全 文 :·植物保护· 北方园艺2014(06):128~131
第一作者简介:刘胜贵(1965-),男,湖南宁乡人,硕士,教授,现主
要从事药用植物栽培与药理作用等研究工作。E-mail:swlsg@
163.com.
基金项目:湖南省教育厅科研资助项目(11C0988);湖南省重点学
科建设资助项目。
收稿日期:2013-12-10
悬钩子属植物提取物的抑菌效果及抗氧化性研究
刘 胜 贵,李 路,左 清 清,刘 光 华
(怀化学院 生命科学系,民族药作植物资源研究与利用湖南省重点实验室,湖南 怀化418008)
摘 要:以8种悬钩子属植物为试材,采用药敏纸片法和二倍稀释法测定了悬钩子属植物提
取物对黄色葡萄球菌、鸡沙门氏杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌圈直径和最小杀
菌浓度的影响,利用Fenton反应、邻苯三酚自氧化法,测定植物水提取物的抗氧化能力,研究蔷薇
科悬钩子属植物的抑菌效果和抗氧化性,以评价悬钩子属植物的抗菌活性和抗氧化活性。结果
表明:悬钩子属植物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最好,其中山莓、插田泡和茅莓对
金黄色葡萄球菌的MBC值达到了37.5mg/mL;悬钩子属植物对羟基自由基(·OH)和超氧阴离
子自由基(O·2 )均有一定的清除能力,其中粗叶悬钩子、茅莓和山莓的清除能力较强。表明山莓、
茅莓、插田泡可以作为新的抑菌药物进行开发,粗叶悬钩子、茅莓和山莓可作为新的抗氧化药物
利用。
关键词:悬钩子属;植物提取物;抑菌作用;抗氧化性
中图分类号:S 663.2 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)06-0128-04
悬钩子属(Rubus L.)是蔷薇科(Rosaceae)中的一个
大属,全世界有750余种,有210多种,北到大兴安岭,南
至海南,东至台湾,西到新疆均有分布,长江以南及西北
地区多见。在我国民间,悬钩子属果实可以食用,种
子、根及叶均可入药,具有悠久的药用历史[1-2]。我国自
20世纪80年代以来,对悬钩子的研究利用引起了人们
的关注,对其果实、叶、根、茎等的活性成分进行分析,发
现悬钩子属植物含有丰富的维生素、挥发油、黄酮、萜及
甾体类等活性成分。悬钩子属植物果实和根茎叶富含
多酚类,具有很强的清除自由基和抗脂质过氧化作
用[2-7]。我国对于悬钩子属植物的抑菌性和抗氧化性的
研究大多只局限于少数种。该试验根据怀化市悬钩子属
植物分布情况,挑选了8种悬钩子属植物进行抑菌试验和
清除自由基试验的研究,以期了解悬钩子属植物抑菌
The Inspection of UPLC-MS/MS for the Residue of Carbamate Pesticides in Vegetable
ZHANG Hai-xia1,CHEN Qing-qi 2,XU Jing1,YANG Jing1
(1.Harbin Inspecting and Detecting Center for Agricultural Products Safety and Quality,Harbin,Heilongjiang 150070;2.Harbin Academy of
Agricultural Science,Harbin,Heilongjiang 150070)
Abstract:Taking tomato,eggplant,summer squash,Chinese cabbage and cabbage as materials,twelve carbamate pesticides
detecting methods in vegetable was established by utilizing UPLC-MS/MS technique.The results showed that the sample
was extracted by acetonitri,purified by amino column and separated by water BEH T3column.The detecting aims were
determinate in multiple reaction monitoring(MRM)mode.External standard method was used to determine the residue
contents.As a result,the detecting aims were with a good linear relationship(r2>0.99)in quality concentration range
from 1μg/L to 100μg/L,and blank sample substrate added to three levels adding standard sample trial,the recowery
ranges were from 65.2%to 119.2%with the relative standard deviations(RSDs)5%.The method is highly sensitive and
precise and selective,it can be satisfied with those detecting needs for the residue of carbamate pesticide.
Key words:UPLC-MS/MS;vegetable;carbamate pesticides;vestigital
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北方园艺2014(06):128~131 ·植物保护·
效果作用和清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试8种悬钩子属植物分别为灰毛泡(Rubus
irenaeus Focke.)、白叶莓(R.innominatus S.Moore)、山莓
(R.corchorifolius L.f.)、插田泡(R.coreanus Miq.)、茅莓
(R.parvifolius L.)、东南悬钩子(R.tsangorum Hand.-
Mazz)、粗叶悬钩子(R.alceaefolius Poir.)、空心泡(R.
rosaefolius Smith.),均采于湖南省怀化市中方县康龙自
然保护区。
供试菌种分别为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus 91053)、鸡沙门氏杆菌(Salmonela pulorum)、大
肠杆菌(Escherichia coli O1)、粪肠球菌(Enterococcus
faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)由怀
化学院微生物学实验室提供。
LB液体培养基:酵母膏5g,蛋白胨10g,NaCl 10g,
无菌水1 000mL,pH 7.0;LB固体培养基:酵母膏5g,蛋
白胨10g,NaCl 10g,琼脂16g,无菌水1 000mL,pH 7.0。
1.2 试验方法
1.2.1 植物提取物制备 植物提取物的制备根据文献
[8-10]方法进行,并稍加改动。将采集的植物洗净,在室
温下干燥,60℃烘干至恒重,碾成粉末。称取试验粉末
25g置三角烧瓶中,再加150mL溶剂,用保鲜膜封口,
25℃、120r/min摇床培养48h。过滤得滤液,滤渣再加
入150mL相同溶剂,用同样方法再提取48h,过滤得滤
液。将2次滤液混合,用旋转蒸发仪浓缩。分别用石油
醚、乙醚、氯仿、甲醇、蒸馏水等5种溶剂浸提8种悬钩子
属植物,水提取物用真空冷冻干燥机干燥成膏状物,其
余有机溶液提取物用风干的方式干燥成膏状物。提取
率(%)=膏状物重量(g)/25(g)×100%。
1.2.2 菌悬液制备 试验菌培养及菌悬液制备依据文
献[11]方法进行,将金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏杆菌、大
肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌分别接种在LB固体培
养基上,37℃活化培养24h。挑取活化后的菌落与无菌
生理盐水混合,并用生理盐水调至0.5MCF单位的标准
接种物,即为菌悬液浓度1×108~2×108 CFU/mL。再
用无菌生理盐水按10倍稀释法将标准接种物配制成菌
悬液浓度1×106~2×106 CFU/mL。
1.2.3 抑菌圈直径测定 采用药敏纸片法测定抑菌圈
直径[12-13],将定性滤纸打成直径为6mm的圆形滤纸片,
灭菌后干燥,分别浸在浓度为300mg/L的不同植物提
取物中。将剂量为2mL、8万U的庆大霉素溶液(相当
于80mg)稀释到2mg/mL的浓度,使每片滤纸片中含
有10μg的庆大霉素,以此为对照(CK)。取出滤纸片,
晾干,即制成药敏纸片。在无菌操作条件下将灭菌后的
固体培养基倒入直径为75mm的无菌培养皿中,每皿
15~20mL,冷却制成平板。取0.1mL浓度为1×106~
2×106 CFU/mL的菌悬液,滴加于LB固体培养基平板
中央,涂布均匀。将含菌平板倒置干燥约3~5min后,
用无菌镊子取药敏纸片平贴在含菌平板上,每个平板
贴4个药敏纸片,并做好相应标记。然后放入37℃恒
温培养箱中倒置培养18~24h,测量抑菌圈直径,3次
重复。
1.2.4 MBC值测定 对山莓、插田泡、茅莓、东南悬钩
子等4种植物的提取物,经二倍稀释法稀释后,系列试
管中植物提取物浓度分别为300.00、150.00、75.00、
37.50mg/mL[14-15]。根据观察试管中培养物的浊度,以
肉眼观察下未见生长的药物最低浓度为最低抑菌浓度
(MIC),但是由于提取液本身呈深棕色,依据培养液的浊
度不能判断,因此只能进行涂布,依据 MBC值进一步判
断悬钩子属植物提取物的抑菌效果。测定其对金黄色
葡萄球菌、鸡沙门氏杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假
单胞菌的MIC值。在每支试管中加入0.1mL浓度为
1×106~2×106 CFU/mL的菌悬液,然后置于37℃下培养
24h,测定MIC值,3次重复。测定MIC值后,再从每个试
管中取0.1mL培养液涂布在琼脂平板上,在37℃下培养
24h,观察有无菌落生成。以使活细菌数量减少到起始数
量的0.1%的最低提取物浓度为最低杀菌浓度(MBC值)。
1.2.5 悬钩子属植物水提物清除羟基自由基能力测定
采用Fenton反应检测各种自由基清除剂对羟基自由
基(·OH)的清除作用[16-17]。该试验以清除羟自由基作
用呈明显量效关系的抗氧化剂硫脲作对照(CK),比较8
种浓度为100mg/L的悬钩子属植物水提物清除·OH
自由基的能力。E=(A样品 -A空白)/(A对照 -A空白)×
100%,式中,E为清除率、A样品为样品组的吸光度、A对照
为对照品的吸光度、A空白为空白组的吸光度。
1.2.6 悬钩子属植物水提物清除超氧阴离子自由基试
验 利用邻苯三酚自氧化反应测定自由基清除剂对其
产生的超氧阴离子自由基的清除作用[18-19],以维生素C
作对照(CK)。邻苯三酚自氧化的测定:吸取4.5mL浓
度为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.20)、4.2mL
蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃
预热的3mmol/L的邻苯三酚0.3mL,立即混匀,迅速
倒入比色池中,在320nm波长下每隔30s记录1次
吸光值,共测5min。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂对悬钩子属植物提取率的影响
由表1可知,不同溶剂对悬钩子属植物提取率的影
响较大,蒸馏水对东南悬钩子、白叶莓、灰毛泡、插田泡、
山莓5种植物的提取率最高;甲醇对粗叶悬钩子、茅莓、
空心泡3种植物的提取率最高;石油醚对8种悬钩子属
植物的提取率均最低。
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表1 不同溶剂对悬钩子属植物提取率的影响
Table 1 The efect of diferent solutions on extraction rates of the Rubus %
溶剂 东南悬钩子 粗叶悬钩子 白叶莓 灰毛泡 茅莓 插田泡 空心泡 山莓
石油醚 1.91 0.62 0.57 1.28 0.48 0.64 1.57 0.70
乙醚 2.65 1.51 1.63 1.88 1.61 3.23 2.18 0.98
氯仿 2.15 2.91 0.82 1.90 3.59 3.69 3.19 4.17
甲醇 4.85 7.69 1.27 2.81 8.02 7.88 3.85 1.39
蒸馏水 7.89 3.42 8.64 4.70 5.87 8.10 2.75 4.41
2.2 悬钩子属植物提取物的抑菌效果
2.2.1 不同悬钩子植物提取物对5个菌种的抑菌圈直
径的影响 由表2可知,8种悬钩子属植物提取物对供
试菌种都有一定程度的抑制作用,其中山莓、插田泡、茅
莓、东南悬钩子的提取物抑菌效果较好,且抑菌谱较广,
茅莓的提取物对大肠杆菌的抑制作用最好。
表2 不同悬钩子植物提取物对5个菌种的抑菌圈直径的影响
Table 2 The efect of diferent species of Rubus on inhibition zone diameter to five bacterial strains mm
大肠杆菌 粪肠球菌 金黄色葡萄球菌 鸡沙门氏菌 铜绿假单胞菌
庆大霉素 28.7 28.7 27.0 25.3 28.7
粗叶悬钩子 - - ± 8.0 -
山莓 9.3 8.0 9.3 10.0 8.0
白叶莓 ± - - - -
茅莓 18.3 8.0 9.3 14.0 ±
灰毛泡 - - - - -
东南悬钩子 ± 8.0 9.8 10.0 8.0
空心泡 - - - - -
插田泡 8.7 9.3 10.3 12.0 8.0
注:“-”表示无抑菌圈;“±”表示抑菌圈不明显。
2.2.2 不同悬钩子属植物提取物的最小杀菌浓度 由
表3可知,4种悬钩子属植物提取物均对供试菌种表现
出较好的杀菌效果,其中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌
的作用较强,对铜绿假单胞菌的作用较弱。其中,茅莓
和山莓的抑菌效果最强。
表3 4种悬钩子植物提取物对5个菌种的MBC值
Table 3 The MBC of 4species of Rubus to 5bacterial strains mg/mL
植物提取物 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 鸡沙门氏杆菌 铜绿假单胞菌 粪肠球菌
山莓 75.00 37.50 37.50 150.00 75.00
插田泡 37.50 75.00 75.00 300.00 150.00
茅莓 37.50 37.50 75.00 75.00 75.00
东南悬钩子 75.00 75.00 125.00 300.00 150.00
图1 各种悬钩子属植物水提物和硫脲对
羟基自由基的清除率曲线
Fig.1 Curves of hydroxyl radicals(·OH)scavenging rate of
8species of Rubus and thiourea
2.3 不同悬钩子属植物提取物的抗氧化性
2.3.1 不同悬钩子属植物提取物对羟基自由基清除率
的影响 由图1可知,悬钩子属植物水提取液对羟基自
由基的清除能力随浓度增大而增强,粗叶悬钩子和山莓
在各浓度下其清除羟基自由基能力比对照样品硫脲强,
在较高浓度时,茅莓、白叶莓和东南悬钩子水提物清除
羟基自由基能力比硫脲强。
图2 各反应体系中超氧阴离子自由基的氧化速率
随时间的变化
Fig.2 Curves of oxidation rate of superoxide
radicals(O·2 )respect to time
2.3.2 邻苯三酚自氧化法测定结果 由图2可知,大部
分悬钩子属植物水提物都能清除反应体系所产生的
O·2 ,粗叶悬钩子在低浓度时其清除超氧阴离子自由基
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能力比维生素C略强,但在较高浓度下则比维生素
C弱。
3 结论
该试验结果表明,悬钩子属植物对金黄色葡萄球菌
和大肠杆菌的抑菌效果最好,其中山莓、插田泡和茅莓
对金黄色葡萄球菌的MBC值达到了37.5mg/mL;悬钩
子属植物对羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基
(O·2 )均有一定的清除能力,其中粗叶悬钩子、茅莓和山
莓的清除能力较强。研究结果表明,山莓、茅莓、插田泡
可以作为新的抑菌药物进行开发,粗叶悬钩子、茅莓和
山莓可作为新的抗氧化药物利用;悬钩子属植物提取物
具有较强的抗菌作用和抗氧化作用,且因其果实富含各
种营养成分,根、茎、叶可以入药,悬钩子属植物具有很
高的药用价值和保健功效,有较大的开发潜力。目前国
内对悬钩子属植物的研究和利用还比较少,大都是调查
资源分布情况,该文通过对抗菌活性和抗氧化性研究,
可以为悬钩子属植物开发利用提供理论依据。
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Study on Antimicrobial and Antioxidant Activity of the Extract of Rubus Spp.
LIU Sheng-gui,LI Lu,ZUO Qing-qing,LIU Guang-hua
(The Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province,Department of Life Sciences,Huaihua
University,Huaihua,Hunan 418008)
Abstract:Taking 8species of Rubus spp.as materials,disk difusion method and tube doubling dilution method were
applied to test the antimicrobial activity against Staphylococcus aureus 91053,Salmonela pulorum,Enterococcus
faecalis,Escherichia coli O1and Pseudomonas aeruginosa.The antioxidant activity was investigated by measuring the
scavenging activity of hydroxyl radicals(·OH)produced by Fenton reaction and superoxide radicals(O·2 )generated
from the autoxidation of pyrogalol determined by colorimetry,to evaluat antimicrobial,antioxidant activities of Rubus
spp..The results showed that the water extracts of Rubus spp.showed the highest antimicrobial activity against
Staphylococcus aureus 91053and Escherichia coli O1,among which R.corchorifolius,R.coreanus and R.parvifolius
presented the lowest MBC(37.5mg/mL);R.spp.in the test showed certain scavenging efect on hydroxyl radicals
(·OH)and superoxide radicals(O·2 ),and the ability of R.alceaefolius,R.parvifolius and R.corchorifolius was
highest.The results showed that R.corchorifolius,R.parvifolius,and R.coreanus could be studied as new antimicrobial
drugs,and R.alceaefolius,R.parvifolius and R.corchorifolius could be used as new antioxidant drugs.
Key words:Rubus;plant extract;antimicrobial activity;antioxidant activity
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