全 文 ：枇杷属（Eriobotrya）隶于蔷薇科（Rosaceae）苹果
亚科（Maloideae）， 分布于亚洲温带和亚热带地区；
属内植物约有 30种， 其中中国原产的有 16个种加
5 个变种或变型[1-2]。 该属植物不仅是一类庭院观赏
或绿化树， 其栽培种枇杷果实甜酸适度、 营养丰
富、 具有极高的药用价值。 由于长期自然繁衍和人
热带作物学报 2014， 35（1）： 012-016
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-09-16 修回日期 2013-11-27
基金项目 福建省自然科学基金项目（No. 2011J01099）； 农业部农业科研杰出人才及其创新团队； 公益性行业（农业）科研专项经费项目（No.
201003073）； 农业部作物种质资源保护项目（No. NB2130135）； 农业部热带作物种质资源保护项目（No. 13RZZY-15）。
作者简介 胡文舜（1983年—）， 男， 硕士， 助理研究员； 研究方向： 果树育种、 种质资源和生物技术。 ﹡通讯作者（Corresponding author）：
郑少泉（ZHENG Shaoquan）， E-mail： zsq333555@163.com。
2种枇杷属植物的 trnH-psbA条形码序列变异
及其近缘属系统发育初步研究
胡文舜1, 2， 蒋际谋1, 2， 黄爱萍2, 3， 许奇志1, 2， 陈秀萍1, 2， 郑少泉1, 2 *
1 福建省农业科学院果树研究所， 福建福州 350013
2 福建省龙眼枇杷育种工程技术研究中心， 福建福州 350013
3 福建省农业科学院农业经济与科技信息研究所， 福建福州 350003
摘 要 选用枇杷野生近缘种 ‘栎叶枇杷’ 和栽培种 ‘早钟 6 号’、 ‘香妃’， 对其叶绿体基因组 trnH-psbA 基
因间隔区进行 PCR 克隆与测序， 利用生物信息学方法分析其序列特征， 并构建苹果亚科内 19 个属的系统发育
树。 结果表明： trnH-psbA 序列长 323~392 bp（GenBank 登录号： KF022254、 KF022255、 KF022256）， G+C 含量
30.10％~33.13％， 共有 1 个核苷酸替换（substitution）和 2 个插入/缺失（indel）； 基于 trnH-psbA DNA 条形码序列
的分子系统进化分析结果表明， 苹果亚科内形成 2 个大的分支， 枇杷属与石斑木属的亲缘关系最近（平均遗传距
离为 0.055）。 此结果表明叶绿体基因 trnH-psbA 序列可有效地进行枇杷属内物种鉴别及属间分类， 是枇杷属植
物 DNA 条形码研究的标准基因之一。
关键词 枇杷属； trnH-psbA； DNA 条形码； 序列分析； 系统进化
中图分类号 S667.3 文献标识码 A
Sequence Variation of trnH-psbA Barcode in Two Eriobotrya
Plants and Phylogenetic Relationships with Related Genera
HU Wenshun1,2, JIANG Jimou1,2, HUANG Aiping2,3,
XU Qizhi1,2, CHEN Xiuping1,2, ZHENG Shaoquan1,2*
1 Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultrual Sciences, Fuzhou, Fujian 350013, China
2 Fujian Breeding Engineering Technology Research Center for Longan＆Loquat, Fuzhou, Fujian 350013, China
3 Information Institute of Agricultural Economy and Scitechnological, Fujian Academy of Agricultural
Sciences, Fuzhou, Fujian 350003, China
Abstract The chloroplast genome trnH -psbA intergenic regions of three loquat (wild relatives ‘ E.prinoides’ ，
cultivars ‘Zaozhong No.6’ and ‘Xiangfei’）were cloned and sequenced. The sequence characteristics were analyzed
using bioinformatics methods and the phylogeny evolution tree was constructed with 19 genus of Maloideae. The
results showed that the length of trnH-psbA sequence was 323~392 bp （GenBank accession number: KF022254,
KF022255, KF022256), and its G+C content was 30.10%~33.13%. A total of 1 substitution and 2 indels were
obtained in the data. Molecular phylogenetic anaylised based on the sequence of trnH -psbA DNA barcode
reflected the relationship between Eriobotrya and Rhaphiolepis was closer(the average genetic distance was 0.055),
and Maloideae was divided into two large branches. This paper suggested that trnH-psbA DNA barcode could be
used as one of the standard gene to identify or classify plants of the Eriobotrya and its relative genus.
Key words Eriobotrya； TtrnH-psbA； DNA barcode； Sequence analysis； Phylogeny evolution
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.003
第 1 期 胡文舜等： 2种枇杷属植物的 trnH-psbA条形码序列变异及其近缘属系统发育初步研究
种质名称 登录号 长度/bp
碱基组成/％
A T C G G+C
早钟 6 号 KF022254 392 30.61 39.29 11.99 18.11 30.10
香妃 KF022255 392 30.61 39.29 11.99 18.11 30.10
栎叶枇杷 KF022256 323 29.41 37.46 13.31 19.81 33.13
表 1 枇杷 trnH-psbA 序列特征
Table 1 Sequence characteristics of trnH-psbA in Loquat
工选择， 变异类型较多， 从形态学鉴别该属所有植
物的难度较大 [3]。 因此， 对其准确地鉴别是进行有
效保护利用的重要前提。
DNA 条形码技术（DNA barcoding）是利用标准
的、 具有足够变异的、 易扩增且相对较短的 DNA
片段对物种进行快速准确的鉴定方法 [4]， 是近年来
动物 [5]、 微生物[6]、 植物 [7]等生物多样性及分类研究
热点。 DNA 片段序列在枇杷属植物的种类鉴定和
系统发育研究中亦有相关报道。 符小敏等 [8]应用
matK、 trnL-F 和 ITS 序列对广东分布的香花枇杷、
台湾枇杷、 大花枇杷和普通枇杷等 4个种的分类地
位和系统关系进行研究， 结果显示分子 DNA 序列
数据能将香花枇杷和大花枇杷相区别。 李平等 [9]通
过对 rbcL、 trnL-F、 ITS 和 Adh 基因进行序列分
析， 建立了枇杷属 12 个种的分子系统发生树。 张
坤城等[10]利用 matK 序列及 ITS 序列探讨台湾枇杷、
武威山枇杷及恒春山枇杷之亲缘关系， 认为三者
在分子亲缘演化上并无明显分化， 建议将武威山
枇杷及恒春山枇杷处理为台湾枇杷的变型。 王云
生等 [11]对栽培枇杷与野生枇杷叶绿体基因组的
TrnS-TrnG 和 TrnQ-rps16 位点进行序列多态性的比
较， 结果发现栽培枇杷群体在这 2个基因位点不存
在变异， 而野生群体存在替代及插入 /缺失变异。
叶绿体 DNA trnH-psbA 片段是进化速率最快的叶
绿体基因间隔区之一 [12]， 具有较高的物种鉴别能
力。 目前， 未见针对枇杷野生种与栽培种的 trnH-
psbA序列分析及应用报道。
本研究选取枇杷野生近缘种 ‘栎叶枇杷’ 和栽
培种 ‘早钟6号’（红肉）、 ‘香妃’（白肉）3份材料，
对其 trnH-psbA 基因片段进行克隆与序列分析， 并
利用生物信息学方法构建苹果亚科 19 个属的系统
发育树， 以探讨 trnH-psbA 基因序列在枇杷属植物
物种鉴定上的有效性， 为枇杷属植物的 DNA 条形
码研究和应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
2012 年 3 月在国家果树种质福州枇杷圃采集
枇杷[E. japonica（Thunb.）Lindl.]品种 ‘早钟 6 号’、
‘香妃 ’ 及其野生近缘种栎叶枇杷 （E. prinoides
Rehd. et Wils.）共 3份样品的嫩叶。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取及质量检测 试验在福建省龙眼
枇杷育种工程技术研究中心实验室进行。 称取新鲜
叶片 0.5 g， 加入液氮迅速研磨。 基因组 DNA 提取
参照改良的 CTAB法[13]， DNA质量和浓度的检测采
用 1％的琼脂糖电泳。
1.2.2 PCR 扩增与测序 trnH-psbA 片段扩增引
物及反应体系参考 Wang 等 [14]的方法， 引物序列
trnH5′-ACTGCCTTGATCCACTTGGC-3′和 psbA5′-
CGAAGCTCCATCTACAAATGG-3′。 PCR 扩增反应
总体积为 50 μL， 其中 DNA 模板 50~100 ng， 1×
buffer（含 Mg2+）， dNTPs 0.8 mmol/L， 上下游引物各
0.4 μmol/L， EX Taq聚合酶 1.0 U。 扩增程序： 94 ℃
预变性 5 min； 94 ℃变性 1 min， 55 ℃退火 30 s，
72℃延伸 1.5 min， 30 个循环； 72℃延伸 7 min。
用 OMEGA 试剂盒（OMEGA BioTek）进行目的
片段割胶回收， 送样进行直接测序， 同时进行克隆
测序： pMD18-T 载体 4 ℃连接过夜， 然后转化宿
主菌 DH5α 并 37 ℃培养过夜 ； 经蓝白斑筛选 、
PCR 检测后， 每个样本挑选阳性克隆 3 个双向测
序。 经初步的序列分析， 对存在单一突变的样本进
行重复 PCR 和测序， 以减少因错配得到的核苷酸
变异。 获得 3条序列的 GenBank登录号见表 1。
1.2.3 序列统计分析 从 GenBank 上选取苹果亚
科 19个属的 trnH-psbA 序列 19 条， 并与本实验测
序的 3 条序列一起进行 ClustalX2.0 多重比对后 ，
手工删去两端多余序列及中间插入片段， 从而获得
长度一致的序列用于比较分析。
采用 MEGA5.05 计算序列间的碱基组成、 变
异位点数 、 转换/颠换数 、 遗传距离等 ， 并应用
邻接法 （Neighbor-joining， NJ）构建系统发育树 。
对分支的可靠性评价使用靴带值（bootstrap， 1 000
次 重 复 ）分析 ， K -2P参数遗传距离 （kimura -
2parameter genetic distance）， 空位（gap）被处理为
缺失（missing）。
13- -
第 35 卷热 带 作 物 学 报
Zaozhong No.6
Xiangfei
E.prinoides
Zaozhong No.6
Xiangfei
E.prinoides
Zaozhong No.6
Xiangfei
E.prinoides
Zaozhong No.6
Xiangfei
E.prinoides
Zaozhong No.6
Xiangfei
E.prinoides
Zaozhong No.6
Xiangfei
E.prinoides
图 2 3 份枇杷材料 trnH-psbA 序列比对结果
Fig. 2 Comparison of trnH-psbA sequence of 3 Loquat
2 结果与分析
2.1 枇杷 trnH-psbA 序列测定结果
以 3 份材料基因组 DNA 为模板， PCR 扩增叶
绿体 trnH-psbA 基因间隔区序列， 产物经琼脂糖电
泳后在约 400 bp处出现一清晰目的条带（图 1）， 片
段割胶回收后直接送样测序。
PCR 产物直接测序出现双峰或噪值高等问题，
结果差。 最终通过 TA 克隆测序获得枇杷属植物叶
绿体 trnH-psbA 序列共 3 条（图 2）， 将其在 NCBI
上进行 BLAST 相似性检索， 均有较好的匹配程度，
确认所测序列为目标序列， 检索比对结果表明测序
结果准确可靠。
2.2 枇杷 trnH-psbA 序列特征及分析
测定获得早钟 6 号 、 香妃 、 栎叶枇杷的
cpDNA 基因的 trnH-psbA 片段长度分别为 392、
392、 323 bp（表 1）。 从表 1 中可以看出， 在 trnH-
psbA 序列中 4 种碱基频率存在明显偏差， 其中 C
含量最低 ， T 含量最高 ， G+C 含量为 30.10％~
33.13％， 显著低于其相应的 A+T 含量。 由图 2 可
知， 2 个枇杷品种的 trnH-psbA 完全相同， 而野生
种栎叶枇杷与栽培种相比有 3 个变异位点： 在第
178 bp位点和第 224 bp位点处分别发生 18和 51 bp
的缺失/插入； 在第 319 bp 位点处发生 G/T 碱基的
颠换。
2.3 基于 trnH-psbA 序列条形码鉴定枇杷属内物
种及其近缘属
22 条 trnH-psbA 序列经过 ClustalX2.0 软件比
M 1 2 3 4 5 6
1 500
500
100
1~2： 早钟 6 号； 3~4： 香妃； 5~6： 栎叶枇杷； M： 100 bp
DNA marker。
1~2： ZaozhongNo.6； 3~4： Xiangfei； 5~6： E. prinoides； M：
100 bp DNA marker。
图 1 枇杷属植物 trnH-psbA PCR 扩增产物电泳图
Fig. 1 Electrophoretogram of PCR pr-
oducts of trnH-psbA in Loquat
bp
14- -
第 1 期
▲表示实验选用的枇杷材料， （）内为DNA序列的GenBank登录号。
▲Means the loquat used in the study, （ ）inside are the GenBank accession number of DNA sequence。
图 3 用邻接法构建的基于 trnH-psbA 序列的苹果亚科植物系统进化树
Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of the Maloideae base on the sequences of trnH-psbA
早钟6号zaozhongNo.6（KF022254）
枇杷E.japonica （ GQ305326.1）
香妃xiangfei（KF022255）
栒子属Cotoneaster（JQ390693.1）
红果树属Stranvaesia（JQ390763.1）
石斑木属Rhaphiolepis（HQ427046.1）
栎叶枇杷E.prinoides （KF022256）
花楸属Sorbus（GU592806.1）
假苹果属Heteromeles（GQ305337.1）
梨属Pyrus（JQ390750.1）
小石积属Osteomeles（JQ390765.1）
栘依属Docynia（JQ390704.1）
木瓜属Chaenomeles（JQ390653.1）
苹果属Malus（GU562389.1）
腺肋花楸属Aronia（EF127154.1）
中华假温梜Pseudocydonia（JQ390757.1）
石楠属Photinia（GQ305328.1）
榅桲属Cydonia（JQ390697.1）
山楂属Crataegus（FN687519.1）
唐棣属Amelanchier（EU500285.1）
欧楂属Mespilus（EF127135.1）
火棘属Pyracantha（JN046709.1）





98
63
25
7
36
6
14
20
31
3127
99
12
Ⅰ
Ⅱ
0.05
▲
▲
▲
对排列后长度为 250 bp， 分析结果显示， 样品间遗
传距离范围为 0~2.008， 平均遗传距离为 0.346 8；
枇杷属普通枇杷种内 3个样品之间遗传距离最小为
0， 欧楂属与石楠属遗传距离最大为 2.008； 枇杷属
与石斑木属植物遗传距离较小为 0.006~0.053， 推
测二者亲缘关系较近； 根据 trnH-psbA 序列条形码
的特征性变异位点能全部区分苹果亚科内的 19 个
属植物。
由图 3 可知， 苹果亚科内 19 个属明显分为 2
个分支， 第Ⅰ分支自展支持率高达 99％， 包含枇
杷属、 栒子属、 红果树属等 17 个属， 3 份普通枇
杷以 98％的高支持率聚为一小的分支， 野生种栎
叶枇杷和石斑木属关系最近； 第Ⅱ分支为欧楂属和
火棘属， 与其它属距离均较远， 处于最靠近根目录
的位置。
3 讨论与结论
本研究对 trnH-psbA DNA 条形码在枇杷属栽
培种和野生近缘种上的序列特征及其适用性进行分
析研究。 试验初期曾进行 PCR 扩增产物的直接测
序， 测序过程出现双峰或信号中断等问题。 此外，
作者对枇杷属内其它 7 个种 23 份材料进行了 PCR
产物直接测序验证（将另文报道）， 同样支持进行克
隆测序以获得完整的 trnH-psbA 序列。 本试验结果
获得的 3条 trnH-psbA 序列在不同种间存在明显的
碱基颠换和插入/缺失突变， 说明枇杷属植物在长
期栽培驯化过程中产生了较大变异。 本研究基于
trnH-psbA 序列构建苹果亚科 19 个属的系统进化
树， DNA 序列来自叶绿体基因组的单个基因， 其
结果会有一定的片面性， 但仍具参考意义： 如欧楂
属和火棘属置于苹果亚科系统演化树的较早分支，
胡文舜等： 2种枇杷属植物的 trnH-psbA 条形码序列变异及其近缘属系统发育初步研究 15- -
第 35 卷热 带 作 物 学 报
这与 Eugenia等[15]综合利用叶绿体 11 个基因和核基
因 ITS 序列分析苹果亚科内 27 个属 331 个种的系
统发育研的究结果相一致； 枇杷属与石斑木属二
者亲缘关系较近， 这与之前符小敏等 [8]、 张坤城
等 [10]、 Eugenia 等 [15]的研究报道相吻合。 因此， 枇
杷属植物叶绿体基因 trnH-psbA 序列具有长度适
中、 容易扩增、 测序成本较低等优点， 能有效地鉴
别属内物种及属间分类， 可作为 DNA 条形码标准
基因。
植物 DNA 条形码研究和应用可以分成 2 个阶
段： （1）条形码的选择和确定； （2）将选定的条形码
应用于物种鉴定， 逐步建立完整的条形码数据库 [16-
17]。 枇杷属植物类群中条形码的研究和应用尚处于
探索阶段， 充分利用基因组信息寻找理想的 DNA
条形码候选基因仍是今后一段时间主要的研究任
务。 通过对枇杷属内多个类群和多个基因的比较，
结合传统形态分类学， 开展分类群种内和种间差
异、 物种鉴别的分子变异尺度、 不同条形码的使用
范围、 系统发育相关的进化事件等方面研究工作，
最终建立实用的条形码数据库。 这不仅可以实现快
速、 准确的物种鉴定， 也为揭示中国枇杷属植物的
生物多样性及更好地保护利用提供科学依据。
致谢 本研究部分实验在福州国家水稻改良分中心完
成， 期间得到了连玲助理研究员、 何炜助理研究员的帮助，
特此感谢！
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责任编辑： 黄东杰
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