全 文 ：中国农业科学　 2000, 33( 5): 1～ 7　
Scientia Ag ricultur a Sinica　　　　
RAPD标记在棉属种间杂种
后代检测中的应用
聂以春 ,左开井 ,张献龙 ,冯纯大 ,刘金兰
(华中农业大学作物遗传改良国家重点开放实验室 ,武汉　 430070)
摘要: 以 [4x (亚洲棉×异常棉 ) ]×陆地棉的杂交后代培育的 5个种质系和 3个亲本为材料 ,
用 22个随机引物进行了 RAPD分析。结果表明: 3个棉种具有明显的多态性差异。5个种质系均
检测到来自不同棉种的 DNA特异片断 ; 3个棉种间的遗传相似系数在 50% 以下。陆地棉亲本与
种质系间和种质系与种质系间的相似系数在 0. 710～ 0. 933之间 ,平均为 0. 808。这些差异与回交
亲本、单株选择的定向培育有关。研究结果对棉属远缘杂交育种具有一定的参考价值。
关键词: 棉属 ;种间杂交 ;种质系 ; RAPD;遗传相似性
中图分类号: S562. 032　文献标识码: A　文章编号: 0578-1572( 2000) 05-0025-05
棉属野生种异常棉 ( Gossypium anomalum Wanra et Pey r )抗棉红铃虫、角斑病 ,并具
有纤维细、强力大的遗传潜力〔1〕 ,因而受到育种家的重视。80年代初 ,我们利用亚洲棉 ( G.
arboreum L)和异常棉杂交 ,对 F1枝条进行体细胞染色体加倍 ,获得异源四倍体枝条 ,开花后
再用陆地棉 ( G. hirsutum L)杂交、回交、选择和鉴定 ,培育出 5个种质系材料。这些种质材料
与野生种和栽培种相比 ,遗传成分有何变化并不清楚。70年代初 , Johnson和 Cherry等开始
用普通电泳分析棉属种的蛋白质和同工酶的谱带 ,研究了不同棉种间的关系〔 5, 6〕 ,后来又被
用来分析不同棉种和种间杂种的差异〔2, 3〕 ,但未涉及到种间杂种后代选育出的种质材料。
为了深入研究栽培种与野生种杂交后代培育的种质材料的遗传成分变化 ,本研究利用
近几年来发展的 RAPD技术对从上述 3种杂种后代中培育的种质系进行分子标记分析 ,检
测来自野生种和栽培种血缘的变化 ,试图从分子水平上揭示种间杂种后代的遗传变异 ,为棉
属远缘杂交育种提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料来源为〔4x (亚洲棉×异常棉 )〕×陆地棉的 3种杂种一代再用陆地棉回交、自
交的后代中选育的 5个种质及其 3个不同棉种亲本 (表 1)。
收稿日期: 1999-11-12
基金项目:湖北省自然科学基金 ( 97 J053)和“九五”国家棉花科技攻关资助项目 ( 96-002-02)
作者简介:聂以春 ( 1953-) ,男 ,湖北当阳人 ,副教授 ,主要从事棉花远缘杂交育种工作。
1. 2　方法
1. 2. 1　 DNA提取　参照 Peterson等〔 10〕方法 ,并部分修改。步骤如下:从植株上取 4d左右
的嫩叶加液氮研磨成粉状。按 10μl /g样品加入 β -巯基乙醇 ,再按 4m l /g加入预热的 DNA
表 1　供试材料的选择世代及主要特性
Table 1　 Selecting genera tion and main cha racteristics of ma terials
材料
Material
主要特性
Main characters
亚洲棉 ( P1)
G. arboreum
早熟、纤维强力大 ,抗病虫能力强等
Sh ort s eason, High fib er st rength , Resi s tant to diseas e and w orm etc.
异常棉 ( P2)
G. anoma lum
抗多种虫害、抗角斑病、具潜在优良纤维品质等
Resis tan t to inseet pes ts and diseas e, Potent ially good quali ty etc.
陆地棉 ( P3)
G. hirsutum
产量高
High yield
N-16( BC2 F4) 2. 5%跨长: 31. 5mm;麦克隆值 4. 0
2. 5% span length: 31. 5mm; Micronai re 4. 0
9543( BC3 F4) 2. 5%跨长: 31. 0mm;麦克隆值 4. 1;高抗红铃虫
2. 5span length: 31. 0mm; Micronai re 4. 1. Highly resis tant to bollwo rm
9540( BC3 F4) 2. 5%跨长: 31. 2mm;麦克隆值 4. 0;抗红铃虫
2. 5% span length: 31. 2mm; Micronai re 4. 0. Resis tan t to pink bol lw orm
9539 ( BC3 F4 ) 2. 5%跨长: 29. 1mm;麦克隆值 4. 4;抗红铃虫
2. 5% span length: 29. 1mm; Micronai re 4. 4. Resis tan t to pink bol lw orm
9487( BC4 F3) 2. 5%跨长: 30. 9mm;比强度 27;抗红铃虫
2. 5% span length: 30. 9mm; Fiber s t rengh t 27g / tex. Resis tant to pink bollw orm
裂解缓冲液迅速搅拌 ,再加入等体积的氯仿 -异戊醇抽提 ,异丙醇沉淀 DNA,并取出风干后
溶于 2ml的 T E缓冲液中 ,加入 RNAase( 10mg /ml)至终浓度 50μg /ml ,然后用等体积的苯酚
-氯仿-异戌醇抽提 1～ 2次 ,加入 0. 1V的 NaAc和 2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀 DNA, 76%
乙醇洗盐、风干 ,溶于适量体积的 TE缓冲液中。
1. 2. 2　引物及来源　使用的 22个随机引物长度为 10个核苷酸序列 ,分别是 S4、 S26、 S35、
S37、 S55、 S70、 S74、 S100、 S174、 S198、 S314～ 316、 S497、 S462～ 469等 ,购于上海生工生物技
术公司。
1. 2. 3　 RAPD分析　 PCR反应物: 40ngDN A, 0. 16mmol dN TPs, 0. 6mmol引物 ,
1. 8mmolM gCl2 , 1×反应 buf fer, 1. 5单位 Taq DN A聚合酶 ,加 ddH2O至 25μl反应体积。
PCR反应条件: 94℃ 3min, 44℃ 1min, 72℃ 2min, 2个循环 ; 94℃ 1min, 37℃ 1min, 72℃ 1min
45s共 40个循环 ; 94℃ 1min, 37℃ 1min, 72℃ 10min, 1个循环 ; 4℃保存。扩增产物在 1. 2%琼
脂糖凝胶电泳 4～ 5h,溴化乙锭染色 ,紫外照相 ,记录结果。
1. 2. 4　数据分析　根据电泳图谱 ,把有带的量化为 1,无带的量化为 0,数据输入计算机标准
化处理。材料间的相似系数用 N TSYS软件进行计算。
2　结果与分析
2. 1　参试材料的多态性分析
用 22个引物对 8个材料进行 PCR扩增 ,均有扩增产物。总共扩增出 169条带 ,其中具多
态性带 106条 ,占 62. 7% 。引物不同扩增的片断数也不同 , S37引物扩增的带最多 ,为 13条 ,
S174引物最少为 3条 ,平均每个引物扩增出 7. 7条。
2. 1. 1　 3个亲本间的多态性差异比较　 22个引物对亚洲棉、异常棉和陆地棉分别扩增出
26 中　国　农　业　科　学 33卷
124、 102和 119条带。3个棉种均有本身的特异带型 ,依次分别是 21、 12和 22条。在 22个引物中 ,
S100、 S70、 S37、 S174等 14个能够将 3个棉种分开 ,占选用引物的 63. 6%。充分体现出 3个棉种
间的遗传差异 (图 )。
1.亚洲棉 ; 2.异常棉 ; 3.陆地棉 ; 4. N-16;
5. 9540; 6. 9539; 7. 9543; 8. 9487; M.λDN A/ HindⅢ
1. G.arboreum ; 2. G.anomalum ; 3. G.h irsutum ; 4. N-16;
5. 9540; 6. 9539; 7. 9543; 8. 9487; M.λDN A/ HindⅢ
图　S 70引物检测到材料的多态性
Fig.　 RAPD po lymo rphism amplified w ith primer S70
2. 1. 2　种质系与亲本之间的多态性差
异比较　 5个种质系以亲本为对照 ,进行
PCR扩增后的多态性比较 (表 2)。S70能
检测出 N-16种质系中三亲的特异片断 ;
S37、 S174、 S198、 S463等能分别将 5个种
质系中来自亚洲棉或异常棉的特异带检
测出来。对 22个引物扩增出的带进行统
计 , 5个种质系中具亚洲棉特异带的为 3
～ 9条 ,占总带数的 2. 5%～ 7. 2% ,其中
N-16和 9540占的比重较大 ,分别是 7. 2%
和 6. 1%。来自异常棉的带占 2. 3% ～
4. 8% , 具陆地棉特异带的达 11. 9% ～
13. 0% 。种质材料中还检测到双亲 (亚洲
棉与异常棉、亚洲棉与陆地棉、异常棉与
陆地棉 )的共有带 (图 ) ,表明种间杂种后
代中存在着丰富的遗传变异。
表 2　 22个引物对 5个种质材料扩增的带型差异比较 1)
Table 2　 Th e compa rison of RAPD results in five g ermplasm lines
材料
Material
总带数
To tal bands
亲本带比例　 Percentag e of paren t band
P1 % P2 % P3 % P1+ P2 % P1+ P3 % P2+ P3 %
N-16 125 9 7. 2 6 4. 8 15 12. 0 2 1. 6 18 14. 4 9 7. 2
9540 131 8 6. 1 3 2. 3 17 13. 0 3 2. 3 18 13. 7 10 7. 6
9539 126 5 4. 0 4 3. 2 15 11. 9 2 1. 6 17 13. 5 9 7. 1
9543 123 5 4. 1 4 3. 3 15 12. 2 1 0. 8 17 13. 8 10 8. 1
9487 122 3 2. 5 4 3. 3 15 12. 3 2 1. 6 15 13. 3 9 7. 4
　 1) P1+ P2 , P1+ P3, P2+ P3分别表示双亲共有带　 P1: G.a rboreum P2: G.anomalum P3: G.h irsutum;
P1+ P2 , P1+ P3 , P2+ P3: Common band s appeared in th e two paren ts
从不同棉种的特异片断在种质材料中的存在差异看出 ,由于用陆地棉作回交亲本 ,因而
后代中具陆地棉亲本的带多。陆地棉是一个复合染色体组 ,由 A和 D构成 ,所以 ,在后代中
陆地棉与亚洲棉 ( A组 )的共有带多于陆地棉与异常棉的共有带。以上实验结果表明 ,利用
RAPD技术可以检测远缘杂种后代材料中亲本的遗传成分表现。
2. 2　 8个参试材料之间的遗传相似系数比较
对 8个参试材料之间的遗传相似系数分析结果见表 3。
亚洲棉与其它 7个材料间的相似系数在 0. 202～ 0. 500之间 ,其中与异常棉的相似系数最
低 ,仅 0. 202。异常棉与其它材料间的相似系数在 0. 367～ 0. 519之间 ,而陆地棉与种质系
275期 聂以春等: RAPD标记在棉属种间杂种后代检测中的应用　　　　　
表 3　 8个材料之间的遗传相似系数
Table 3　 Pairwise genetic simila rity of eight ma teria ls
P1 P2 P3 N-16 9540 9539 9543 9487
P1 1. 000
P2 0. 202 1. 000
P3 0. 402 0. 367 1. 000
N-16 0. 467 0. 393 0. 754 1. 000
9540 0. 500 0. 433 0. 800 0. 833 1. 000
9539 0. 448 0. 519 0. 780 0. 788 0. 857 1. 000
9543 0. 333 0. 480 0. 764 0. 710 0. 788 0. 933 1. 000
9487 0. 346 0. 500 0. 755 0. 800 0. 813 0. 897 0. 852 1. 000
间为 0. 754～ 0. 800, 不同种质系间为 0. 710～ 0. 933。它们之间的成对相似系数差异表明 ,亚
洲棉、异常棉和陆地棉是在长期自然条件下的进化过程中形成的 3个独立种 ,三者间的植物
形态学特性差异很大 ,因而相似系数也低 ,说明它们之间的亲缘关系较远。由于 5个种质系均
来源同一杂交组合 ,回交亲本相同 ,差别来源于对分离世代单株的选择和鉴定上。所以 ,陆地
棉亲本与种质系间、不同种质系之间的遗传变异较小。
3　讨论
RAPD分子标记可以用来检测远缘杂交后代中不同棉种血缘的遗传变化。在我们的研
究结果中看出 ,来自于棉花远缘杂种后代的 5个种质系均检测到不同棉种的特异片断 ,而且
种质系间的差异也比较明显。种质系间不同棉种遗传物质的变化多少取决于回交亲本、回交
次数 ,而且与分离群体中的单株选择和定向培育有关。在有关研究中 , Bommineni ( 1997)等
对硬粒小麦与薄冰草属 Th. juncei f orme种的属间杂种一代与硬粒小麦回交的 BC1和 BC2世
代利用 RAPD标记检测到来自 Th. juncei f orme种的 DNA分子特异片断 ,并转换成 RFLP
标记进一步得到证实〔7〕。因而 , RAPD标记检测远缘杂种后代中来自不同种的血缘是可行
的。
利用 RAPD标记分析遗传相似系数可以研究种间亲缘关系〔 9〕 ,评价品种间的遗传基
础〔 4〕。通过对不同棉种及种质系间的相似系数研究 ,亚洲棉、异常棉与陆地棉和种质系间的
成对相似系数在 0. 202～ 0. 500之间 ,形态特性的遗传差异大。陆地棉亲本和种质系间的相似
系数较大 ,在 0. 754～ 0. 800的范围 ,形态特性的差异很小 ,相互间难以鉴别。在有关研究中 ,
Iqbal等 ( 1997)用 RAPD标记分析 23个棉花品种的遗传相似系数 ,其中一个中棉品种与 22
个陆地棉品种的相似系数平均为 55. 7% ,在 22个陆地棉品种间 (除 1个比较特殊外 )系数在
65. 4% ～ 93. 4% ,绝大多数间的系数又在 80. 0% ～ 90. 0%之间 ,相似系数的大小与品种的来
源和系谱有很大关系〔 8〕 ,这些结果与我们的研究结果类似。应用这一技术研究种间关系和品
种间的遗传相似性是稳定可靠的 ,其结果对育种家合理选择杂交亲本具有一定的参考价值。
试验中选用的 5个种质系都具有某些优异性状 (见表 1) ,但这些优良性状是否真正来自
异常棉或者亚洲棉并不清楚。虽已检测到来自不同棉种的 DNA特异片断 ,并不能说明这些
片断与某一优良性状的连锁关系。可以把已检测到的不同棉种的特异片断转换成 RFLP,对
种质系与陆地棉其它品种杂交的分离世代中的优良性状进行标记 ,检测优良性状与分子标记
的连锁关系 ,可应用于辅助选择育种 ,且有利于更准确、有效地评价和鉴定远缘杂种后代。
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参考文献:
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Applicat ion of RAPD Markers in Differentiating
Germplasm Lines from
4x (Gossypium arboreum×G.anomalum )×G.hirsutum
Nie Yichun, Zuo Kai jing , Zhang Xianlong , Feng Chunda, Liu Jinlan
(N ational Key Laboratory for Genetic Improvement of Crops, Huazhong
Agricultural University ,Wuhan　430070 )
　　Abstract: RAPD ( random amplified polymo rphic DN A) ma rkers generated by 22
random decamer primers w ere used to evalua te po lymo rphism and genetic simi lari ty of five
g ermpla sm lines deriv ed from〔4x ( G.arboreum× G.anomalum )〕× G. hirsutum and their
parents. The result show ed that there w as abundant DN A polymo rphism in th ree parents.
Special DN A fragment of parents appea red in fiv e germplasm lines. The similarity
coefficients betw een dif ferentGossypium species w ere low er than 50% , which w ere rela ted
to their center o rigin and genome di fference. The similarity of g ermplasm lines wi th
upland co t ton and germplasm line ranged from 0. 710～ 0. 933. The high simila ri ty is ow ing
to backcro ssing by G. hirsutum generation to g eneration. Meanwhi le, individua l plant
selection wi th di fferent breeding aims made the fiv e-germplasm lines show dif ference to
some ex tent.
Key words: Gossypium ; Interspecific hybridization; Germplasm line; RAPD; Genetic
simi lari ty
295期 聂以春等: RAPD标记在棉属种间杂种后代检测中的应用