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一测多评法测定獐牙菜属植物中4种环烯醚萜类成分



全 文 :一测多评法测定獐牙菜属植物中4种环烯醚萜类成分
杨晓泉,夏从龙*
(大理大学 药学与化学学院,云南 大理671000)
摘 要:目的:采用一测多评法测定獐牙菜属植物中的4种环烯醚萜类,考察化合物之间采用相对校正
因子进行含量测定的准确性和可行性。方法:以獐牙菜属植物为研究对象,采用 HPLC测定4种活性
环烯醚萜苷之间的相对矫正因子,并分别以这4种成分的任意一种作为参照成分,建立可对另外3种成
分检测的“一测多评方法”。采用建立的一测多评法测定并计算不同种獐牙菜属植物中4种成分含量,
并与外标法比较,以评价一测多评法的准确性。结果:在一定线性范围内,RCF值稳定;且不同实验条
件下,重现性良好;不同种獐牙菜属植物中4种环烯醚萜类成分计算值与实测值无明显差异。结论:一
测多评方法准确可行,为一测多评法用于中药质量控制提供了可靠依据。
关键词:獐牙菜属;环烯醚萜类;HPLC;一测多评
中图分类号:R284   文献标识码:A   文章编号:1673-2197(2016)15-0056-04
DOI:10.11954/ytctyy.201615023
收稿日期:2016-03-09
作者简介:杨晓泉(1990-)男,大理大学硕士研究生,研究方向为药物分析与质量控制。
通讯作者:夏从龙(1974-),男,大理大学教授、硕士生导师,研究方向为天然药物资源调查与品质评价。E-mail:long7484@126.com
  龙胆科獐牙菜属植物具有保肝利胆的药效,在传统藏
药中,是“蒂达”的主要原植物之一,具有悠久的药用历史,
《晶珠本草》[1]记载:“蒂达可清热,治胆病、血病,有清肝利
胆、退诸热的作用。”其中青叶胆(S.mileensis)已收载于
1975年版及以后版本的《中华人民共和国药典》。沈黎明
等[2]整理发现其在云南广泛分布,尤其高原区、金沙江区、
滇西峡谷区,种类多,蕴藏量大。獐牙菜属植物中普遍含有
环烯醚萜类(獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷等)等
活性成分。现代药理学研究表明,环烯醚萜类具有保肝利
胆 、抑制中枢神经 、镇痛 、抗炎 、抗结核等作用[3-4]
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壳、大药材、大药材仁和小药材样品溶液,各精确吸取15μL,
在“2.1”项下色谱条件下检测,外标法计算各部分中鸦胆子
苦醇含量,结果见表2。
表2 样品含量测定结果 (%)
名称 平均含量 RSD
大药材壳 0.004  1.3
大药材 0.023  1.6
大药材仁 0.036  2.1
小药材 0.009  0.7
3 讨论
用不同比例的乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-
0.05%磷酸溶液、甲醇-水为流动相,分别进行等度和梯度
洗脱,发现鸦胆子苦醇在乙腈-水体积比为40∶60中能达
到良好的分离效果,等度条件时分离度较好。
鸦胆子苦醇的抗肿瘤及抑制癌细胞的特性引起科研工
作者的广泛关注。本研究表明,鸦胆子果实的各个部位,仁
中鸦胆子苦醇含量最高,壳中最少;大药材中鸦胆子苦醇含
量是小药材的2.6倍。由此可见,鸦胆子苦醇主要集中在
鸦胆子仁中。该课题为鸦胆子药材中鸦胆子苦醇质量标准
的制定提供依据,对科研和实际应用都具有参考价值。
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(编辑:余 婷)
—65—
系“蒂达”的重要药效物质基础。利用一测多评法的质量评
价模式[5-7],只测定其中一个成分来实现多指标的同步监测。
本实验建立了獐牙菜属植物中环烯醚萜类一测多评的分析
方法,并对一测多评的技术适应性和应用可行性进行了探
索和评价。
1 仪器与试药
仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(G1315BDAD检
测器,美国安捷伦公司);Agilent 1290高效液相色谱仪
(G4212BDAD检测器,美国安捷伦公司);AE240十万分之
一电子天秤(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
SK5200H型超声波清洗机(功率53KHz,上海科导超声仪
器有限公司);DZG-303A 超纯水机(超纯水出水水质:
18.25MΩ·cm,台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂)。
獐牙菜苦苷(批号 MUST-11012401)、龙胆苦苷(批号
MUST-11011401)、獐牙菜苷(批号 MUST-11020802)、芒果
苷(批号 MUST-10121201)对照品均购自成都曼斯特生物
科技有限公司,纯度均≥98%。甲醇、乙腈均为 HPLC级,
购自TEDIA公司,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
实验材料采自云南红河哈尼彝族自治州、迪庆藏族自
治州、大理白族自治州等地境内,均经大理大学夏从龙教授
鉴定,药用部位为干燥全草。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 色谱条件及系统适用性 Thermo Syncronis C18
色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相0.04%磷酸水
(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0~10min,10%B;10~26min,10%
~14%B;26~30min,14%B),流速1.0mL·min-1,依据各
成分峰面积及分离度效果,选取最适宜吸收波长240nm作
为检测波长,柱温30℃。按4种成分色谱峰计算,理论塔板
数均不低于10 000。
图1 混合对照品(A)及青叶胆样品(B)HPLC
1.獐牙菜苦苷(swertiamarin)2.龙胆苦苷(gentiopicroside)3.獐牙
菜苷(sweroside)4.芒果苷(mangiferin)
2.1.2 对照品溶液制备 取獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙
菜苷、芒果苷对照品适量,分别加甲醇配制成浓度为1.685、
1.310、0.745、0.730mg/mL的溶液,即得各对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液制备 精密称取干燥药材(全草)粉末
(过60目筛)样品0.833g,置10mL试管中,按液料比10∶1
加入甲醇作为提取溶剂,50℃条件下超声30min,超声3次,
取上清液混合定容于25mL容量瓶,临用前以0.22μm微孔
滤膜滤过,即得供试品溶液。
在一定范围内,成分的量(质量或浓度)与检测器响应
成正比。以药材中某一典型有效成分作为参照物(s),建立
与其他待测成分(i)间的相对校正因子(RCF,fsi),按公式
(1)计算,式中As为参照物对照品(s)峰面积,Cs为参照物
对照品(s)浓度,Ai为某待测成分对照品(i)峰面积;Ci为某
待测成分对照品(i)浓度。
fsi =fsfi =
As/Cs
Ai/Ci
(1)
在测定含量时,参照物(s)的浓度可按照常规方法进行
测定;应用RCF(fsi),结合参照物(s)的实测值,计算待测成
分(i)的浓度,见公式2,式中As为供试品内参照物(s)峰面
积,Cs为试品内参照物(s)浓度,Ai为供试品内某待测成分
(i)峰面积;Ci为供试品内某待测成分(i)浓度,fsi为参照物
(s)对待测成分(i)的校正因子。
Ci=fsi×Cs×
Ai
As
(2)
2.2 方法学验证
2.2.1 标准曲线绘制 将“2.1.2”项下各对照品溶液按3
∶1∶1∶1比例混合即得混合对照品溶液Ⅰ,再稀释10倍,
即得混合对照品溶液Ⅱ。分别精密吸取混合对照品溶液Ⅰ
进样30、20、15、10、5、2、1μL,精密吸取混合对照品溶液Ⅱ进
样20、10、5、2、1μL,以峰面积(Y,A)为纵坐标,对照品的进
样量(X,μg)为横坐标,绘制标准曲线。獐牙菜苦苷线性方
程为Y=1 342.868X+2.587,r=0.999 9;龙胆苦苷线性方
程为Y=356.600X-0.052,r=0.999 9;獐牙菜苷线性方程
为Y=1 192.116X-0.037,r=0.999 9;芒果苷线性方程为
Y=2 330.027X-0.857,r=0.999 9。结果表明獐牙菜苦苷
在0.101 1~15.165 0μg,龙胆苦苷在0.013 1~3.930μg,獐
牙菜苷在0.014 9~2.235 0μg,芒果苷在0.0146~2.190μg
范围内与其峰面积具有良好的线性关系。
2.2.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品
溶液Ⅰ,在“2.1.1”项下色谱条件连续进样5次,分别记录
峰面积,计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的峰
面积的RSD分别为1.14%、1.40%、0.45%、1.36%。表明
进样精密度良好。
2.2.3 重复性试验 精密称取同一批青叶胆粉末5份,
制备供试品溶液,在给定色谱条件进样10μL,分别记录峰
面积,计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的含量
(mg·g-1),计算 RSD 分别为1.86%、1.39%、1.75%、
2.59%。表明方法重复性较好。
2.2.4稳定性试验 将同一样品溶液隔0、1.5、3.0、4.5、
6.0、12.0h在给定色谱条件下进样10μL,分别记录峰面积,
计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的峰面积的
—75—
RSD分别为1.16%、1.46%、1.83%、2.0%。表明样品溶液
在12h内稳定。
2.2.5 加样回收率试验 取已测定含量的青叶胆供试品
溶液6份,分别按约0.8∶1、1∶1、1.2∶1添加各对照品适
量,制备供试品溶液,在给定色谱条件进样10μL。计算得獐
牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的加样回收率分别
为99.66%、100.15%、100.21%、100.35%,RSD 分别为
1.07%、0.54%、0.53%、0.44%。结果表明该方法具有良
好的回收率。
2.3 相对校正因子的计算及其耐用性验证
2.3.1 相对校正因子的计算 精密吸取“2.2.1”项下混
合对照品溶液Ⅰ进样30、20、15、10、5、2、1μL,记录色谱图。
按相对校正因子计算公式计算分别以这4种成分的任意一
种作为参照成分,对另外3种成分的相对校正因子fsi,并求
出平均值及RSD。如表1所示。
表1 4个指标成分的相对校正因子
V/μL
獐牙菜苦苷
龙胆苦苷 獐牙菜苷 芒果苷
龙胆苦苷
獐牙菜苦苷 獐牙菜苷 芒果苷
獐牙菜苷
獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 芒果苷
芒果苷
獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 獐牙菜苷
30  3.765  1.128  0.577  0.266  0.300  0.153  0.886  3.337  0.511  1.734  6.526  1.956
20  3.784  1.130  0.578  0.264  0.299  0.153  0.885  3.348  0.512  1.729  6.545  1.955
15  3.760  1.119  0.576  0.266  0.298  0.153  0.893  3.359  0.515  1.735  6.524  1.942
10  3.707  1.107  0.567  0.270  0.299  0.153  0.904  3.350  0.513  1.762  6.532  1.950
5  3.843  1.153  0.581  0.260  0.300  0.151  0.867  3.332  0.504  1.721  6.612  1.984
2  3.870  1.161  0.553  0.258  0.300  0.143  0.861  3.332  0.477  1.807  6.991  2.098
1  3.880  1.160  0.587  0.258  0.299  0.151  0.862  3.344  0.506  1.703  6.607  1.976
(X  3.801  1.137  0.574  0.263  0.299  0.151  0.880  3.343  0.505  1.741  6.620  1.980
RSD(%) 1.69  1.89  1.91  1.70  0.30  2.43  1.89  0.30  2.62  1.94  2.54  2.73
2.3.2 样品测定 取藏药蒂达原植物9种粉末,按
“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条
件进样10μL,分别测得獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒
果苷的峰面积。分别用外标法和一测多评法(獐牙菜苦苷
为参照物)计算各成分的含量。如表2所示。
2.3.3 耐用性考察 本实验考察了两套色谱系统(Agi-
lent 1100型和Agilent 1290型)及不同品牌色谱柱(Thermo
Syncronis C184.6mm×250mm,5μm和ZORBAX Eclipse
XDB-C184.6mm×250mm,5μm)对相对校正因子的影响,
结果见表3。表明校正因子在不同实验室、不同色谱系统、
不同色谱柱下具有良好的重复性。
表2 外标法和一测多评法测定4个指标成分含量的比较 (mg·g-1)
名称 拉丁名 来源 方法 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 獐牙菜苷 芒果苷
青叶胆 Swertia mileensis 云南省红河哈尼彝族自治州弥勒 外标法 82.076  1.514  1.518  0.181
一测多评 82.076  1.527  1.532  0.179
川西獐牙菜 Swertia mussotii 云南省迪庆藏族自治州德钦县 外标法 17.314  80.955  2.022  39.925
一测多评 17.314  81.685  2.040  39.749
印度獐牙菜 Swertia chirayita 云南省迪庆藏族自治州藏医院 外标法 3.204  2.981  2.013  4.893
一测多评 3.204  3.003  2.028  4.863
紫红獐牙菜 Swertia punicea 云南省大理白族自治州大理市苍山 外标法 19.390  49.153  3.575  16.219
一测多评 19.390  49.598  3.607  16.147
圈纹獐牙菜 Swertia cincta 云南省大理白族自治州云龙县 外标法 4.605  71.449  2.876  0.182
一测多评 4.605  72.028  2.899  0.180
显脉獐牙菜 Swertia nervosa 云南省大理白族自治州大理市苍山 外标法 1.948  3.649  0.874  0.291
一测多评 1.948  3.672  0.880  0.288
表3 不同仪器色谱柱测得的相对校正因子影响
仪器 色谱柱
獐牙菜苦苷
龙胆苦苷 獐牙菜苷 芒果苷
Agilent 1100 Thermo Syncronis C18 3.801  1.137  0.574
ZORBAX Eclipse XDB-C18 3.724  1.109  0.569
Agilent 1290 Thermo Syncronis C18 3.865  1.158  0.591
ZORBAX Eclipse XDB-C18 3.837  1.145  0.583
珚X  3.807  1.140  0.579
2.3.4 待测成分色谱峰定位 采用相对保留时间比值
法,计算“2.3.2”项下龙胆苦苷、獐牙菜苷、芒果苷相对獐牙
菜苦苷的保留时间比值,见表4。发现采用相对保留时间比
值法,波动相对较小。
3 讨论
3.1 色谱条件的选择
曾比较过文献报道[3-4]的多种流动相:甲醇—水(二元梯
度系统洗脱)系统、乙腈—水(二元梯度系统洗脱)系统、甲
醇—0.04%磷酸水(二元梯度系统洗脱)系统等,经过反复
多次试验,选择了“2.1.1”项下实验条件。通过HPLC-DAD
扫描3D图谱,确定獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷和芒果
苷的最大吸收波长在240nm,且分离效果较好,理论塔板数
较高。
3.2 超声提取工艺
此超声提取工艺经过L9(34)正交试验设计[8],以7成
分与本药材功能相关性大小确定权重系数,通过计算综合
评分[= (X1 含量/最大 X1 含量)×100× 权重系数1
+......+(Xn含量/最大Xn 含量)×100×权重系数n]作
为正交试验的评价指标,采用excel软件处理[9]计算K值及
方差分析,确定最佳超声提取工艺,经验证该工艺提取效果
好、方便、合理、可行。
—85—
3.3 一测多评的参照物
本实验分别以4种环烯醚萜成分的任意一种作为参照
成分,建立可对另外3种成分检测的“一测多评方法”。这
可以保证,在只有任意一种环烯醚萜苷成分的条件下,可以
准确快速地获得这4种成分的含量,为獐牙菜属植物质量
标准的制定提供了更广泛的科学依据。
表4 对獐牙菜苦苷的相对保留值 (珚x±s)
成分 青叶胆 川西獐牙菜 印度獐牙菜 紫红獐牙菜 圈纹獐牙菜 显脉獐牙菜 大籽獐牙菜 丽江獐牙菜 宾川獐牙菜 保留值
龙胆苦苷 1.307  1.336  1.349  1.321  1.321  1.332  1.327  1.337  1.322  1.328±0.012
獐牙菜苷 1.389  1.390  1.431  1.399  1.399  1.412  1.405  1.400  1.399  1.403±0.013
芒果苷 1.486  1.478  1.508  1.473  1.476  1.490  1.478  1.477  1.475  1.482±0.010
3.4 待测组分色谱峰的定位
保证相对校正因子计算法应用的前提条件是色谱峰的
准确定位。一般采用保留时间差法或相对保留时间比值
法。王超群等[8]在实验中发现保留时间差值的变化范围很
大,不宜采用,相对保留值数值稳定,可以用于待测组分色
谱峰的定位。实验过程中,作者也发现,保留时间在不同实
验条件下,变化很大,差值范围也大,不适合待测组分色谱
峰的定位,故本文采用相对保留时间比值法。
4 结语
研究表明在一定范围内,成分的量(质量或浓度)与检
测器响应成正比。利用这种特性,通过研究确立几种待测
组分的相对校正因子,建立只需要用一种对照品,就可以获
得其他组分含量的方法,即提高獐牙菜属植物质量标准的
水平,同时提高检测速度,降低检验成本。同时此方法研究
的几种活性成分,也是龙胆科其他属植物及藏药蒂达其他
科植物的重要活性成分之一,已将本研究建立的一测多评
方法在龙胆科花锚属椭圆叶花锚和虎耳草科虎耳草属唐古
特虎耳草中进行相应验证,为藏药蒂达及其他药物的质量
标准制定提供了更广泛的科学依据。
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法的系统研究[J].中国中药杂志,2012,37(22):3438-3445.
(编辑:余 婷)
Quantitative Analysis of Multi-components with Single Marker of Four Natural
Iridoid Compounds From Swertia
Yang Xiaoquan,Xia Conglong*
(Department of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali 671000,China)
Abstract:Objective:To determine four natural iridoid compounds from Swertia by quantitative analysis of multi-components with
single marker(QAMS),and examine the feasibility of using the relative correction factors(RCFs)between the different compounds.
Methods:The RCFs between the four natural iridoid compounds were determined by HPLC.With any of the four compounds as
reference,a QAMS method was established for detect the quantitation of the other four compounds.Subsequently,the new QAMS
method was used to determine the contents of four compounds contained in nine Swertia,and compare with external standard meth-
ods,in order to evaluate the accuracy of the QAMS method.Results:RCFs of four natural iridoid compounds is stable in a certain
linear range,and repeatability was good in different experimental conditions.The quantitative results of both external standard meth-
od and QAMS had no significant difference.Conclusion:The method established in this research is accurate and feasible,so as to
provide reliable basis for the application of the QAMS method in quality control of traditional Chinese medicines.
Keywords:Swertia;Natural Iridoid Compounds;HPLC;QAMS;Relative Correction Factor
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