全 文 ：江西农业大学学报　2010, 32(2):0368-0372 htp://xuebao.jxau.edu.cn
ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis E-mail:ndxb7775@sina.com
内切酶接头引物对柿属
SSAP分子标记扩增的影响
杜晓云1, 2 ,黄建民 1 ,张青林 2 ,罗正荣 2＊
　　(1.江西省农业科学院 园艺研究所 , 江西 南昌 330200;2.华中农业大学 园艺植物生物学教育部重点实验室 ,湖
北 武汉 430070)
摘要:SSAP(sequence-specificamplificationpolymorphism, 序列特异扩增多态性)是种质遗传多样性分析和系统
进化研究的有力工具之一。根据 10个 SSAP引物组合对 28份柿属基因型的扩增结果探讨内切酶因素对 SSAP
逆转座子分子标记扩增的影响。结果表明 , 在以 MseI和 EcoRI组合消化的 SSAP反应系统 , 且均以 3个碱基
作为末端选择性碱基的前提下 , MseI与逆转座子引物组合的 SSAP扩增性能优于 EcoRI与逆转座子引物组
合。研究结果为有目的和高效选择内切酶引物进行植物种质资源 SSAP分析提供参考。
关键词:柿;逆转座子;SSAP分子标记
中图分类号:S665.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2286(2010)02-0368-05
InfluenceofRestrictionEndonucleaseonthePerformanceof
Retrotransposon-basedSSAPAmplificationinDiospyrosspp.
DUXiao-yun1, 2 , HUANGJian-min1 , ZHANGQing-lin2 , LUOZheng-rong2＊
　　(1.InstituteofHorticulturalSciences, JiangxiAcademyofAgriculturalSciences, Nanchang330200, Chi-
na;2.KeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyAfiliatedtoMinistryofEducation, HuazhongAgricultural
University, Wuhan430070, China)
　　Abstract:SSAP(Sequence-SpecificAmplificationPolymorphism)molecularmarkerhasproventobe
highlyeficientinestimatinggeneticdiversityanddeterminingphylogeneticrelationshipsinplant.Basedon
theresultofSSAPmoleculardataderivedfrom10primercombinationson28Diospyrosspp., theinfluenceof
restrictionendonucleaseontheperformanceofSSAPamplificationwasconducted.Theresultsshowedthat
whentheSSAPanalysiswasdigestedbythecombinationofMseIandEcoRIrestrictionendonuclease, moreo-
ver, itsselectivePCRamplificationwasperformedwitharetrotransposonprimerincombinationwitheitherMse
I+3 orEcoRI+3, theperformanceofSSAPamplificationwiththecombinationofretrotransposonprimer
andMseI+3 wassuperiorthanthatwiththecombinationofretrotransposonprimerandEcoRI+3.These
resultswouldprovideaguidanceforhigheficientandspecificselectionofrestrictionendonucleaseinapplica-
tionofSSAPretrotransposon-basedmolecularmarkerinanalysisofplantgermplasm.
Keywords:DiospyroskakiThunb.;retrotransposon;SSAP(sequence-specificamplifiedpolymor-
phism)
收稿日期:2009-11-27　　修回日期:2010-01-14
基金项目:国家自然科学基金(30871686)、华中农业大学科研启动基金(20070504011)和江西省农业科学院创新基
　　　　　　 金(博士启动项目:2009博 -8)
作者简介:杜晓云(1979-), 女 ,助理研究员 , 主要从事果树种质资源与生物技术研究 , E-mail:duxiaoyunduzi@126.
　　　　　　 com;＊通讯作者:罗正荣 , 教授 , E-mail:luozhr@mail.hzau.edu.cn。
DOI :10.13836/j.j jau.2010071
第 2期 杜晓云等:内切酶接头引物对柿属 SSAP分子标记扩增的影响
　　SSAP(sequence-specificamplifiedpolymorphism,特异序列扩增多态性)为系列逆转座子分子标记
技术中应用最广 、效率最高的一种[ 1] ,由 Waugh等 [ 2]根据 AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,
扩增片段长度多态性)改进而来 ,不同于 AFLP之处在于选择性扩增中的接头引物之一被逆转座子引物
替换。 SSAP整个实验过程需要经过内切酶消化 、连接 、预扩增 、选择扩增及终产物 PAGE胶分离等多步
操作 ,每一环节中相关联的因子均可能对实验结果造成影响 ,而且反应中使用的各种内切酶类以及银染
显象的检测体系均系较高成本投入 ,因此 ,对 SSAP分子标记扩增影响因素的研究对于提高实验效率 、
减少成本具重要意义。目前有关 SSAP在植物遗传多样性检测 、系统发育重建及连锁图谱构建等研
究 [ 3-16]中的具体应用较多 ,但对于影响 SSAP扩增因素的研究鲜见报道 ,加之 SSAP的高效性 ,应用很少
数目的引物组合即可获得较丰富的遗传信息 ,故从已有研究中归纳不同引物组合对 SSAP扩增反应的
影响规律用以指导 SSAP引物有效选择 ,尚缺乏较系统的数据资料可循 。因此 ,本研究拟对内切酶接头
引物对 SSAP逆转座子标记扩增的影响展开研究 ,以期明确内切酶接头引物对 SSAP逆转座子标记扩增
的影响 ,为在植物种质资源分析中有目的和高效选择内切酶引物进行 SSAP分析提供参考 。
表 1　试验试材
Tab.1　Listof28Diospyrosspp.usedinthestudy
编号
Code
基因型
Genotype
学名
Scientificname
脱涩类型
Astringenttype
起源地
Origin
1 90-1-37 DiospyroskakiThunb. PCNA China
2 90-1-10 D.kakiThunb. PVNA China
3 90-3-99 D.kakiThunb. PCNA China
4 90-1-15 D.kakiThunb. PCNA China
5 90-1-34 D.kakiThunb. PCNA China
6 90-3-4 D.kakiThunb. PCNA China
7 90-3-77 D.kakiThunb. PCNA China
8 罗田甜柿(Luotian-tianshi) D.kakiThunb. PCNA China
9 鄂柿 1号(Eshi1) D.kakiThunb. PCNA China
10 四方甜柿(Sifang-tianshi) D.kakiThunb. PCNA China
11 小果甜柿(Xiaoguo-tianshi) D.kakiThunb. PCNA China
12 铜盆柿(Tongpenshi) D.kakiThunb. PCA China
13 磨盘柿(Mopanshi) D.kakiThunb. PCA China
14 宝盖甜柿(Baogai-tianshi) D.kakiThunb. PCNA China
15 小宝盖甜柿(Xiaobaogai-tianshi) D.kakiThunb. PCNA China
16 湘西甜柿(Xiangxi-tianshi) D.kakiThunb. PCNA China
17 前川次郎(Maekawa-Jirou) D.kakiThunb. PCNA Japan
18 次郎(Jirou) D.kakiThunb. PCNA Japan
19 华柿 1号(Huashi1) D.kakiThunb. PVA Japan
20 富有(Fuyuu) D.kakiThunb. PCNA Japan
21 松本早生(Matsumoto-wase) D.kakiThunb. PCNA Japan
22 上西早生(Uenishi-wase) D.kakiThunb. PCNA Japan
23 君迁子(Dateplum) D.lotusL. PCA China
24 浙江柿(Chekiangpersimmon) D.glaucifoliaMetc. PCA China
25 老鸦柿(Diamondleafpersimmon) D.rhombifoliaHemsl. PCA China
26 油柿(Oilypersimmon) D.oleiferaCheng. PCA China
27 美洲柿(Commonpersimmon) D.virginianaL. PCA USA
28 金枣柿(Jinzaoshi) ? PCA China
　　PCNA:完全甜柿;PCA:完全涩柿;PVNA:不完全甜柿;PVA:不完全涩柿;?:分类学地位尚未明确。
　　PCNA:Pollination-constantnonastringent;PCA:Polination-constantastringent;PVNA:Polination-variantnonastrin-
gent;PVA:Pollination-variantastringent;? :Thetaxonomicstatusisunclear.
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　　　　1-28号对应基因型见表 1。
　　　　Lanes1-28 correspondtotheaccessionslistedinTable1.
a:rtdk14/ Mse(CAG), b:rtdk4/ EcoR(ACG).
图 1　引物组合 rtdk14/Mse(CAG)(a)和 rtdk4/EcoR(ACG)
在 28份柿属植物基因型中的 SSAP扩增图谱。
Fig.1　SSAPprofilesof2retrotransposonprimercombinationson28accessions.
1　材料和方法
1.1　试验材料
供试材料为柿属 7种 28个基因型(表 1),均采自华中农业大学柿圃 。基因组 DNA提取方法参考
DoyleandDoyle[ 17] 。
1.2　试验方法
1.2.1　SSAP分析　SSAP流程参考 Waugh等 [ 2]和 Vos等 [ 18] 。选择性扩增由 Mse-CAG、EcoR-ACG
接头引物分别与逆转座子引物组合完成。接头及预扩增接头引物序列参考 Vos等 [ 18] ,逆转座子引物参
考 Du等 [ 15] ,序列见表 2。PCR终产物由质量分数为 6%聚丙烯酰胺变性胶 60W恒功率电泳检测 ,银染
显色。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 PCR反应中涉及到的分子生物学试剂均为
北京三博远志生物技术有限责任公司 。内切酶购于深圳晶美生物工程公司 。
表 2　本研究所用逆转座子引物
Tab.2　Retrotransposonprimersusedinthisstudy
引物 Primer 方向 Orientationinstance 序列 (5 -3 )Sequence(5 -3 )
rtdk14-r1 Antisense CATTGGGTCCATCAGTTTCC
rtdk16-r9 Antisense CAACACGAAATACGGCTACG
rtdk16-r10 Antisense CTGCGACTTCACCAAGCCATAAA
rtdk11-p1 Sense GCTTGAGGGGGAGTGTTGAGTT
rtdk4-p3 Sense GAAGGGAGGTCTAAACTGAGGAAA
1.2.2　SSAP数据统计及分析　电泳条带按 1 /0形式进行数据转换 ,只统计清晰 、再现性强的条带。扩
增产物按同一位点条带有或无分别赋值 ,有带记为 “1”,无带则记为 “0”;采用 NTSYS-pcVersion2.1[ 19]
软件计算遗传距离和进行 Mantel检验分析聚类结果之间的相关性 。
2　结果与分析
5个引物共扩增出 142条带 ,其中多态性带 141条 ,多态位点百分率为 99.30%。扩增片段大小在
100 ～ 2 000 bp。引物扩增总带数介于 20 ～ 42条 ,平均每个引物产生 28条带 。图 1所示为引物组合 rt-
dk14 /Mse(CAG)和 rtdk4 /EcoR
(ACG)的 SSAP扩增电泳图谱。
逆转座子的扩增性能因选择
性扩增时酶接头引物的种类不同
而有别 。由表 3可以看出 ,除 rt-
dk16-r10/EcoR (ACG)外 , 与
MseI选扩引物组合 (逆转座子 /
M)的 SSAP扩增性能普遍优于
EcoRI组合(逆转座子 / E),就同
一逆转座子而言 ,由前类组合扩
增产生的总位点数高于后类组
合 ,二者差异最高达 7倍之多(rt-
dk-r9, 70/9),平均差异近 2倍 。
进一步分析发现 ,多态位点百分
率与使用的酶接头引物似乎没有
必然的相关性 , 但 SSAP分析所
能反映的种质间平均遗传距离值
除 rtdk16外 ,其它 3个逆转座子均为逆转座子 /M组合要高于逆转座子 /E组合 ,而且每个 SSAP组合
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第 2期 杜晓云等:内切酶接头引物对柿属 SSAP分子标记扩增的影响
与 10对 SSAP引物组合总的聚类结果间的相关性比较也表明 ,逆转座子 / M组合的相关系数值普遍较
逆转座子 / E组合的高。
表 3　SSAP分子标记反映的多样性信息
Tab.3　DiversityinformationforSSAPmarkersinaccessionsanalyzed
逆转座子
Retrotransposon
选扩引物
Selective
primer
扩增总带数
No.amplified
bands
多态性百分比 /%
Percent
polymorphism
平均遗传距离
Averagegenetic
distance
Mantel相关性值(r)
Mantel
correlationvalue
rtdk14 Mse(CAG) 32 81.3 0.231 0.79
EcoR(ACG) 25 88.0 0.228 0.69
总计 Total 57 84.2 0.230 0.87
rtdk16-r9 Mse(CAG) 70 100.0 0.332 0.79
EcoR(ACG) 9 100.0 0.204 0.58
总计 Total 79 100.0 0.317 0.82
rtdk16-r9-r10 Mse(CAG) 56 87.5 0.265 0.90
EcoR(ACG) 75 98.7 0.353 0.95
总计 Total 131 94.7 0.316 0.98
(Average) Mse(CAG) 63 94.4 0.302 0.96
EcoR(ACG) 42 98.8 0.337 0.95
总计 Total 105 96.2 0.316 0.98
rtdk11 Mse(CAG) 73 93.2 0.300 0.96
EcoR(ACG) 30 83.3 0.203 0.82
总计 Total 103 90.3 0.272 0.96
rtdk4 Mse(CAG) 58 96.6 0.313 0.95
EcoR(ACG) 29 89.7 0.236 0.80
总计 Total 87 94.3 0.287 0.96
3　讨　论
本研究对内切酶种类对 SSAP扩增的影响进行探讨 , 结果表明 ,在以 MseI和 EcoRI组合消化的
SSAP反应系统 ,且均以 3个碱基作为末端选择性碱基的前提下 , MseI与逆转座子引物组合的 SSAP扩
增性能优于 EcoRI与逆转座子引物组合。 SSAP选择性扩增中逆转座子 /E引物组合产生的扩增位点过
少 ,可能与 E引物末端选择性碱基个数过多有关 ,也可能因 EcoRI的低频酶性质所致 。现有研究多使用
逆转座子 / M引物组合 ,少数几例逆转座子 /E的 SSAP多位点成功扩增的报道也多使用附加 2个 [ 10, 12]
或不附加选择性碱基的 EcoRI酶接头引物 [ 11, 13] ,由此笔者推测 ,减少 EcoRI选择性碱基个数可能有助于
提高 SSAP分析性能 ,但是从本研究其中一个逆转座子(rtdk16)/E+3组合和 Vershinin等[ 20]结果来看 ,
筛选不同选择性碱基组成和排序的 E+3引物也有可能提升逆转座子 /E引物的性能 ,这些都有待进一
步实验证实 。研究结果为 SSAP分子标记在植物逆转座子种质资源分析的应用过程中有目的和高效的
选择内切酶引物提供参考 。
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