全 文 ：ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－２００６．２０１５．０２．０２８
盐肤木种子蛋白质提取工艺的初步优化
何晓梅１，２，陈存武１，２，陈乃富１，２，韩邦兴１，２，谷仿丽１，２
１．皖西学院生物与制药工程学院；２．植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽六安，２３７０１２
摘要：通过凯氏定氮法测定盐肤木种子总蛋白质含量，然后采用３种不同的方法提取其中的蛋白质。结果表明：盐
肤木种子总蛋白质的含量约为９．５０１％。在本实验条件下，改良丙酮沉降法提取的蛋白质含量较ＴＣＡ－丙酮提取
法和碱式提取法高。正交试验确定改良丙酮沉降法较优工艺条件为：“料液比为１∶１２ｇ·ｍＬ－１，提取时间为３ｈ，
提取液与沉降蛋白所用丙酮量体积比１∶２，沉降时间为１．５ｈ。在较优提取工艺条件下，盐肤木蛋白质的提取率达
到５８．４４％。
关键词：盐肤木；蛋白质；凯氏定氮法；提取；正交试验
中图分类号：ＴＳ２２９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－２００６（２０１５）０２－０１０９－０４
收稿日期：２０１４－１１－２５
基金项目：国家公益性林业科研专项项目“盐肤木新品种选育与示范”（２０１２０４３１２）；国家自然科学基金“基于近红外与电子鼻
技术的药用菊花道地药材模式识别研究”（３０９０１９７２）；安徽高校省级自然科学研究重点项目“新木本油料植物盐肤木油脂资源
开发应用研究”（ＫＪ２０１１Ａ２７３）“生姜病毒检测试剂盒的研制与生姜脱毒快繁”（ＫＪ２０１３Ａ２６４）；安徽省自然科学一般项目“复合
酶法制备纯天然速溶绿茶的研究”（ＫＪ２０１３Ｂ３４１）。
作者简介：何晓梅（１９７４－），女，安徽霍山人，硕士，讲师，主要研究方向：天然产物研究与开发。
盐肤木（Ｒｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）又名为“五倍子树”，是
漆树科盐肤木属的落叶灌木或小乔木；角倍蚜
（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）是瘿绵蚜科昆虫的１
种。五倍子是由角倍蚜在其唯一夏寄主植物盐肤木
叶总轴的翅叶上形成的虫瘿（角倍），含有丰富的单
宁，是医药、化工、食品、轻工和环保等行业的重要原
料。因此，目前人们对盐肤木的研究主要集中于盐
肤木的播种育苗及栽培技术［１－４］、角倍蚜虫瘿对盐肤
木生理生化特性的影响及其关系上［５－７］等，以期提高
五倍子的产量。此外，国内学者还对盐肤木的分子
生物学特性、逆境生长特性、病虫害防治等进行了相
关研究。
近年来，盐肤木及五倍子有效成分的提取及其
生物活学研究有了很大进展，提取的成分有五倍子
多酚、五倍子酸、盐肤木黄酮等；提取部位有五倍子、
根、茎、叶和种子等；生物学效应有抗氧化、抗肿瘤、
抗病虫害、抑菌等［８－１１］。陈存武等研究表明，盐肤木
种子含有丰富的油脂、蛋白质、脂肪、还原糖、矿质元
素等，其中蛋白质含量为９．６１～１１．６４ｇ／１００ｇ［１２］。
陈宏伟等采用酸水解法，对我国亚热带常见的１１９
种森林植物种子的蛋氨酸含量进行测定，结果表明
盐肤木的蛋氨酸含量达到３６．８９ｍｇ／ｇ，为１１９种
植物中含量最高者［１３］。本研究采用改良丙酮沉降
法、ＴＣＡ－丙酮提取法和碱式提取法三种不同的方
法提取盐肤木种子中的蛋白质，并对提取率较高的
改良丙酮沉降法进行正交试验优化，确定盐肤木蛋
白质提取的优化参数，以期为盐肤木种子蛋白质的
进一步研究提供基础性数据。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
盐肤木种子采摘于霍山县白马尖，经分拣、晾晒
后粉碎，５０℃烘干至恒重备用。
１．２ 主要仪器与试剂
主要仪器：凯氏定氮装置（天长市长城玻璃仪器
制造厂），ＧＬ－２１Ｍ 高速冷冻离心机（湖南凯达科
学仪器有限公司），ＤＫ－８Ｄ三孔三温水浴锅（金坛
市杰瑞尔电器有限公司），ＨＬ－５００Ａ型高速多功能
粉碎机（上海塞耐机械有限公司），ＵＶ－２１０２ＰＣＳ
型紫外可见分光光度计（尤尼科上海仪器有限公
司），智能型电热恒温鼓风干燥箱（上海琅王干实验设
备有限公司）。
主要试剂：氢氧化钠、盐酸、丙酮、ＴＣＡ（三氯乙
酸）等，均为分析纯。
１．３ 试验方法
１．３．１ 盐肤木种子蛋白质含量的测定：凯氏定氮法
准确称取经（４０±２）℃干燥至恒重的样品，平均
分成３组，参考文献［１４］进行蛋白质总量的测定。
计算公式如下：
Ｘ＝
（Ｖ１－Ｖ２）×Ｎ×０．０１４
ｍ×（１０／１００）×Ｆ×１００％
９０１
式中，Ｘ为样品中蛋白质的百分含量，ｇ；Ｖ１ 为样品
盐酸标准液的体积，ｍＬ；Ｖ２ 为试剂空白消耗盐酸标
准溶液的体积，ｍＬ；Ｎ 为盐酸标准溶液的当量浓
度；０．０１４为１Ｎ盐酸标准溶液１ｍＬ相当于氮克
数；ｍ 为样品的质量（体积），ｇ（ｍＬ）；Ｆ为氮换算为
蛋白质的系数。
１．３．２ 盐肤木蛋白质的不同提取方法
１．３．２．１ 改良丙酮沉降法
按照谷瑞升等［１５］的方法，准确称取１．２１７ １ｇ
盐肤木样品粉末，加入１２ｍＬ蛋白质提取液（表１），
在研钵中充分研磨混匀后转入５０ｍＬ离心管中，室
温超声５ｍｉｎ后于４℃条件下提取１ｈ使蛋白质充
分溶解，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取清液，加入３
倍体积－２０℃预冷的丙酮并于－２０℃下放置１ｈ使
蛋白沉淀，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，弃上清，丙酮
完全挥发后按１∶５（ｗ／ｖ）加入蛋白溶解液（表１）溶
解沉淀，转移至离心管中，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０
ｍｉｎ，取上清液，即为所提取的蛋白溶液（上述操作
都在４℃进行）。
１．３．２．２ ＴＣＡ－丙酮提取法
按照董双涛等［１６］的方法略作修改，准确称取
１．２０３ ０ｇ盐肤木样品粉末，按１∶３（ｗ／ｖ）加入－
２０℃预冷的三氯乙酸和丙酮液（含１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ
和０．０７％（ｖ／ｖ）β－巯基乙醇）研磨充分后转入离心
管中，－２０℃沉降５０ｍｉｎ，４℃１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０
ｍｉｎ，取沉淀置－２０℃预冷的８０％丙酮中（含０．０７％
β－巯基乙醇），－２０℃沉降１ｈ，４℃１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离
心２０ｍｉｎ，重复洗涤沉淀至无色，沉淀真空干燥，按
１∶５（ｗ／ｖ）加入蛋白溶解液（表１），４℃放置３ｈ，
１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，获得上清液，即为所提取
的蛋白质溶液。
表１ 提取试剂配方
蛋白质提取液／ｐＨ６．８ 体积／ｍＬ 蛋白溶解液 体积／ｍＬ
０．５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １２．５ｍＬ ０．５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ １２．５ｍＬ
１％ＳＤＳ ５ｍＬ １００％甘油 １０ｍＬ
１００％甘油 １０ｍＬ １００％β－巯基乙醇 ５ｍＬ
１００％β－巯基乙醇 ５ｍＬ ／ ／
注：提取液与上样缓冲溶液按表１配制好后，均加蒸馏水定容至１００ｍＬ。
１．３．２．３ 碱式提取法
按照陶然等［１７］的方法略作修改：准确称取
１．２５６ ０ｇ的样品，按１∶１０加入水，搅匀后加入３％
的氢氧化钠溶液，调节ｐＨ至１０，于５０℃左右的水浴
锅中，不断缓慢地搅拌，使蛋白质在碱性条件下溶解，
离心保留提取液，调节ｐＨ至４．５，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心
分离，取沉淀，按１∶５加入蛋白溶解液，充分溶解蛋
白后１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心分离，得蛋白质溶液。
１．３．３ 正交试验优化改良丙酮沉降法
比较３种不同蛋白质提取方法的结果，确定进
一步优化改良丙酮提取法。以物料与提取液配比、
溶解时间、物料与沉降液配比、沉降时间为考察因
素，以蛋白质提取率为考察指标，进行Ｌ９（３４）实验
（表２）。
表２ 正交试验因素水平表
实验水平
料液配比
／ｇ·ｍＬ－１
溶解时间
／ｈ
沉降比
／ｖ·ｖ－１
沉降时间
／ｈ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
１ １∶１０ １ １∶２ １
２ １∶１２ ２ １∶３ １．５
３ １∶１４ ３ １∶４ ２
１．３．４ 蛋白质提取率计算
采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定提取液中蛋白质含量［１８］。
样品中蛋白质的含量（ｕｇ／ｇ）＝Ｃ×ＶＴ／（Ｖ１×ｍ），式
中，Ｃ 为查标准曲线值（μｇ）；ＶＴ 为样液总体积
（ｍＬ）；ｍ 为样品质量（ｇ）；Ｖ１ 为测定时加样量
（ｍＬ）。
２ 实验结果与分析
２．１ 盐肤木种子中蛋白质总量的测定
准确称取３份样品进行平行试验及空白试验，
由表３可以看出盐肤木中蛋白质的总含量约为
９．５０１％，即１００ｇ盐肤木中约含９．５０１ｇ蛋白质。
表３ 盐肤木种子中蛋白质总量
序号
样品质量
／ｇ
消耗盐酸
／ｍｏｌ
蛋白质含量
／％
蛋白质平均
含量／％
① ０．２４３ １ ３．８ ９．７１６ ９．５０１
② ０．２３４ ３ ３．６ ９．３３５
③ ０．２３８ ２ ３．７ ９．５５２
／ ／ １．１ ／ ／
２．２ 蛋白质标准曲线的绘制
取６支１０ｍＬ干净的具塞试管，按表４进行取
样后盖上塞子，将各试管中溶液纵向倒转混合均匀，
放置２ｍｉｎ后用１ｃｍ光径的比色皿在５９５ｎｍ波长
下进行比色，并记录各试管测定的光密度 ＯＤ５９５
ｎｍ，然后绘制出标准曲线（图１），曲线回归方程为ｙ
０１１
＝０．０００ ８ｘ＋０．００８ ３，Ｒ２＝０．９９９ ３。
２．３ 不同提取方法获得的蛋白质提取率
采用３种不同的提取方法提取样品中的蛋白
质，并通过紫外分光光度法在５９５ｎｍ下测定样品
提取液的吸光度，计算得知改良丙酮沉降法获得的
蛋白质提取率为４３．５６％，ＴＣＡ－丙酮提取法提取
率为３４．２９％，碱式提取法蛋白质提取率为２３．４７％
（表５）。
图１ 牛血清蛋白标准曲线
表４ 考马斯亮蓝法绘制蛋白质标准曲线
管号 １ ２ ３ ４ ５ ６
１ ０００μｇ·ｍＬ－１标准蛋白液／ｍＬ ０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １．０
蒸馏水／ｍＬ １．０ ０．８ ０．６ ０．４ ０．２ ０
考马斯亮蓝Ｇ－２５０溶液／ｍＬ ５ ５ ５ ５ ５ ５
蛋白质含量μｇ·ｍＬ－１ ０ ２００ ４００ ６００ ８００ １ ０００
ＯＤ５９５ｎｍ ０ ０．１７２ ０．３２７ ０．４７３ ０．６４３ ０．７８５
表５ 不同提取方法获得的蛋白质提取率
实验方法 改良丙酮沉降法 ＴＣＡ－丙酮提取法 碱式提取法
样品质量／ｇ １．２１７ １ １．２０３ ０ １．２５６ ３
样液总体积／ｍＬ ６．０ ６．０ ６．０
测定时加样量／ｍＬ ０．１ ０．１ ０．１
蒸馏水／ｍＬ ０．９ ０．９ ０．９
考马斯亮蓝Ｇ－２５０试剂／ｍＬ ５ ５ ５
ＯＤ５９５ｎｍ ０．６８５ ０．５３６ ０．３８７
样品中蛋白质含量／ｍｇ·ｇ－１ ４１．３８ ３２．５７ ２２．３０
蛋白质提取率／％ ４３．５６ ３４．２９ ２３．４７
２．４ 正交试验结果
由表６分析结果可知，通过正交实验优化改良
丙酮沉降法，影响蛋白质提取效果因素的主次顺序
为Ｂ＞Ｃ＞Ａ＞Ｄ，即溶解时间影响最大，依次是物料
表６ 正交实验结果及极差分析
实验号
Ａ料液配比
／ｇ·ｍＬ－１
Ｂ溶解时
间／ｈ
Ｃ沉降比
／ｖ·ｖ－１
Ｄ沉降时
间／ｈ
蛋白质提
取率／％
１ １ １ １ １ ３６．０８
２ １ ２ ２ ２ ３９．３９
３ １ ３ ３ ３ ３８．１４
４ ２ １ ２ ３ ３７．９１
５ ２ ２ ３ １ ４２．９１
６ ２ ３ １ ２ ５８．４７
７ ３ １ ３ ２ ３５．３１
８ ３ ２ １ ３ ５２．７７
９ ３ ３ ２ １ ４９．９０
Ｋ１ １１３．６１ １０９．３ １４７．３２ １２８．８９
Ｋ２ １３９．２９ １３５．０７ １２７．２ １３３．１７
Ｋ３ １３７．９８ １４６．５１ １１６．３６ １２８．８２
ｋ１ ３７．８７ ３６．４３ ４９．１１ ４２．９６
ｋ２ ４６．４３ ４５．０２ ４２．４ ４４．３９
ｋ３ ４５．９９ ４８．８３ ３８．７９ ４２．９４
Ｒ／极差 ８．５６ １２．４ １０．３２ １．４５
与沉降液丙酮配比、物料与提取液配比，预冷丙酮沉
降时间影响较小，且最优水平为 Ａ２Ｂ３Ｃ１Ｄ２，即最佳
提取工艺条件为：料液比为１∶１２，提取溶解时间为
３ｈ，提取液与沉降蛋白所用丙酮量体积比１∶２，沉
降时间为１．５ｈ。
２．５ 蛋白质提取的验证试验
根据２．４获得的最佳提取条件，分别称取３份
为１．００３ ２ｇ、１．００４ ８ｇ和１．００１ ７ｇ的盐肤木样品
进行实验，得出蛋白质提取率分别为５７．３３％、
５９．７２％和５８．２７％，平均值为５８．４４％，与上述正交
试验结果基本一致。
３ 结 论
（１）凯氏定氮法对本次样品中蛋白质总含量的
测定值为９．５０１ｇ／１００ｇ盐肤木。
（２）分别通过改良丙酮沉降法、ＴＣＡ－丙酮提
取法、碱式提取法３种不同的提取方法提取盐肤木
种子蛋白质并计算提取率，结果表明：在本实验条件
下，新式改良丙酮提取法提取的蛋白质含量较其他
２种方法高。
１１１
（３）运用正交优化改良丙酮沉降法的最优提取
条件为：料液比为１∶１２，提取溶解时间为３ｈ，提取
液与沉降蛋白所用丙酮量体积比１∶２，沉降时间为
１．５ｈ。在此实验条件下，蛋白质提取率为５８．
４４％。
（４）根据１．３．２．２和１．３．２．３的实验条件，
ＴＣＡ－丙酮提取法和碱式提取法提取的蛋白质含
量较低，在后续实验中需要进行实验条件的优化。
（５）盐肤木种子蛋白质的提取在国内尚属首次，
本实验数据可为盐肤木种子蛋白质的进一步研究提
供参考。
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Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｒｈｕｓ Ｃｈｎｅｎｓｉｓ Ｓｅｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ
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１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｅｓｔ Ａｎｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｕａｎ Ａｎｈｕｉ，２３７０１２
２．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌｕａｎ Ａｎｈｕｉ，２３７０１２
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ｔｉｃｉｎｇ ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｒｈｕｓ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅａｃｈｅｄ ５８．４４％．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｄａｔａ ｗａｓ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｈｕｓ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｓｅｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｒｈｕｓ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ；ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ （责任编辑：汪材印）
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