全 文 ：园　艺　学　报　2002 , 29 (6):505 ～ 509
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2002-04-09;修回日期:2002-06-19
基金项目:北京市重点实验室 “果树逆境生理与分子生物学实验室” 资助项目;教育部优秀教师教科奖励基金资助项目
＊通讯作者。
抗旱性不同的苹果属植物水分胁迫下核酸代谢及自
由基变化
曹　慧　韩振海＊　许雪峰
(中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094)
摘　要:水分胁迫引起苹果属植物中抗旱性较弱的平邑甜茶和抗旱性较强的新疆野苹果幼苗叶片相对
含水量 (RWC)、 DNA、 RNA含量下降 , O-·2 、 H2O2 含量增高 , DNase、 RNase活性上升;其中 DNA含量下降
的幅度小于 RNA , DNase活性上升的幅度小于 RNase。抗旱性较强的新疆野苹果在水分胁迫下幼苗叶片的
RWC 、 DNA、 RNA含量下降的幅度以及 O -·2 、 H2O2 含量增高 、 DNase、 RNase 活性上升的幅度均小于抗旱性
较弱的平邑甜茶。水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果幼苗叶片的 DNA、 RNA含量与 RWC、 O-·2 、 H2O2含量
和 DNase、 RNase活性间均呈显著相关。
关键词:苹果属;水分胁迫;核酸代谢;自由基
中图分类号:S 661　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2002)06-0505-05
水分不足是许多地区农业发展的瓶颈〔1〕 。水分胁迫可破坏植物体内的水分代谢 , 导致形态及生理
生化代谢的变化 。关于水分胁迫期间植物核酸代谢变化的报道多集中于小麦 、 玉米 、 高粱等大田作
物〔2 ,3〕 , 木本果树方面报道较少〔4〕 。水分胁迫可破坏植物体内的活性氧代谢〔5～ 7〕 , 但水分胁迫下核酸
代谢和自由基活性氧代谢间的关系尚未见报道。本试验选用抗旱性较强的新疆野苹果和抗旱性较弱的
平邑甜茶营养液水培苗为试材 , 研究了水分胁迫下核酸代谢及与自由基变化的关系 , 以探讨水分胁迫
下不同类型苹果属植物的抗旱生理机制 , 为果树抗旱育种和高优栽培提供理论依据 。
1　材料与方法
抗旱性较弱的平邑甜茶 (Malus hupehensis pamp Reld.)与抗旱性较强的新疆野苹果 〔M .sieversii
(Ledeb)Roem.〕〔8～ 10〕种子经4℃层积处理发芽后播入蛭石中 , 温室内培养。待幼苗长到 4片真叶移至
1/2 Hoagland营养液培养 1周 , 然后以Hoagland营养液培养 , 营养液初始 pH 用KOH 调至 6.0 。每周
更换 1次营养液 , 每天定时通气 , 日光灯恒定光源 , 光照 14 h , 光照强度 400 μmol·m-2·s-1 , 温度为
白天 22 ～ 28℃, 夜间 17 ～ 21℃。选取生长一致的 10周龄幼苗移入含有 20%PEG 6 000的营养液中进
行水分胁迫处理 , 对照为正常营养液水培 , 重复 6次。从胁迫处理第 1天开始 , 每 2 d取样 1次 (早
晨8时取样), 叶片取自幼苗顶端第 3 ～ 5片叶。
叶片相对含水量 RWC测定按文献 〔11〕 的方法 。O-·2 含量的测定按王爱国等〔12〕的方法:称取 2 g
叶片 , 加入 65 mmol·L-1PBS (pH 7.8), 冰浴研磨成匀浆 , 4 层纱布过滤 , 5 000×g (4℃)离心
10 min。取 1 mL上清液加入 0.9 mL上述缓冲液和 0.1 mL 10 mmol·L-1盐酸羟胺 , 25℃温育 20 min ,
取 0.5 mL 温育液加入 0.5 mL 17 mmol·L-1对氨基苯磺酸 , 再加入 0.5 mL α-萘胺 , 于 25℃下反应
20 min , 最后加入同体积乙醚充分摇动 , 1 500×g 离心 5 min , 取粉红色水相测 530 nm 的 OD值。同
时做NO2-标准曲线 , 将 〔NO2-〕 乘以 2得 〔O-·2 〕, 结果以 O-·2 nmol·min-1·mg-1protein 表示 。样品提
取液的蛋白含量按 Bradford〔13〕的方法测定 , 用牛血清蛋白 (BAS)作标准曲线 。H2O2 含量的测定按林
植芳等〔14〕的方法:称 2 g 叶片加入预冷的丙酮研磨提取后 , 取 1 mL提取液加入 0.1 mL 含 20%TiCl4
的浓盐酸溶液 , 再加入 0.2 mL浓氨水 , 3 000×g 离心 10 min , 用丙酮洗过氧化物—Ti复合物 5次 ,
以减少色素干扰 。沉淀溶于 3 mL 1 mol·L-1的 H2SO4 中 , 测定 410 nm处的 OD值 。同时做 H2O2标准
曲线 , 结果以H2O2 μmol·g-1DM 表示。核酸水解酶活性的测定:称取 0.5 g 叶片在液氮中研磨成粉
末 , 加入 0.1 mol·L-1醋酸—醋酸钠缓冲液 (pH 5.5)及少量 PVP 匀浆 , 27 000 ×g 离心 (4℃)
20 min , 取 100μL上清液加入 20 μL酵母 RNA 溶液 (10 mg·mL-1 , 用前透析除去小分子量核苷及寡
核苷酸)用于 RNase测定;或小牛胸腺 DNA溶液 (1 mg·mL-1 , 使用前 100℃加热 10 min 后迅速冷却
至室温进行变性处理)做 DNase测定 。混匀后水浴 (37℃)1 h , 加入 95%乙醇 800 μL , 混匀后立即
置于-20℃冰箱终止反应 , 12 h后 20 000×g (4℃)离心 , 沉淀未酶解的 RNA 和 DNA。上清液稀释
20倍分别在 260 nm下比色 。根据与对照样品间OD260差值计算酶活力 , 以每毫克蛋白每小时变化 1.0
OD260 (37℃)定义为 1个酶活力单位 。样品提取液的蛋白含量按 Bradford〔13〕的方法测定 。用紫外分光
光度法 (λ=260 nm)测定核酸总量 , 作DNA标准曲线 , 对样品液再进行二苯胺反应 , 测定595 nm处
的OD值 , 从标准曲线上查出相应的 DNA浓度 , 计算 DNA的含量〔15〕 。依据 RNA =核酸总量-DNA ,
计算 RNA含量。
2　结果与分析
2.1 　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片
RWC的变化
从图 1可知 , 在正常营养液中 , 两个苹果属
植物之间 RWC的变化差异不显著;但随着胁迫时
间的增加 , RWC均呈下降趋势 , 抗旱性较强的新
疆野苹果 RWC的下降幅度显著低于抗旱性较弱的
平邑甜茶 。胁迫第 5 天平邑甜茶比对照降低了
29.9 %, 第11天比对照降低了 46.6 %;新疆野
苹果胁迫第5天比对照降低了 22.4 %, 胁迫第 11
天比对照降低了 33.4 %。
2.2 　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片 O-·2
含量的变化
在正常营养液培养条件下 , 两个苹果属植物
叶片之间O-·2 的含量差异不显著 (图 2)。水分胁
迫下抗旱性较弱的平邑甜茶叶片内 O-·2 含量随着
图 1　水分胁胁迫对平邑甜茶 (A)和新疆野苹果 (B)
幼苗叶片 RWC的影响
Fig.1　Effects of water stress on leaf RWC in M.hupehensis (A)
and M.sieversi i (B)seedlings
迫时间的延长呈现上升趋势 , 胁迫第 5天叶片 O-·2 含量比对照提高 58.8 %, 胁迫第 11天比对照提高
160.3 %;抗旱性较强的新疆野苹果O-·2 含量的上升幅度较缓慢 , 胁迫后第 5天叶片 O-·2 含量才显著
上升 , 比对照提高了 20.6 %, 胁迫第 11天比对照提高了104.8 %。
2.3 　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片 H2O2 含量的变化
在正常营养液培养条件下 , 两种植物叶片之间H2O2的含量差异不显著 (图 3)。水分胁迫下抗旱
性较弱的平邑甜茶叶片内 H2O2含量在胁迫 3 d后大幅度上升 , 胁迫第 5天比对照提高了 48.3 %, 胁
迫第 11天比对照提高了 128.7 %;抗旱性较强的新疆野苹果 H2O2含量的上升幅度较缓慢 , 到胁迫第
5天叶片 H2O2 含量才明显上升 , 比对照提高了 27.3 %, 胁迫第 11天比对照提高了 99.8 %。
2.4 　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片核酸酶活性的变化
水分胁迫下 , 两种植物叶片内的 DNase 和 RNase活性均呈上升趋势 (图 4)。胁迫第 5天平邑甜
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茶 、新疆野苹果叶片 DNase 活性分别为对照的 1.5倍和 1.2 倍 , RNase 活性分别为对照的 2.6倍和
2.1倍 , 胁迫第 11天 DNase活性分别为对照的 2.2倍和 1.7倍;RNase活性分别为对照的 4.3倍和 3.3
倍。从图中还可以看出 , 两种植物叶片内 DNase 和 RNase 活性变化差异明显 , 抗旱性较强的新疆野苹
果上升的幅度明显低于抗旱性较弱的平邑甜茶 , 其中 RNase活性上升的幅度显著高于 DNase活性上升
的幅度 , 说明 RNase比 DNase更易受到水分胁迫的影响。
2.5 　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片核酸含量的变化
由图 5可知 , 水分胁迫下 , 两种植物叶片内 DNA和 RNA含量均呈下降趋势 , DNA含量在整个水
分胁迫期间的变化幅度比 RNA含量的变化幅度小 , 其中抗旱性较强的新疆野苹果 DNA 、 RNA 含量的
下降幅度均低于抗旱性较弱的平邑甜茶 。胁迫第 5天平邑甜茶 、 新疆野苹果叶片 DNA含量分别比对
照降低了 14.2 %和 10.5%, RNA含量分别比对照降低了 28.3 %和 16.3 %, 胁迫第 11天 DNA分别
比对照降低了 59.4 %和 48.6 %;RNA分别比对照降低了 81.3 %和 58.2 %。
图 2　水分胁迫对平邑甜茶 (A)和新疆野苹果 (B)幼苗叶片
O
-·
2 含量的影响
Fig.2　Effects of water stress on O-·2 contents in leaves of
M.hupehensis (A)and M.sieversii (B)seedlings
图 3　水分胁迫对平邑甜茶 (A)和新疆野苹果 (B)幼苗
叶片 H2O2含量的影响
Fig.3　Effects of water stress on H2O2 contents in leaves of
M.hupehensis (A)and M.sieversii (B)seedlings
图 4　水分胁迫对平邑甜茶和新疆野苹果幼苗叶片 DNase
和 RNase活性的影响
Fig.4　Effects of water stress on DNase and RNase activities in
leaves of M.hupehensis and M.sieversii seedlings
图 5　水分胁迫对平邑甜茶和新疆野苹果幼苗
叶片核酸含量的影响
Fig.5　Effects of water stress on nucleic acid content in
leaves of M.hupehensis and M.sieversii seedlings
5076 期　　　　　　　　曹　慧等:抗旱性不同的苹果属植物水分胁迫下核酸代谢及自由基变化　　　　　　　　
2.6 　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片核酸代谢的相关回归分析
通过分析水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片核酸代谢的相关性可以看出 (表 1), 水分胁迫
下DNA 、 RNA含量与叶片 RWC 、 O-·2 、 H2O2 及 DNase、 RNase间均呈显著相关。说明水分胁迫下苹果
属植物叶片DNA 、 RNA含量的下降可能有以下 3 方面的原因:(1)DNase和 RNase 活性提高 , DNA 、
RNA分解加剧;(2)活性氧增加 , 膜脂过氧化加剧 , DNA 、 RNA合成受抑;(3)增加的活性氧可直接
损伤核DNA , 活性氧剪切破坏 DNA双螺旋结构 , 导致DNA降解 , 活性氧对 DNA还有降解和修饰作用。
表 1　水分胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片核酸代谢的相关回归分析表
Table 1　Correlation and linear analysis of nucleic acid metabolisms in M.hupehensis and M.sieversii seedlings under water stress
相关因素
Correlation factor
平邑甜茶 M.hupehensis
回归方程
Linear regression
相关系数
Correlation coefficient
新疆野苹果 M.sieversii
回归方程
Linear regression
相关系数
Correlation coef ficient
RWC , DNA Y=0.079+0.017X 　0.8024＊ Y=-0.176+0.0203X 　0.8211＊＊
RWC , RNA Y=-6.725+0.192X 　0.8432＊＊ Y=-6.465+0.1875X 　0.8341＊＊
O
-·
2 ,DNA Y=2.027-0.072X -0.7817＊ Y=2.058-0.073X -0.7566＊
O
-·
2 , RNA Y=14.555-0.752X -0.8684＊＊ Y=14.082-0.6549X -0.8526＊＊
H2O2 , DNA Y=2.098-0.039X -0.7652＊ Y=2.192-0.040X -0.7640＊
H2O2 , RNA Y=15.491-0.421X -0.8634＊＊ Y=15.242-0.361X -0.8485＊＊
DNase ,DNA Y=2.315-0.636X -0.8413＊＊ Y=2.644-0.825X -0.8338＊＊
RNase , RNA Y=13.147-0.564X -0.8231＊＊ Y=13.249-0.514X -0.8124＊＊
3　讨论
本试验结果表明 , 水分胁迫引起抗旱性不同的苹果属植物叶片内 DNA含量 、 RNA 含量下降 , 抗
旱性较强的新疆野苹果下降的幅度低于抗旱性较弱的平邑甜茶 。水分胁迫下平邑甜茶 、 新疆野苹果叶
片中的 RWC与 DNA含量 、 RNA含量均呈显著正相关 。
自然衰老和环境胁迫都可导致水解酶活性逐步升高。DNase 、 RNase分别是 DNA 、 RNA 代谢的关
键酶〔16〕 , 水分胁迫促进了 RNase的重新合成 , 胁迫引起膜结构破坏 , 促使 RNase 从细胞器的区隔中
释出 , 增强了酶活力 , 而 RNase活力的增加是植物组织趋向衰老的一个重要指标〔16〕 。本试验结果表
明 , 无论是抗旱性较弱的平邑甜茶还是抗旱性较强的新疆野苹果 , 其地上部叶片的 DNA 、 RNA含量
均与 DNase、 RNase活性呈显著负相关 。从而说明水分胁迫下 DNA 、 RNA含量的下降与 DNase 、 RNase
活性提高有直接关系 。
许多研究表明 , 干旱胁迫下植物细胞膜系统受到破坏而引起膜透性增加 , 愈是抗旱性弱的品种增
加的幅度愈大 , 即膜系统受到的破坏愈大 , 膜系统的破坏引起某些物质从细胞区隔中释放出来 , 可能
是激活DNase 、 RNase活性的直接或间接原因之一〔17〕。水分胁迫下增加的活性氧导致膜脂过氧化 , 甚
至直接损伤核 DNA , 剪切破坏DNA双螺旋结构 , 导致DNA的降解 , 对DNA分子发生剪切 、 降解和修
饰 , 从而使DNA分子发生断裂 、损伤和破坏〔18 ,19〕 。本试验结果表明 , 水分胁迫下抗旱性较弱的平邑
甜茶及抗旱性较强的新疆野苹果叶片的O-·2 和H2O2 含量增加 , 其中平邑甜茶 O-·2 、 H2O2 含量的增加
幅度明显高于新疆野苹果 。且不论是抗旱性较弱的平邑甜茶还是抗旱性较强的新疆野苹果其叶片内的
O
-·
2 、 H2O2含量与其叶片内的 DNA 、 RNA含量间均呈高度负相关。由此看来 , 水分胁迫下活性氧自由
基累积 , 使膜结构遭到破坏 , 引起植物组织衰老的启动。衰老启动后核酸水解酶活性迅速上升 ,
DNA 、 RNA各组分有序降解 , 核酸含量下降。不同抗旱性的苹果属植物对水分胁迫敏感程度的不同 ,
表现于其 DNA 、 RNA含量的不同变化幅度和包括其他测定指标出现显著变化的胁迫时间的差别。抗
旱性较强的新疆野苹果的 RWC下降 、 DNase 、 RNase活性的增高均滞后于抗旱性较弱的平邑甜茶 。因
此 , 水分胁迫下 DNase 、 RNase活性的变化与 DNA 、 RNA含量的变化可作为衡量苹果属植物对水分胁
迫敏感程度强弱的生理生化指标 , 也可作为反映苹果属植物抗旱性的参考指标 。
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Effects of Water Stress on Nucleic Acid Metabolisms and Changes of Free Radi-
cals in Malus
Cao Hui , Han Zhenhai , and Xu Xuefeng
(Institute for Horticultural Plants , China Agricultural University , Beijing 100094 , China)
Abstract:Effects of water stress on nucleic acid metabolisms and changes of free radicals in Malus hupehensis
pamp Reld.and Malus sieversii(Ledeb)Roem.seedings were studied with polyethylene glycol(PEG 6000)treat-
ment.Under water stress , the contents of RWC , DNA and RNA in leaves decreased , while the content of O-·2 and
H2O2 , the activities of DNase and RNase increased.Compared with RNA , the less decrement of DNA content was
accompanied with higher activity of DNase.The changing extents in RWC , active oxygen , DNA , RNA , DNase and
RNase in the drought tolerant variety M.sieversii were lower than the drought resistant variety M.hupehensis.Un-
der water stress , there are high significant correlation between DNA , RNA content and DNase , RNase , RWC ,
O
-·
2 , H2O2 in M .hupehensis pamp Reld.and M.sieversii (Ledeb)Roem.seedings.
Key words:Malus;Water stress;Nucleic acid metabolism;Free radicals
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