全 文 ：第３８卷 第１２期
２０１０年１２月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．３８ Ｎｏ．１２
Ｄｅｃ．２０１０
柿属植物种质资源遗传多样性的ＳＳＲ分析
＊?
耿 攀，阮小凤，杨 勇，赵红星
（西北农林科技大学 园艺学院，陕西 杨凌７１２１００）
［摘 要］ 【目的】用ＳＳＲ标记分析柿属植物种质资源的遗传多样性，为其有效利用提供依据。【方法】以７个
柿种或变种的４８份材料为研究对象，利用３０对ＳＳＲ标记对其进行遗传多样性分析。采用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ ２．１０ｅ分析软
件对ＳＳＲ数据进行聚类分析。【结果】共检测到８３个等位基因，每对ＳＳＲ引物检测到３～６个等位基因变异，平均为
４．９个。供试柿品种间的遗传相似系数介于０．３９７～１．０００，平均为０．６９８，范围较大，说明柿资源种类较多、来源较广
泛、遗传多样性较丰富。４８份柿材料在相似系数为０．６６水平上分为４大类，第Ⅰ类包括浙江柿和５个美洲柿及１个
柿品种；第Ⅱ类只有２个资源，即油柿和野柿；第Ⅲ类为柿种下的大部分柿品种（２７个）；第Ⅳ类包括２个有核君迁子、
３个无核君迁子、２个野柿、３个金枣柿及２个柿种下的品种；不同种类的柿种质资源基本分别聚在一起。同一种类下
的不同类型也能区分开来。【结论】ＳＳＲ标记是研究柿种质资源遗传多样性的有效手段。
［关键词］ 柿属植物；种质资源；ＳＳＲ标记；遗传多样性
［中图分类号］ Ｓ１８８；Ｓ６６５．２０２．４ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７１－９３８７（２０１０）１２－０１９０－０７
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｓｐｐ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ
ＧＥＮＧ Ｐａｎ，ＲＵＡＮ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｙｏｎｇ，ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ－ｘｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｓｐｐ ｇｅｒｍｐｌｅａｓｍ ｒｅ－
ｓｏｕｒｃｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．【Ｍｅｔｈｏｄ】４８ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｃｃｅｓ－
ｓｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｒ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｎｄ ３０ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉ－
ｔｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅｍ，ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｄｏｎｅ ｕｓｉｎｇ ＮＴｓｙｓ－ｐｃ２．１０ｅ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ａ ｔｏｔａｌ
ｏｆ ８３ａｌｅｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ ４．９ａｌｅｌｅｓ ｌｏｃｕｓ（ｒａｎｇｅ ３－６）．Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｇｅ－
ｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｎｇｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ０．３９７－１．０００，ａｖｅｒａｇｉｎｇ ０．６９８，ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅｒ ｒａｎｇｅ，ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｓ
ｍｏｒｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎｓ，ｂｒｏａｄｅｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄ ｒｉｃｈｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．４８Ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ
ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ ４ｇｒｏｕｐｓ．ＧｒｏｕｐｓⅠｉｎｃｌｕｄｅ ａ Ｄ．ｇｌａｕｃｉｆｏｌｉａ，ｆｉｖｅ Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ ａｎｄ ｏｎｅ Ｄ．ｋａｋｉ．
ＧｒｏｕｐⅡｊｕｓｔ ｈａｓ ｔｗｏ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ：ａＤ．ｏｌｉｆｅｒａａｎｄ ａ Ｄ．ｋａｋｉ．ｖａｒ．ｍｏｓｔ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ（２７）ａｒｅ ｉｎ ｇｒｏｕｐ
Ⅲ．ＧｒｏｕｐｓⅣｉｎｃｌｕｄｅ ２ Ｄ．ｌｏｔｕｓ ｗｉｔｈ ｓｅｅｄｓ，３ｓｅｅｄｌｅｓｓ Ｄ．ｌｏｔｕｓ，２ Ｄ．ｋａｋｉ．ｖａｒ．３Ｊｉｎｚａｏｓｈｉ ａｎｄ ２ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ
Ｄ．ｋａｋｉ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｉｎ ｉｎｔｒａ－ｓｐｅｃｉｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉ－
ｎａｔｅｄ ｂｙ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｏ ｕｓｅ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｇｅｒｍ－
ｐｌａｓｍ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｕｓｉｎｇ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｓ ａｎ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐｅｒｓｉｍ－
ｍｏｎ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｓｐｐ；ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ；ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
＊ ［收稿日期］ ２０１０－０５－０６
［基金项目］ 国家科技基础条件平台工作子项目（２００５ＤＫＡ２１００２－２２）
［作者简介］ 耿 攀（１９８３－），男，陕西临潼人，在读硕士，主要从事分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｎｇｐａｎ２００８＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
［通信作者］ 杨 勇（１９６４－），男，陕西宝鸡人，副教授，硕士，主要从事柿种质资源的鉴定与评价研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇ＿ｙｏｎｇ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
柿（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｋａｋｉ Ｔｈｕｎｂ．）系柿树科（Ｅｂｅｎ－
ａｃｅａｅ）柿属（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ Ｌ．）植物。中国柿属植物资
源十分丰富，有５８个种和变种［１］，其中作为果树利
用的有柿、油柿、君迁子、浙江柿等［２］。我国丰富多
样的柿资源，为其遗传改良和新品种培育提供了充
足的材料。
国家柿种质资源圃收集了国内外的柿属种及种
下大量的柿品种，前人对其生物学性状进行了系统
地鉴定和描述，认为其性状具有丰富的遗传多样
性［３－４］。但由于柿品种多是由自然界多年的实生体
通过人为选择性状固定后嫁接无性繁殖而保留下来
的，所以对其系谱及遗传背景不是很清楚，不同地区
的柿属种和柿地方品种之间的亲缘关系也不明确。
近年来，从ＤＮＡ水平揭示种间差异的多种分
子标记技术（如 ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＲ、ＳＮＰ
等），在农作物中得到了广泛应用，其中ＳＳＲ以其简
便、稳定、多态性和共显性遗传等特点，被广泛应用
于农作物的品种鉴定、亲缘关系分析及种质起源与
进化研究中［５－１０］。ＳＳＲ分子标记在柿属植物上的应
用才刚刚起步［１１－１３］，研究的柿资源数量不多，对一些
种的种下类型涉及较少。为此，本试验以柿属７个
种或变种为研究对象（每个种下都有数量不等的基
因型），采用ＳＳＲ分子标记方法，对其亲缘关系及遗
传多样性进行了分析，以期为更加有效地利用这些
种质资源提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材 料
１．１．１ 植物材料 选择柿属植物的４８份材料为研
究对象，其分属于柿属的７个种或变种，其中有浙江
柿（Ｄ．ｇｌａｕｃｉｆｏｌｉａ）１个、美洲柿（Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ）５个
类型、君迁子（Ｄ．ｌｏｔｕｓ）５个类型、野柿（Ｄ．ｋａｋｉ．
ｖａｒ．）３个、油柿（Ｄ．ｏｌｉｆｅｒａ）１个、金枣柿（Ｄ．ｓｐ．）３
个及柿（Ｄ．ｋａｋｉ）的３０个不同品种（表１）。所有材
料均采自西北农林科技大学国家柿种质资源圃的活
体柿树标本，采摘春季刚发的嫩芽，置于加有变色硅
胶的塑料袋中，使芽充分脱水干燥后，置冰箱冷藏室
备用。
表１ ４８份柿材料的编号及名称
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｄｅ ａｎｄ ｎａｍｅ ｏｆ ４８Ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｔｒｅｅｓ
编号
Ｃｏｄｅ
名称
Ｎａｍｅ
原产地
Ｏｒｉｇｉｎ
编号
Ｃｏｄｅ
名称
Ｎａｍｅ
原产地
Ｏｒｉｇｉｎ
１ 浙江柿Ｄ．ｇｌａｕｃｉｆｏｌｉａ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ２５ 博爱杂样景Ｂｏａｉ ｚａｙａｎｇｊｉｎｇ 河南博爱Ｂｏａｉ，Ｈｅ’ｎａｎ
２ 美洲柿Ｖｍ１０ Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ 以色列Ｉｓｒａｅｌ ２６ 次郎Ｊｉｒｏ 日本Ｊａｐａｎ
３ 美洲柿Ｖｚ１ Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ 以色列Ｉｓｒａｅｌ ２７ 前川次郎 Ｍａｅｋａｗａｊｉｒｏ 日本Ｊａｐａｎ
４ 美洲柿ＶＡ１ Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ 以色列Ｉｓｒａｅｌ ２８ 若杉系次郎 Ｗａｋａｓｕｇｉｋｅｉｊｉｒｏ 日本Ｊａｐａｎ
５ 美洲柿ＶＦ８ Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ 以色列Ｉｓｒａｅｌ ２９ 大次郎Ｂｉｇ ｊｉｒｏ 日本Ｊａｐａｎ
６ 美洲柿ＶＦ６ Ｄ．ｖａｇｉｎｉａｎａ 以色列Ｉｓｒａｅｌ ３０ 韩国太安柿 Ｔａｉａｎｓｈｉ 韩国 Ｋｏｒｅａ
７ 君迁子雄０４ Ｄ．ｌｏｔｕｓ 陕西眉县 Ｍｅｉｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ３１ 甜宝盖 Ｔｉａｎｂａｏｇａｉ 湖北罗田Ｌｕｏｔｉａｎ，Ｈｕｂｅｉ
８ 君迁子雌１６ Ｄ．ｌｏｔｕｓ 陕西眉县 Ｍｅｉｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ３２ 小果甜柿 Ｘｉａｏｇｕｏｔｉａｎｓｈｉ 湖北罗田Ｌｕｏｔｉａｎ，Ｈｕｂｅｉ
９ 赞长无核Ｄ．ｌｏｔｕｓ 河北赞皇Ｚａｎｈｕａｎｇ，Ｈｅｂｅｉ ３３ 百战甜柿Ｂａｉｚｈａｎ ｔｉａｎｓｈｉ 河南商城Ｓｈａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｈｅ’ｎａｎ
１０ 涉长无核Ｄ．ｌｏｔｕｓ 河北涉县Ｓｈｅｘｉａｎ，Ｈｅｂｅｉ ３４ 无核托柿 Ｗｕｈｅｔｕｏｓｈｉ 山东平度Ｐｉｎｇｄｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ
１１ 石岗无核Ｄ．ｌｏｔｕｓ 河北涉县Ｓｈｅｘｉａｎ，Ｈｅｂｅｉ ３５ 中华巨柿Ｚｈｏｎｇｈｕａｊｕｓｈｉ 山东平度Ｐｉｎｇｄｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ
１２ 野柿－０２Ｙｅｓｈｉ－０２ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３６ 平核无 Ｈｉｒａｔａｎｅｎａｓｈｉ 日本Ｊａｐａｎ
１３ 野柿－０１Ｙｅｓｈｉ－０１ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３７ 刀根早生 Ｄｏｇｅｎｗａｓｅ 日本Ｊａｐａｎ
１４ 百战野柿－０５Ｙｅｓｈｉ－０５ 河南商城Ｓｈａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｈｅ’ｎａｎ ３８ 禅寺丸Ｚｅｎｊｉｍａｒｕ 日本Ｊａｐａｎ
１５ 油柿－０１ Ｄ．ｏｌｉｆｅｒａ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３９ 西村早生 Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｗａｓｅ 日本Ｊａｐａｎ
１６ 金枣柿－０１Ｊｉｎｚａｏｓｈｉ－０１ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ４０
洛阳七月早
Ｌｕｏｙａｎｇ ｑｉｙｕｅｚａｏ
河南洛阳
Ｌｕｏｙａｎｇ，Ｈｅ’ｎａｎ
１７ 金枣柿－０２Ｊｉｎｚａｏｓｈｉ－０２ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ４１ 大荔柿饼柿 Ｄａｌｉ ｓｈｉｂｉｎｇｓｈｉ 陕西大荔 Ｄａｌｉ，Ｓｈａａｎｘｉ
１８ 金枣柿－０３Ｊｉｎｚａｏｓｈｉ－０３ 浙江Ｚｈｅｊｉａｎｇ ４２ 永济胎里红 Ｙｏｎｇｊｉｔａｉｌｉｈｏｎｇ 山西永济 Ｙｏｎｇｊｉ，Ｓｈａｎｘｉ
１９ 河西火罐 Ｈｅｘｉｈｕｏｇｕａｎ 陕西眉县 Ｍｅｉｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ４３
洛阳绕天红
Ｌｕｏｙａｎｇｒａｏｔｉａｎｈｏｎｇ
河南洛阳
Ｌｕｏｙａｎｇ，Ｈｅ’ｎａｎ
２０ 朱罐罐Ｚｈｕｇｕａｎｇｕａｎ 山西Ｓｈａｎｘｉ ４４
长安王后柿
Ｃｈａｎｇ’ａｎ ｗａｎｇｈｏｕｓｈｉ
陕西长安
Ｃｈａｎｇ’ａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ
２１ 蜜蜜罐 Ｍｉｍｉｇｕａｎ 河南洛阳Ｌｕｏｙａｎｇ，Ｈｅ’ｎａｎ ４５
长安怀抱月
Ｃｈａｎｇ’ａｎ ｈｕａｉｂａｏｙｕｅ
陕西长安
Ｃｈａｎｇ’ａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ
２２ 圃杂１号Ｐｕｚａ０１ 陕西眉县 Ｍｅｉｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ４６ 洋县壶平柿 Ｙａｎｇｘｉａｎ ｈｕｐｉｎｇｓｈｉ陕西洋县 Ｙａｎｇｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ
２３ 圃杂２号Ｐｕｚａ０２ 陕西眉县 Ｍｅｉｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ４７
潮阳元宵柿
Ｃｈａｏｙａｎｇｙｕａｎｘｉａｏｓｈｉ
广东 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ
２４ 圃杂３号Ｐｕｚａ０３ 陕西眉县 Ｍｅｉｘｉａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ４８
诏安元宵柿
Ｚｈａｏａｎ ｙｕａｎｘｉａｏｓｈｉ
福建诏安Ｚｈａｏａｎ，Ｆｕｊｉａｎ
１９１第１２期 耿 攀，等：柿属植物种质资源遗传多样性的ＳＳＲ分析
１．１．２ 试剂与仪器 Ｔｒｉｓ、ＣＴＡＢ、ＥＤＴＡＮａ２、
ＰＶＰ、ＡＰＳ、Ｕｒｅａ、ＴＥＭＥＤ、氯仿、异戊醇、乙醇、甲
酰胺、溴酚蓝和ＡｇＮＯ３，均购自听泰生物科技公司；
ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ、Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ、ｄＮＴＰｓ、ＲＮａｓｅ Ａ和琼脂
糖，均购自宝生物工程有限公司。ＰＣＲ在 Ｅｐｐｅｎ－
ｄｏｒｆ ＰＣＲ仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ ２２３３１Ｈａｍｂｕｒｇ）上完
成。聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的电泳仪（ＪＹ－５０００
型）和电泳槽（ＪＹ－ＣＸ２ＢＳＥＵＣＥＲＥＩＮＧ）均购自北
京君意东方电泳设备有限公司。
１．１．３ 引 物 表２中的 ｍＤＰ系列引物，是根据
阮小凤等［１４］登录到 ＧｅｎＢａｎｋ上的微卫星序列，采
用Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ５软件设计的；ｓｓｒＤｋ系列引物
引自文献［１５］。引物由上海生物工程公司合成。
表２ ＳＳＲ引物及其特征
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ
引物名称／基因库编号
Ｎａｍｅ／ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
上游引物（５′→３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ
下游引物（５′→３′）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
退火温度／℃
Ｔｍ
扩增产物
长度／ｂｐ
Ｓｉｚｅ
ｍＤＰ０８／ＥＦ５６７４０３ ＴＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＡＴＡＧ ＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣ ５２ ２９２
ｍＤＰ０９／ＥＦ５６７４０４ ＡＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣ ＣＣＡＴＡＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴ ５５ １１６
ｍＤＰ１３／ＥＦ５６７４０６ ＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＣＡＧＴＴＧＧＧ ＴＴＧＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＧ ５５ ２５０
ｍＤＰ１５／ＥＦ５６７４０８ ＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＡＴＡＣ ＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴ ５０ １１６
ｍＤＰ１６／ＥＦ５６７４０９ ＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣ ＧＴＡＡＡＧＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＧ ５５ １４０
ｍＤＰ１７／ＥＦ５６７４１０ ＣＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＧＡＡＧＣＣＡＡＴ ＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴ ５３ １３８
ｍＤＰ１８／ＥＦ５６７４１１ ＴＡＣＴＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＣ ＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡ ５５ ２５２
ｍＤＰ１９／ＥＦ５６７４１２ ＴＣＡＡＴＣＴＣＡＣＡＴＡＧＴＡＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡ ＴＧＡＣＴＡＴＧＧＧＧＧＴＣＣＡＣＴＴＣ ４８ ２６１
ｍＤＰ２０／ＥＦ５６７４１３ ＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧ ＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＣＣ ５７ ２０４
ｍＤＰ２１／ＥＦ５６７４１４ ＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＴＣ ＡＧＴＣＧＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＡＧＣ ５５ ２１５
ｓｓｒＤＫ１１ ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＧＴＴＣＣＡＴＴＧ ＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＣ ６０ １６１
ｓｓｒＤＫ１３ ＧＴＡＡＴＴＡＧＣＴＡＡＧＡＣＴＴＡＡＧＧＧＧ ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＣ ５３ １４１
ｓｓｒＤＫ２６ ＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡ ＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡＡ ５５ １６０
ｓｓｒＤＫ２９ ＡＴＣＡＴＧＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＣＧＴＣ ＣＡＣＧＴＴＡＡＣＧＴＴＡＣＧＧＡＡＣＡ ５７ １３１
ｓｓｒＤＫ３０ ＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴ ＧＧＣＣＴＡＡＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣＣ ５８ １５７
ｓｓｒＤＫ３３ ＡＣＡＧＧＧＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＴＧＡＣ ＧＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴ ６０ ２４０
ｓｓｒＤＫ３６ ＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧ ＡＣＧＡＡＧＴＴＧＴＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣ ５４ ２２７
１．２ 试验方法
１．２．１ ＤＮＡ的提取与分离 按罗正荣等［１６］的方
法提取供试样品基因组ＤＮＡ，用紫外分光光度法和
琼脂糖凝胶电泳法检测ＤＮＡ品质。提取的每份资
源的ＤＮＡ原液置于－２０℃冰箱保存，ＰＣＲ时取少
量原液稀释至２５ｎｇ／μＬ，备用。
１．２．２ ＰＣＲ扩增及电泳 ＰＣＲ扩增在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ
ＰＣＲ仪上进行。ＰＣＲ反应体系为２０μＬ，其中包括
１μＬ ５０ｎｇ／μＬ模板ＤＮＡ，０．２μＬ ５Ｕ／μＬ ＴａＫａＲａ
Ｔａｑ酶，２μＬ １０×ｂｕｆｆｅｒ，１．５μＬ ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２，０．４μＬ １０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１μＬ １０ｐｍｏｌ／Ｌ
ＳＳＲ Ｐｒｉｍｅｒ，１３．９μＬ ｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ反应程序为：９４
℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，退火１ｍｉｎ（退火
温度依引物而定），７２℃延伸２ｍｉｎ，３５个循环；７２
℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。扩增产物用１２０ｇ／Ｌ聚丙
烯酰胺变性凝胶在１ ６００Ｖ电压下电泳分离，银染
法显色［１７］。
１．２．３ 数据统计分析 选择扩增条带清晰且有多
态性的ＳＳＲ标记进行数据统计，假定胶上迁移率相
同的条带均来自同一位点上的同一等位基因。对每
个样品的扩增电泳谱带进行统计，有带记为１，无带
记为０，组成１和０的原始矩阵。利用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ
２．１０ｅ软件，按简单匹配系数ＳＭ 计算品种间的遗
传相似系数（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，ＧＳ），获得相似系数
矩阵。用ＳＨＡＮ程序中的非加权对群数学平均法
（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎｓ，ＵＰ－
ＧＭＡ）进行聚类分析，并通过 Ｔｒｅｅ ｐｌｏｔ模块生成聚
类图。
２ 结果与分析
２．１ ＳＳＲ引物的筛选
用部分柿资源对ＳＳＲ引物进行筛选，其中有１７
对引物的扩增谱带清晰且重复性好。再用这１７对
引物对所有４８份柿材料进行扩增，结果见表３。由
表３可见，１７对引物的扩增总带数为９１条，其中８３
条具有多态性，多态性百分率达９１．２％；扩增片段
长度在１００～３００ｂｐ；单引物对可扩增出１～９条谱
带，平均为 ４．９条，多态位点百分率为６０％～
１００％；不同引物组合的种质鉴定能力差异较大，图
１为ｓｓｒＤＫ３６引物组合对４８份柿材料的扩增电泳
２９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３８卷
图谱。
表３ １７对ＳＳＲ引物产生的谱带信息
Ｔａｂｌｅ ３ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｂａｎｄｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ １７ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ
引物名称／
基因库编号
Ｐｒｉｍｅｒ／ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
条带数
Ｎｏ．ｏｆ ｂａｎｄｓ
多态性带数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性
百分率／％
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
引物名称／
基因库编号
Ｐｒｉｍｅｒ／ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
条带数
Ｎｏ．ｏｆ ｂａｎｄｓ
多态性带数
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性
百分率／％
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
ｍＤＰ０８／ＥＦ５６７４０３ ５ ３ ６０．０ ｍＤＰ２１／ＥＦ５６７４１４ ５ ３ ６０．０
ｍＤＰ０９／ＥＦ５６７４０４ ５ ５ １００．０ ｓｓｒＤＫ１１ ５ ５ １００．０
ｍＤＰ１３／ＥＦ５６７４０６ ６ ６ １００．０ ｓｓｒＤＫ１３ ５ ５ １００．０
ｍＤＰ１５／ＥＦ５６７４０８ ３ ３ １００．０ ｓｓｒＤＫ２６ １ １ １００．０
ｍＤＰ１６／ＥＦ５６７４０９ ６ ５ ８３．３ ｓｓｒＤＫ３０ ６ ５ ７５．０
ｍＤＰ１７／ＥＦ５６７４１０ ９ ９ １００．０ ｓｓｒＤＫ２９ ３ ３ １００．０
ｍＤＰ１８／ＥＦ５６７４１１ ９ ９ １００．０ ｓｓｒＤＫ３３ ５ ５ １００．０
ｍＤＰ１９／ＥＦ５６７４１２ ８ ６ ７５．０ ｓｓｒＤＫ３６ ５ ５ １００．０
ｍＤＰ２０／ＥＦ５６７４１３ ５ ５ １００．０ 总带数Ｔｏｔａｌ ｂａｎｄｓ ９１ ８３ ９１．２
图１ ｓｓｒＤＫ３６引物组合对供试的４８份柿材料基因型的ＳＳＲ扩增谱带
１～４８条带分别对应１～４８号柿材料，下图同
Ｆｉｇ．１ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｓｒＤＫ３６ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ４８ Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｓｐｐ
１－４８ｌａｎｅｓ ｉｓ １－４８ｓａｍｐｌｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｆｏｌｗｉｎｇ ｆｉｇｕｒｅ ｉｓ ｓａｍｅ
２．２ ４８份柿材料的遗传相似性分析
利用 ＮＴＳＹＳ－ｐｃ ２．１０ｅ分析软件，根据扩增的
８３条多态性条带计算４８份柿材料间的遗传相似系
数，并进行遗传聚类分析。结果表明，供试品种间的
遗传相似系数为０．３９７～１．０００，平均为０．６９８，其中
美洲柿ＶＡ１和野柿－０１间的遗传相似系数最小，为
０．３９７，说明美洲柿与来自我国浙江的野柿变种亲
缘关系最远；金枣柿－０１与金枣柿－０３、金枣柿－０２间
的遗传相似系数分别达到１．０００和０．９８８，金枣柿－
０２与金枣柿－０３间的遗传相似系数为０．９８８，说明不
同来源的金枣柿种内无差异或差异极小；赞长无核
和石岗无核２个品种间的遗传相似系数达到０．９７６，
说明这２个无核君迁子的遗传背景相似。
２．３ ４８份柿材料的聚类分析
利用１７对ＳＳＲ引物得出的电泳谱带数据进行
聚类分析，结果见图２。由图２可以看出，４８份柿材
料在相似系数为０．６６时可聚为４大类：第Ⅰ类包括
浙江柿、５个美洲柿及１个柿品种；第Ⅱ类只有２个
资源，１个为油柿，１个为野柿；第Ⅲ类包括２７个柿
品种；第Ⅳ类包括２个有核君迁子、３个无核君迁
子、２个野柿、３个金枣柿及２个柿品种。第Ⅰ类中，
来自同一个地区的５个美洲柿单株被聚在一起，相
似系数达０．８，说明其种内的差异很小；浙江柿与美
洲柿聚在一起，推测这２个种之间的亲缘关系较近。
第Ⅱ类中，油柿与１个野柿在相似系数为０．７０水平
上聚在一起，说明野柿与油柿可能来源于同一祖先。
第Ⅳ类中，君迁子、野柿、金枣柿及２个柿品种等在
相似系数为０．７０水平上聚为一类，说明这几个种之
间有一定的亲缘关系，其中３个金枣柿首先聚为一
类，然后与２个野柿相聚；３个无核君迁子在相似系
数为０．９６水平上聚为一类后，在０．７８相似水平上
与金枣柿和野柿相聚。
３ 讨 论
３．１ 柿属植物种质资源 ＳＳＲ标记的遗传多样性
分析
对于植物种以下水平的研究，必须选择灵敏的
分子标记才能提供足够的遗传信息，而且获得的信
息应具有重复性好、多态性高、稳定可靠等优点。
ＳＳＲ标记具有丰富的遗传多态性和较高的信息含
３９１第１２期 耿 攀，等：柿属植物种质资源遗传多样性的ＳＳＲ分析
量，在种质资源分析中表现出更大的优势，是符合上
述要求的分子标记之一。
本研究利用ＳＳＲ引物对柿属植物进行遗传多
样性分析，结果共检测到８３个等位基因，每对ＳＳＲ
引物可检测到３～６个等位基因变异，平均为４．９
个。由此可见，所选用的４８份柿材料的ＳＳＲ多态
性较丰富。本试验所用的材料是具有代表性的柿种
质，研究结果表明柿种质资源的遗传多样性相对较
丰富。究其原因，一是所选取的柿种质地理多样性
较为丰富，包含以色列、日本、韩国及中国的不同地
区，大多数柿品种的亲缘关系较远；二是所选４８份
柿品种的形态学差异较大，包括浙江柿、美洲柿、君
迁子、野柿和油柿等多个品种。
图２ 基于ＳＳＲ分析的４８份柿材料的聚类结果
Ｆｉｇ．２ ＵＰＧＭＡ ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ ４８ Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ ｂｒｅｅｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ
３．２ 柿属植物种质资源之间的亲缘关系分析
ＳＳＲ标记是继 ＲＡＰＤ 标记后出现的重要的
ＤＮＡ标记技术之一，具有稳定性好、多态性高、共显
性、引物特异性强等特点［１８］。近年来，ＳＳＲ技术作
为一种成熟的分子标记，已被广泛用于果树的遗传
多样性研究中。葛志刚等［１９］用２４对ＳＳＲ引物将
４７份桃品种区分开，且ＳＳＲ分析结果与品种间的系
谱关系基本吻合。王丽侠等［２０］选用５１对ＳＳＲ引物
对国内外１４５份小豆材料进行多样性评价，并分析
了中国小豆种质资源间的遗传关系和遗传结构。本
试验用１７对ＳＳＲ引物将４８份柿品种区分开，且
ＳＳＲ分析结果与品种间的系谱关系基本吻合，尤其
４９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第３８卷
是可将其中的次郎品种及其芽变品种，如前川次郎
（Ｍａｅｋａｗａｊｉｒｏ）、若杉系次郎（Ｗａｋａｓｕｇｉｋｅｉｊｉｒｏ）、大
次郎（Ｂｉｇ ｊｉｒｏ）及韩国太安柿（Ｔａｉａｎｓｈｉ）区分开，说
明ＳＳＲ技术是柿品种鉴定的有效手段。
利用ＳＳＲ分子标记方法对４８份柿材料进行遗传
多样性分析，结果发现，供试品种间的遗传相似系数
介于０．３９７～１．０００，范围较大，说明柿资源种类较多，
来源较广泛，遗传多样性较丰富。大部分具有亲缘关
系的品种及形态学、生物学特征相近的品种聚为一
类，说明聚类分析结果与系谱及其生物学特征相符。
但从聚类结果来看，与实际情况仍有一定偏差，其原
因可能是ＳＳＲ分子标记作为分析遗传多样性的工具，
仍然存在着很大的局限性，如某些位点，特别是功能
基因内位点发生的碱基缺失、插入或替换等，都可能
直接导致表型性状的变异，这些等位基因的差异可能
只有１～２个碱基，而这种微小的遗传变异往往在
ＳＳＲ分析中很难得到准确反映。
ＳＳＲ技术是直接对基因组ＤＮＡ进行检测，既
克服了同工酶位点偏少的缺点，又避免了ＲＦＬＰ技
术复杂的弊病，同时还基本排除了环境条件对基因
型的修饰，因此ＳＳＲ技术将在果树品种鉴定和亲缘
关系研究中得到更广泛的应用。但ＳＳＲ 标记并不
代表基因，ＳＳＲ位点差异不代表亲本间基因组合的
差异，因此根据ＳＳＲ标记进行聚类分析和遗传多样
性评价，其结果的实际价值在某种程度上依赖于对
标记引物的选择（引物种类、数量以及在基因组中的
分布）。本研究结果中，个别柿种下的品种与其他种
关系较远但却聚为一类，其原因可能由于标记本身
及引物种类、数量有限所致。因此，用ＳＳＲ 标记分
析柿资源遗传多样性时，应选用大量的ＳＳＲ 引物，
或者利用多种标记相结合的方式进行研究，以更加
真实地反映柿资源的遗传多样性或亲缘关系。
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