和优化结
果，另外它还能通过建立的回归方程对最优试验条
件进行有效性预测。本试验利用均匀设计对影响
PCR扩增的 5 因素进行条件优化，仅两轮就得出较
好的扩增结果。与其他试验设计方法相比，均匀设
计很明显大大减少了试验次数，这充分体现出了它
能利用较少的试验次数就可以解决问题的优越性。
然而，我们虽然获取了优化结果，但其实只是优
化的组合。虽然优化组合的结果也可用，但是对于
均匀设计的主要功能，如建立有效的回归方程模型
从而对主次影响因素排序、优化结果预报等内容，却
由于试验结果不易量化［12］以及 PCR 扩增体系中各
因素间的复杂性［13］等问题而不能得到应用。其实
对试验结果量化已经不是一个主要问题，这在正交
试验设计中已经实现。陈万胜等［14］和关桦楠等［15］
在对烟草 (Nicotiana tabacum)和瓢虫(Harmonia
axyridis)的 SRAP 体系优化中依据扩增条带的数目
多少、清晰度、强弱等指标分别赋予相对数值后，通
过方差分析得出了相应的最适宜的扩增条件。而
PCR扩增因素间的复杂性则显然是制约建立均匀
统计分析回归方程的最主要原因。通过对前人利用
均匀设计优化 PCR体系的研究发现［12，16］，他们都不
能建立有效的回归方程模型而仅能得到优化的组
合。因此，我们认为只有清楚地认识 PCR扩增体系
中各因素的相互作用，依据这种专业知识选择并建
立起有效的回归方程模型，才能够更充分地发挥出
均匀设计方法以最少的试验次数达到最好的优化试
验结果的优越性。
3. 2 影响 SRAP--PCR扩增因素的分析
Mg2 +浓度、dNTPs、引物、TaqDNA 聚合酶、模板
等是影响 PCR 扩增的 5 个主要因素［13］，其中任何
单个因素浓度的增加或减少都会对扩增结果造成重
要影响，因此寻求各因素的最佳配比就成为 SRAP
标记体系建立及应用的首要任务。到目前，我国建
立了多个物种如农作物、果树、蔬菜等的 SRAP 体
系，其中 MgCl2 浓度范围为 1. 5 ～ 4. 0 mmol /L，
dNTPs 为 0. 1 ～ 0. 25 mmol /L，引物为 0. 15 ～ 0. 4
μmol /L，TaqDNA 聚合酶为 1. 0 ～ 1. 5 U，模板为
15 ～ 100 ng /L。这表明了由于物种基因组的不同，
PCR体系中各因素的最佳用量也不同。本试验在
总结前人研究的基础上，利用均匀设计对影响小叶
杨 PCR扩增的 5 个因素分别进行了 4 水平和 3 水
平两轮优化试验，通过比较最终确定 25 μL 反应体
系中包含MgCl23. 5 mmol /L、dNTPs 0. 20 mmol /L、引
物 0. 44 μmol /L、TaqDNA 聚合酶 1. 50 U、模板 28
ng /L为最优体系。与前人试验结果相比，本试验的
MgCl2、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、模板等 4 个因素的
浓度变化均在前人研究变化范围之内，说明了两者
研究结果相吻合;但同时我们也发现，引物浓度的变
化却存在着一定的差异，这也正说明了植物基因组
间的差异性导致扩增体系的不同。
退火温度的高低决定着引物与靶 DNA 上位点
结合的难易程度。较低的退火温度有利于两者结
合，但也非常容易发生非特异性扩增;而较高的退火
温度虽然不容易产生非特异性扩增，却会导致引物
和模板结合困难从而使扩增效率显著降低。因此退
火温度也是 PCR体系优化的关键环节。对于 SRAP
的扩增程序常用的有 2 种:一种由 Li等［1］建立，前 5
73第 2 期 郭丽琴等:均匀设计优化杨属的 SRAP--PCR反应体系
个循环的退火温度较低(35℃左右)，后 30 个循环
再升到 50℃左右;另一种由 Budak 等［2］所提出，整
个反应过程退火温度一直保持 47℃。目前最常用
的扩增程序为第一种。主要是因为前 5 个循环复性
温度为 35℃左右，较低的退火温度确保引物与靶
DNA结合，而后又将温度升高到 50℃左右，从而保
证了扩增片段的重复性和稳定性。本试验采用第一
种扩增程序，并在此基础上对后 30 个循环的退火温
度进行了梯度试验。通过比较结果发现 SRAP 扩增
对退火温度变化不敏感，这与王燕等［8］研究结果相
同。但是也有研究结果［14］表明，不同退火温度的扩
增效果还是有差别的。究其原因可能是由于不同物
种的最适扩增体系及程序对解链温度改变的承受能
力不同而造成的。
致谢 本研究得到长江学者专项基金的资助，特此致谢。
参 考 文 献
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(责任编辑 董晓燕)
83 北 京 林 业 大 学 学 报 第 32 卷