全 文 ：果 树 学 报 2 0 0 5 , 2 2 ( 2 ) : 1 82 一 18 5
J o u nr
a l o f F ur i t S
e
i
e n e e
批把属植物基因组 D N A 提取方法的
改进及其应用
刘月学 , 杨向晖 , 林顺权 * , 胡桂兵 , 刘成明
(华南农业大学园艺生物技术研究所 , 广州 5 10 642)
摘 要 : 以批把属的普通批把和多种野生批把 的叶片为材料 , 对批把的 D NA 提取进行了研究 。针对批把富含多酚类
等次生物质 的特点对批把 DN A 的提取步骤进行 了改 良处理 : 采用 C厂以 B一蛋白酶 K 法加重复抽提 , 去除批把材料 中
的相关次生物质 , 获得了高质量 的 DN A 。 所提取 的 D N A 完全能满足 PC R 、 R A PD 、 AF L P 等一些分子生物学实验要
求 。
关键词 : 批把属 ; D N A 提取
中图分类号 : 56 67 3 文献标识码 : A 文章编号 : 10 09一 9980 (2 0 05 )0 2一 1 82一04
A n iln P
r o v e d P r o c e d u r e of r n u c l e a r D N A i s o la t i o n fr o m E ir o b o try
a P l a n t s
a n d i t s a P P li c a t i o n
L IU Y u e 一 x u e , Y AN G X i a n g一h u i , L IN S h u n 一 q u a n ’ , H U G u i一b i n g , LI U Ch e n g 一m i n g
(R
e s e
* h nsI
t i名u t e of B i o te e h n o l。邵 in H o rt i e u l t u耐 lP an t , oS u t h hC i n a A gT u u l t u耐 nU i v e rs i ly , G “ aj l岁 h o u , ` u al l gd 。咭 , ]肠 4 2 C h i n a)
A b s t ar c t : DN A
e x tr a e t i o n ofr m l
e af o f lo q u a t e u lt i v a sr a n d s e v e ar l rE i
o
b
o r卿 s p e e i e s w a s e a ir e d o u t . B e e a u s e lo q u a t 15 ir e h
i n s e e o n d卿 s u b , t a n e e s s u e h a s h y d or x y b e n z e n e , a s e ir e s o f im p or v e d t re a t m e n t s w e re u s e d i n th e p or g re s s o f th e n u e le i e
a e i d e x t r a e t io n
.
G
e n o m i e D N A w
a s e x tar e t e d ofr m l
o q u a t s p e e i e s by C T A B 一orP
t e i n a s e K m
e th
o
d
a n
d t h
e e x tar e t e d D N A 15
s u i t a b l
e
of
r a s e ir e s o f b i
o t e e h
n o
l
o g ie a l re
s e a r e
h
e s s u e
h
a s PC R
,
RA PD
,
A F LP
e t e
.
K e y W o dr s : rE i
o b o tO I 〕 L i n d l
.
: D N A
e x tar e t io n
我国近 10 年来批把 (E r i o b o txar j甲 o n i e a L i n d l
.
)
栽培面积急剧扩大 , 已超过 10 万 hm Z ; 我 国和全世
界广泛种植的普通批把已有数百个品种 。 除了普通
批把之外 , 我国还有批把属植物约 2 0 个种类 l] , 对
于这些种类的遗传背景和育种价值鲜有研究 。 相对
于其它果树而言 , 批把的分子生物学研究进展缓
慢 ,相关方面的研究报道较少 。 其中一个重要的原
因是批把的核酸提取 比较困难 : 批把的叶片材料多
覆盖有厚厚的茸毛 ,对核酸提取来说是一个重要的
负 面影响因素 ;批把 的材料富含酚类 、 多糖等次生
物质 , 这些次生物质的存在也是批把核酸提取的一
个很大障碍 。 因此可以说 ,从批把的各种材料中提
取 出高质量的核酸成 为对批把进行分子生物学研
究的瓶颈 。
涉及批把 DN A 提取方面的报道已有郑国华等
12采用细胞分离液去除多糖的方法获得 了普通批把
的 D N A ; 程运江等 l3] 研究认 为用水饱和乙 醚可以去
除普通批把大部分多糖 , 从而获得高质量的 D N A ;
B a d e n e s 等 [’] 和潘义法等阎进行了几个批把栽培品种
的 R AP D 分析 ; 陈义挺等网也进行了几个批把栽培
品种和 2 种野生批把 (台湾批把 和栋 叶批把 )的
RA P D 分析 。 上述报道中的 D N A 提取技术 , 基本上
是仿照前些年科学家们提取植物的 D N A 方法阴 , 在
一定程度上解决 了去除植物细胞的多糖 、 酚类 、 蛋白
质等次生物质问题 。 主要是 S D S 和 C T A B 法或两者
的改 良方法 ,这些方法多建立在用 1 . 5% 一3%裂解液
破坏植物细胞壁 , 然后在高盐缓冲液条件下用无水
乙醇或异丙醇沉淀 D N A , 这类方法可用于普通批
把 12阎 ,但却不适合于野生批把 。 我们发现采用这些
方法获得的多数野生批把 的 D N A 勃度高 ,难以溶于
T E缓 冲液或双蒸水 ,这种 D N A 勉强可用于 P CR ,但
不能用于限制性酶切 。 采用 C s CI 梯度离心可 以有效
克服这些 问题 ,但它要求设备昂贵 、 操作费时 , 且需
大量试材 。一些报道指出多糖是污染 DN A 的主要物
收稿 日期 : 2 0 04 一 0 6一 21 接受 日期: 2 (j )4一 12 一 2 8
基金项 目 : 教育部骨干教师资助计划 ;广东省农业攻关计划项 目 ( 2 0 04 B 2 0 9l0 O01 ) 。
作者简介 : 刘月学 , 男 ,在读博士生 。
* 通讯作者 。 Au th o r fo r e o er s p o n d e n e e
.
T e l
:
0 2 0 一 85 2 8 8 2 6 2
,
E一 m a i l : l o q u a t@ s e a u , d u 、 n .
DOI : 10. 13925 /j . cnki . gsxb. 2005. 02. 023
2期 刘月学等 : 批把属植物基因组 DN A提取方法的改进及其应用
质 , 并给出了相关去除多糖的方法阵 12 ,它们多先用
不含裂解液的 T ir s一H CI 缓冲液洗去大部分多糖 , 或
在高盐 ( N a CI 或 K A c )缓冲条件下 , 用无水 乙醇或异
丙醇中 DN A 优先沉淀的性质 ,除去多糖 。
因此 ,借鉴其他植物的 DN A 提取方法 ,探索建
立批把属植物 D N A 提取的可靠方法很有必要 。
本课题组正在进行利用分子标记技 术探讨批
把属植物 的亲缘关 系以及进行与成 花相关基 因的
分离和克隆等研究 , 都涉及批把属植物 DN A 的提
取 。 本文报道我们对 以批把属植物 叶片为材料的
D N A 提取进行研究 , 得到了较高质量 的 DN A ,所得
的 D N A 完 全 可 以 满 足 一 般 分 子生 物 学 研 究 如
P C R
、
R A PD
、
A F L P 等对 DN A 质量的要求 。
材料和方法
L l 材料
实验所用的批把栽培种和野生种的叶片材料
均取 自华南农业大学园艺学院批把 (果树 )种质 资
源圃 。 所用的种类和品种有 : 香花批把 、 椭圆批把 、
普通批把 (解放钟 、早钟六号 ) 、 广西批把 、 栋叶批把
等 。 分子生物学实验检测 中的 RA P D 、 A FL P 分析所
用材料包括我国已知 的批把属所有野生种 。
L Z 方法
1
.
2
.
1 试剂 A 、 提取缓 冲液 : 3% C T A B 。 B 、其他试
剂 : PV P ; V e ; p一琉基乙醇 ;ET Bu fe r (含 R N a s e ) ;氯
仿 一异戊醇 ( 2:4 1 ) ; 7 0% 乙 醇 ; 无水 乙醇 ; 异丙醇 ;5
m ol / L 氯化钠 ; 蛋白酶 K 。
1
.
.2 2 步骤 称取 2一3 9 材料 , 加入适量 P V P 和维
生素 C ,快速加入液氮研磨 。 至材料完全磨成粉末后
转人 巧 m L 含 .0 2%日一琉基乙醇 ( V八 ) 预热的 3%
C T A B 提取液 中 , 同时加人 10 0 林L 蛋 白酶 K (4 m g /
m L )
,
6 5℃水浴 3 0 m in ,期 间颠倒混匀数次 。 取出离
心管后冷却至室温 , 加人 巧 m L 氯仿一异戊醇 ( 24 :
l )
,上下轻柔颠倒混匀 10 m i n 。 4 0 0 0 r/ m i n , 4℃离心
巧 m in 后取上清液 ,再用氯仿一异戊醇提取 1 次 ,如
上离心 。 小心吸取上清液 , 加人预冷 的 23/ 体积的
异丙醇 。 一 2 0℃放置 3 0 m in 沉淀 D N A ,挑出 D N A 。 用
7 0%乙醇洗 2 次 , 风干 。 加 0 . 3一 0 . 5 m L 含 1 0 林g / m L
R N A 酶的 ET 溶解 , 5 ℃放置 60 m in 。 加人等体积的
氯仿一异戊醇 ( 2 4 : l )重新抽提 l 次 , 6 0 O0 r/ m i n 、 4℃
离心 or m in 。 小心吸取上清液 , 加人 1/ 2 体积的 5
m ol / L 氯化钠 , 再加人 2 倍体积冷无水乙醇 , 一20 ℃
放置 3 0 m i n 。 挑出沉 淀或 10 0 0 0 r/ m in 、 4℃离心 5
m in
,
7 0% 乙醇洗沉淀 2 次 。 风干后用 0 . 1一 .0 5 m L 的
I X T E 溶解 , 一2 0℃或 4℃保存备用 。
2 一般浓度检测及分子生物学实验检
测
.2 1 纯度及浓度检测
D N A 提取完成后 , 取 5 林L 原液稀释 10 倍 ,用
B i o p h o to m e t e r (核酸蛋白检测仪 )测其浓度和 O D 值 ;
取 4 林 L 原液稀释至 2 0 林 L 在 .0 8%琼脂糖凝胶中电
泳 , 检测质量 。
.2 2 R A P D 反应
参照一般 R A P D 反应体系步骤进行 。
.2 3 特异 P C R 反应
在比较其他物种上 已克隆的 LEA 汀 ( L FY )同
源基因序列的保守区后设计 了 1对长度均为 25 b p
的兼并引物 ,利用该对引物对批把的 L FY 同源基 因
进行克隆 。 具体实验步骤略 。
2
.
4 A F L P 反应
所用 内切酶为 M BI 公司生产 。 A F LP 试剂盒为
北京鼎国公 司产品 ,操作步骤略 。
3 结果与讨论
3
.
1 D N A 提取
针对批把富含酚类物质的特点 , 在提取起始的
研磨阶段就加人 PV P 和维生素 C , 对防止后面提取
步骤中 D N A 褐变起到了有效的抑制作用 。 在提取缓
冲液中加人 p一琉基乙醇也起同样的作用 ,多种抑制
因子的加入有效的防止了 D N A 在提取过程 中的褐
变 。 蛋白酶 K 的加入能在降低 D N as e 和 R Nas e 活性
的同时 ,亦能有效降解植物组织中与 D N A 结合的蛋
白质 ,从而避免蛋白质和 DN A 共沉淀 。 由于富含多
糖 ,在提取过程 中多次用氯仿一异戊醇抽提 ,在粗提
第 1次后得到大量成团状 、 赫稠的 D N A ,每 2 9 初始
材料可以得到很大数量 D N A 团 。 但电泳结果表明 ,
这些 D N A 多与多糖混 合在一起 , 胶孔 中残余的
D N A 很多 , 这是 由于多糖与 D N A 混合在一起 ,无法
在电流的作用下分离开 。 由于杂质多 ,无法用于后面
进一步分子实验 。 因此针对多糖含量多的原 因 , 对
第 1 次粗提 的结 果又进行 了 2 次氯仿 一异戊 醇重
复抽提 , 进一步提取可以很大程度上减少多糖的
含量 , 最后得到 的 D N A 成透 明絮状 , 电泳结果表
明 D N A 质量高 ,胶孔 中无 D N A 残 留 (图 1 ) 。
经 iB 叩ho ot m et er 纯度检测 其 A Z扩A 28D 值均可
达到 1 . 8 0一 1 . 9 0 ,其得率在 10一25 林g / m g FW 。 在 5 个
样 品中 , 以椭圆批把的得率最高为 25 . 0 林g / m g FW ,
22卷
4 8
.
5kb一
图 1 5个批把属材料 DN A提 取完成后电泳结果
1
. 入 DN ( A10 O gn )
.
2
. 香花批把 , 3 . 解放钟 , 4 . 广西批把 ,
5
. 栋 叶批把 , 6 椭 圆批把
F i g
.
1 A g a ro s e e le e t ro Ph o r e is s o f s e v e r a l Io q u a t
s Pe e ie s o r c u lt iv a r s
1
. 入D N A ( 10 0 n g ) , 2 . F r a邵a n t Io q u a t , 3 . J i e af n邵 110 : , g , 4 . K w a n g s i e r l s i s
lo q u a t
,
5
.
O a k le af lo q u a t
,
6
.
T ibe t l o q u a t
而普通批把 (解放钟 )的得率最低为 10 .5 林岁m g FW
(表 1 ) 。 经电泳检测可 以得到明显的主带 , 片段大小
约为 4 8 k b 。
1 2 分子生物学实验应用检测
我们用此方法提取 了批把属 2 4 个种质 (除了前
述的香花批把 、椭圆批把 、 普通批把 、 广西批把和栋
叶批把 ,还包括我国原产的批把属植物的大多数种 )
的 DN A ,并 以此为模板进行了 R A P D 扩增 , 均可以
获得清晰的扩增式样 (图 2 ) 。
用这种方法提取的 D N A 进行了分子克隆的实
验 : 利用本实验方法所提取的 D N A , 已 经分别克隆
表 1 不同批把属植物 D N A 的质且和得率
T a b le 1 G e n o m ic D N A qau li ty a n d y i e ld fr o m d i fl 短er nt lo qu a t s eP e i e s
项 目
l t e m s
A洲 / A ,
浓度 (n留 闪〕
得率 (卜 g / m g f ’ W )
香花批把
F ar g ar n g lo q u a t
1 8 6
7 5刀
18 8
椭圆批把
『
r ib e t lo q u a L
1 9 6
10 0
.
0
25
.
0
普通批把 (解放钟 )
C o m m o n lo q u a t ( Ji e af n邵 11 ;, n g)
广西批把
K w a n g s i e 苦一5 15 l o q u a t
1
.
8 3
4 2
.
0
10
.
5
1
.
8 8
5 0
.
0
12
.
5
栋叶批把
O a k le盯 lo q u a t
1
.
8 9
4 5 0
1 1
.
3
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 13 1 4 15 1 6 1 7 18 19 2 0 2 1 2 2 23 24
2 0 0 一
0 0 一
750 一
5 0 一
250一
10a 一
图 2 2 4 个批把属材料 R A P D
1一24 泳道分别是 : 1 . 大渡河批把 l* ; 2 . 大渡河批把 2 ; 3 . 栋叶批把 洪 . 腾越批把 ; 5 南亚批把 ;6 南亚批把窄叶变型 ; 7 . 大花批把 ; 8 .香花批把 l ;
9
. 香花批把 2 ; 10 .香花批把 3 ; 1 .广西批把 l ; 12 . 广西批把 2 ; 13 .台湾批把 卜 14 .台湾批把 2 ; 15 . 台湾批把恒春变型 I ; 16 .台湾批把恒春变型 2 ;
17
. 小叶批把 ; 18 . 窄叶批把 ; 19 . 椭圆批把 l ; 2 0 . 怒江批把 1 ; 21 . 怒江批把 2 ; 2 2 . 椭圆批把 2 ;23 . 广西批把 3 ; 24 . 齿叶批把
, 名称后的数字表示不同来源的单 株
F i g
.
2 R A P D P a et
r n o f 24 sP e e i e s o f lo q u a t
La n e
,
1 t o 2 4 : 1
.
D a d u h e Io q u a* l ; 2
.
D a d u h e Io q u a t Z ; 3
.
O a kl e af lo q u a r ; 4 eT
n gy u e l o q u a t : 5
.
B e n , l l o q u a t : 6
.
N a or w l
e af lo q u a一: 7
.
Bi酬 o w loq u a r :
8下 r a g ar n t lo q u a t l : 9 . F r a g ar n t l o q u a [ 2 ; 10 . Fagr r a n t lo q u a门 ; 1 1
.
Kw a n g s i e n s i s lo q u a t l ; 12
.
Kw a n g s i e ll s i s lo q u a t Z ; 13
.
aT i w
a n lo q u a t l ; 14
.
Ta i w a n
Io q u a t Z ; 15
.
Ko k sh u n lo q u a t l ; 16
.
K o k s l l u n lo q u a t Z ; 17
.
Se即 i n lo q u a一; I S . H e ,1叮 Io q u a t ; 19 . T ib e t l o q u at l ; 2 0 . S a lw in lo q u a t l : Z l . Sal w i n lo q u a t l ;
2 2
.
iT b e t l o q u a t Z ; 2 3
.
K w an 邵 i e n s i s lo q一 a t 3 ; 24
.
Se r a t e l叫 u a t
冰 D a t e aft
e r n a m e i n d i e a r e in di v饭d u al p la n t f诵 n l d i里介 er n t o ir g i n
到 了批把 成 花相 关 的几 个基 因片 段 , 如 ej L刀
( A Y 5 5 1 18 3 ) (图 3 ) 。
对我们收集到的近 2 0 个种 (包括前述的 5 个
种和其他的批把属野生种 )进行 A F LP 实验 ,结果表
明能扩增 出清晰的条带 (图 4 ) ,说明得到的 DN A 质
量高 ,能满足 A F LP 实验中酶切的要求 。 有关批把属
植物的上述实验结果将另文报道 。
这些结果说 明此方法确实能降低次生物质对
D N A 的污染 , 获得高质量的 D N A 。进一步实验证实 :
C T A B一蛋白酶法不仅适用于普通批把和野生批把 ,
同样也适用于荔枝 、 龙眼 、 莲雾 、 柑橘等木本果树
D NA 的制备 。
目前 , 我们 以提取到的高质量的批把属植物
DN A 为材料 , 进行了一系列分子生物学方面 的研
2 期 刘月学等 : 批把属植物基 因组 D N A提取方法 的改进及其应用 18 5
究 , 取得了较好进展 。 希望能对批把这一起源于我
国的果树 的分子生物学研究有所帮助和推动 。
参考文献 :
图 3 特异 P C R
l
.
D L Z以 X) M a r k e r ; 2 . 目的片段
iF g
.
3 F r a gm e n t a m P I讯e d fr o m D N A o f l o q u a
1
.
D LZ 《X洲) M ar k e r ; 2 . T a r邵 t f r a g r n e n t
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ] 1 12 ] 3 14 15 ] 6 17 1 8 19 20 2 1 2 2 2 3 2 4
图 4 24 份批把属 材料 A F L P 电泳结果
F ig
.
4 A F L P o f 24 m a te ir a ls o f lo q u a t
【1 林顺权 ,杨向晖 , 刘成 明 , 等. 中国批把属植物的 自然地理 分布 IJ] .
园艺学报 , 2 0 0 4 , 3 1(5 ): 5 6 9 一5 7 3 .
121 郑 国华 , 郑育俊 , 何文庆 . 批把基 因组 D N A 分离技术及浓度测定
[J ]
. 福建农业科技 , 2 0 0 0 , ( 6 ) : 13一 15 .
【31 程运 江 ,伊华林 , 庞晓明 , 等 . 几种木本果树 D N A 的有效提取 l[J .
华中农业大学学报 , 2 0 1 , 10 :4 8 1~ 4 8 .3
14】 B刻 e , , e s M L , Can y a m as T , R o m ero C , e t a] . eG n e t i e di v e o iyt o f a
Eu or p e a n ( o lle e t i o
ll of l叫u a t }万r i o b o r卿 j 甲 o n ic a价 u n l ) . ) L i n d l .」d e -
t e mr i
n e d b y : n o l e o u la r ,n a r k e sr 【C」. o p t i o n s M通d i t e r a n ` e n n e s : Por -
e
ed i
n邵 for 一n th e if sr t In te rn at i o n al l叫u at 叮呷。 幼u m , 2X() 3· 5 3一 5 6 .
5[ 」潘新法 , 孟祥勋 , 曹广 力 ,等 , RA PD 在批把品种鉴定中的应用 IJ]
.
果树学报 , 2 0() 2 , 19 ( 2 ) : 13 6一 13 8 .
6[ } 陈 义挺 , 赖钟雄 . 郭志雄 . 等 . 批把 主要种类的 以 PD 分析 [J] . 江
西农业大学学报 , 2 0 0 3 . 2 5 ( 2 ) : 2 5 8一 2 6 1 .
【7] 邹喻萍 , 葛颂 , 王晓东 . 系统与进化植物学 中的分子标记【M] .北
京 : 科学出版社 , 2 0 1 . 10 一 3 a
【8】 C he : 1 D H , Ro n a ld CP . A r a p id D N A m i n ip re p a rat i o n m e th o d s u i t a ble
fo r A F LP an d
o ht er 代R a p plica 巨朋切. lP an t Mol 肠。 R eP , 19 9 , 1:7
5 3 一5 7
.
Ig J K h a n uj a S p S
,
S h a s a n y A K
,
Da or k ar M p
,
e t al
.
R a p id i s o la t i o n o f
P e R a m v一i if a b l e D N A fro m th e d口 a n d fre s h s a m p le o f p la 一l t p ro d u e -
in g l a r g e a n l o u n t s o f s e e o n dary m
e t a b o l i t e s a n d e s s e n t i a l 0 11、 b y
n l o d i if e d CT A B P r o e e d u re lJ ]
.
P la n t M o l B i o l R e p
,
19 9 9
,
17 : l一 7 .
【]0 } P o re b s ki S , B a i le y L G , B e r n a dr R . M o d i if e a t i o n o f a CT A B D N A e x -
t r a e t i o n p or t o e o l fo r p la n t s e o n t a in i一, 9 h igh p o ly s a e e har id e a n d
P o l y p h e n o l e o m p o n e n t s 【刀. p l a n* M o l B i o R e p , 19 9 7 , 15 ( l ): 8 一 15 .
[川 F a n g G , H a n l m a r S , G ru m e 龟 R A . Qu i e k a n d in e x p e n s i v e m e th o d fo r
re m o v i
n
g 即 ly s ac e h iar d e s fro m p la n t 罗 n o n云e D N A [刀. B i o t e e h n iq u e s ,
19 9 2
.
13 : 5 2一 5 4 .
[ 12 ] w
a n g x D
.
W
a n g z p
,
z o u Y p
.
A n i m p ro v e d p ro e e d u re fo r n u c l e a r
D N A isoj
a t i o n 阮 : n s i lj e a es g e l idr ed le a v e s o f w i ld 『叩e l刀. lP a n t M o l
B10 1 R e P
,
19 9 6
,
14: 3 6 9一 3 7 3
.