全 文 ：果 树 学 报 2008,25(2):262～268
JournalofFruitScience
龙眼属rDNA的ITS序列分析
姜 帆 1,3,高慧颖 1,2,陈秀萍 1,3,郑少泉 1,3*
(1福建省果树龙眼枇杷育种工程技术研究中心,福州 350013;2河北工程大学农学院,
河北邯郸 056021;3福建省农业科学院果树研究所,福州 350013)
摘 要:为了讨论龙眼属(DimocarpusLour.)的遗传多样性及鉴别技术,运用克隆测序法测定了主产区龙眼(Dimo-
carpuslonganLour)品种及其近缘种龙荔[Dimocarpusconfinis(HowetHo)H.S.Lo.]的核糖体 DNA中的内转录间隔区
(ITS)序列(包括ITS1,5.8S和ITS2)。结果表明,龙眼及其近缘种龙荔的ITS区序列的长度范围为618～646bp,长度变
异为28bp;其中,ITS1和ITS2的长度范围分别为227～235bp和227～247bp。龙眼品种间ITS序列变异位点比较丰
富,通过单个或组合变异位点可以作为特异位点用于品种之间的鉴别。龙荔的 ITS序列变异较大,在609处插入一个
19个碱基的片段;系统发育树也表明龙荔自为一单树系,为其是龙眼近缘种提供了新的分子证据。结果还表明龙眼
果实香味、流汁程度和质地与基于 ITS序列的系统发育树结果表现较多品种的吻合性。
关键词:龙眼;ITS;分子鉴别
中图分类号:S665.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)02-262-07
AnalysisofITSsequencesofrDNAinDimocarpusplants
JIANGFan1,3,GAOHui-ying1,2,CHENXiu-ping1,3,ZHENGShao-quan1,3*
(1FujianFruitBreedingEngineeringTechnologyResearchCenterforLongan&Loquat,Fuzhou,Fujian350013China;2AgricultureCol-
lege,HebeiEngineeringUniversity,Handan,Hebei057150China;3FruitResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalScience,
Fuzhou,Fujian350013China)
Abstract:InordertoanalyzethegeneticdiversityandmolecularidentificationtechnologyoftheplantsbelongingtoDimo-
carpusLour,thesequencesofITS(includingITS1,5.8SandITS2)ofribosomalDNAweredeterminedwiththemainlongan
(DimocarpusLonganLour)cultivarsandtherelativespeciesLongli(Dimocarpusconfinis(HowetHo)H.S.Lo.).Theresult
showedthat,thesizeoftheITSofDimocarpusLour.wasfrom618to646bp(ITS1from227to235bpandITS2from227to
247bp)withavariationof28bp.ThevariationlociinITSsequenceswereabundantinlongan,andmostofthecultivarstest-
edcouldbeidentifiedbysingleorcombinedvariationloci.ButdistinguishingthecultivarsLidongbenfromChuliangand
ChompoofromShiyuelongyanneedsothermolecularmarkers.LonglihadagreatdiferenceinITSsequenceswitha19bpin-
sertioninIST2.andcouldbeidentifiedasarelativespecies.Inaddition,traitssuchasfruitflavorandtextureagreedwiththe
classificationoflonganbasedonphylogeneticdendrogramofITS.
Keywords:Longan;Internaltranscribedspacer;Molecularidentification
植物系统分类学主要是通过对一定 DNA序列
进行同源性比较来探讨植物的系统演化和分类。目
前常用于分类研究的植物基因片段有:叶绿体基因
组的matK基因、rbcL基因、ndhA,D基因,核基因组
有18SrDNA、和ITS(Internaltranscribedspacer,核糖
体内转录间隔区)。其中ITS位于植物18S和26S之
间被5.8S分隔成ITS1和ITS22个区域,由于进化
速度较快、稳定性好和测序方便等特点,近年来 ITS
已成为研究植物系统发育及分子进化的有效工具
和重要标记,被广泛应用于近缘属间及种间分类研
究[1-7]。龙眼DNA序列分析研究仅见林同香等[8]对东
壁品种的 rbcL基因进行分析,而龙眼属内、种间 ITS
序列研究还未见报道。
龙眼属 (DimocarpusLour.)是无患子科(Sapin-
daceae)植物,主要分布在热带和亚热带地区,在中
国有4个种。它们是龙眼(D.longanLour)、龙荔(D.
confinis(HowetHo)H.S.Lo.)、灰岩肖韶子(D.fuma-
tus(Bl.)Leenh.Subsp.calcicolaC.Y.Wu)、滇龙眼(D.
收稿日期:2007-06-20 接受日期:2008-01-08
基金项目:国家科技基础条件平台项目(2005DKA21002-27);福建省财政专项资助(STIF-Y06)
作者简介:姜帆,男,硕士。Tel:0591-87579548,E-mail:jiangfan006@126.com
?通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:013950306856,E-mail:zsq333555@163.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.02.024
序号
No.
圃编号
Fieldnumber
基因型
Genotype
种名
Species
原产地
Origin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
GPLY0077
GPLY0171
GPLY0161
GPLY0018
GPLY0216
GPLY0218
GPLY0129
GPLY0127
GPLY0145
GPLY0202
GPLY0133
GPLY0185
GPLY0124
GPLY0178
GPLY0182
GPLY0177
立冬本Lidongben
青壳宝圆Qingkebaoyuan
储良Chuliang
石硖Shixia
灵龙Linglong
车站龙眼Chezhanlongyan
云南8号YunnanNo.8
贵州1号GuizhouNo.1
贵州6号GuizhouNo.6
7811
泸圆106Luyuan106
十月龙眼Shiyuelongyan
龙荔Longli
万隆安Bandungan
依多Ee-Dor
施冲蒲Chompoo
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
Dimocarpusconfinis
(HowetHo)H.S.Do.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
DimocarpuslonganLour.
中国福建Fujian,China
中国福建Fujian,China
中国广东Guangdong,China
中国广东Guangdong,China
中国广西Guangxi,China
中国广西Guangxi,China
中国云南Yunnan,China
中国贵州Guizhou,China
中国贵州Guizhou,China
中国四川Sichuan,China
中国四川Sichuan,China
中国台湾Taiwan,China
中国广西Guangxi,China
印尼Indonesia
泰国Thailand
泰国Thailand
表1 试验用龙眼
Table1The16DimocarpusLour.genotypesusedintheexperiment
2期
yunnanensis(W.T.Wang)C.Y.WuetT.L.Ming),龙
眼是其中唯一广泛栽培的一个种[9]。据不完全统计,
全国约有400多个品种(系)[10]。近年来,国家果树种
质福州龙眼圃收集保存了包括栽培种、野生种、优良
株系在内的种质资源超过200个品种(系)。我们通
过测定龙眼ITS序列,初步分析了龙眼属的序列变
异规律并构建了系统发育树,以期为龙眼的分类研
究、品种鉴别技术提供新的方法和依据,进一步科学
的指导龙眼种质资源的收集、分类和评价,推进龙眼
遗传育种与种质创新的发展。
1 材料和方法
1.1 材料
本试验选用了涵盖龙眼主要产区的 15个龙眼
品种和1个龙眼近缘种—龙荔 [D.confinis(Howet
Ho)H.S.Lo.]。
所有样品均栽培在国家果树种质福州龙眼
圃(表 1),采集夏梢幼嫩展开叶片,立即送去实验
室-70℃冰箱中保存待用。
1.2 试剂
姜 帆等:龙眼属rDNA的ITS序列分析
本试验所用到的 dNTP、TaqDNA聚合酶、DNA
Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司;ITS扩
增引物 L1:forward:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG
G-3’,L2:reverse:5’-TTCCTCGCTTATTGATATGT-
TAAACTC-3’,由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.3 方法
1.3.1 龙眼基因组 DNA提取 按高慧颖等[11]的方
法提取基因组DNA,紫外分光光度计法和琼脂糖凝
胶电泳法检测 DNA的质量。稀释至所需要的浓度
后,-20℃保存。
1.3.2 ITS区扩增及纯化 PCR扩增反应的总体积
为 25μL,反应体系组成:10×PCRbufer(withMg2+)
2.5μL,primer(10pmol/L)2.0μL,dNTPmixture(10
mmol/L)2.0μL,模板DNA30ng,Taq酶 (5U/μL)
0.2μL,ddH2O补至25μL。扩增条件为:94℃预变性
5min;94℃变性 30s,52℃退火 1min,72℃延伸
1min,35个循环;最后一个循环后于72℃保温7min;
4℃保存。PCR产物采用回收试剂盒 (宝生物公司
(大连))进行纯化。
1.3.3 目的片段的转化、鉴定及测序 取适量纯化
的DNA连接于pMD-T18载体,转化到DH5α大肠
杆菌感受态细胞中,振荡培养。24h内挑选阳性克
隆。直接吸取阳性克隆子培养液1μL作为模板,按
ITS-PCR程序进行扩增。ITS序列测定由宝生物工
程(大连)公司完成。
1.3.4 序列数据的处理 ITS序列采用 DNAStar软
件进行同源性排列,适当手工编辑调整,并构建出系
统发育树。
2 结果与分析
2.1 ITS序列分析
根据登录在 Genbank中的无患子科 Alectryon
excelsus;Sapindusdelavayi;Cupaniacinerea植物的
18S-26SrDNA序列 (ACCESSIONNO:DQ499140;
AY207570;AY635526)确定了龙眼核糖体 DNA内
转录间隔区 ITS1和 ITS2与 3个编码区 18S、5.8S、
26S的界限(图 1),并把龙眼 ITS序列提交到 Gen-
Bank(登录号见表2)。
263
果 树 学 报 25卷
表3 龙眼15个品种及其近缘种龙荔ITS序列间的同源性比较
Table3ThecomparisonofhomologyfromthelonganITSsequence
序号
No.
登陆号
Accession
ITS ITS1 ITS2
长度
Length(bp)
GC含量
G+C(%)
长度
Length(bp)
GC含量
G+C(%)
长度
Length(bp)
GC含量
G+C(%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
EF488970
EF488971
EF488972
EF488973
EF532329
EF532330
EF532331
EF532332
EF532333
EF532334
EF532335
EF532338
EF532336
EF532340
EF532337
EF532339
626
626
626
619
626
619
616
619
619
626
618
619
646
619
619
619
62.5
62.4
62.5
62.4
62.5
62.4
62.7
63.0
62.4
62.7
62.5
62.4
62.5
62.2
62.5
62.4
234
234
234
227
234
227
234
227
227
234
227
227
235
227
227
227
65.4
65.4
65.4
65.2
65.4
65.7
65.8
66.5
65.2
65.4
65.6
65.2
65.1
65.2
65.2
65.3
228
228
228
228
228
228
228
228
228
228
227
228
247
228
228
228
64.9
64.5
64.9
64.9
64.9
64.5
64.9
65.4
64.9
64.9
64.8
64.9
65.2
64.5
65.4
64.9
表2 龙眼ITS序列长度及其(G+C)比率
Table2ThelengthoflonganITSandtheir(G+C)percentage
龙眼的ITS序列长度范围 (包括ITS1,5.8S和
ITS2)为618～626bp,变异较小,相差8bp;5.8S序列
长度高度保守,均为164bp。ITS1、ITS2序列的长度
范围分别为227～234bp和227～228bp(表2)。龙荔
与龙眼的ITS序列长度相比,变化较大。ITS序列长
度为646bp,比龙眼增加了20～27bp;5.8S序列长度
同样为 164bp;ITS1序列长度为 235bp;ITS2序列
长度为 247bp,变异较大,在 609处有一 19个碱基
长度的 Gap插入(GCGTCGCGGTCGTGACGCA)(图
1),比龙眼的增加19～20bp。龙眼ITS序列的GC含
量为 62.2%～63.0%。立冬本等 13个龙眼品种的
ITS1区GC含量均高于ITS2区,但是依多和近缘种
龙荔的ITS2区GC含量高于ITS1区(表2)。
2.2 基于ITS序列的聚类分析
基于ITS1、5.8S和ITS2序列,利用DNAstar软
件分析得到16个样品的同源性和距离矩阵(表3)。
15个龙眼栽培种之间具有很高的同源性,最低的是
贵州 6号与青壳宝圆、云南 8号、7811之间均为
98.1%;最高的是立冬本与储良、十月龙眼与施冲
蒲,均为100%。龙荔与 15个龙眼品种之间的同源
性在94.0%～94.7%之间。
基于龙眼ITS序列碱基变异规律还构建了龙眼
264
2期 姜 帆等:龙眼属rDNA的ITS序列分析 265
果 树 学 报 25卷
图2基于ITS区序列构建的系统发育树
Fig.2ThephylogeneticdendrogramoflonganbasedonITS
图115个龙眼和龙荔的ITS序列
Fig.1ThesequenceofITSinlongan
及其近缘种的系统发育树(图2)。结果显示:龙荔与
龙眼的分化十分明显,自为一单树系,而 15个龙眼
品种形成2个分支:a支由立冬本等6个品种构成;
b支由施冲蒲等9个品种构成。与果肉的质地、流汁
程度、香味等标准[10]表现较多品种的吻合性,即a分
支龙眼果肉容易流汁、肉质软韧或细嫩,代表性品种
为立冬本[9];b分支的龙眼果肉质地脆或爽脆、不流
汁、带有香味,代表性品种为石硖[9]。
2.3 龙眼品种间ITS序列的特异位点
序列分析表明,ITS序列的变异程度较高,部分
品种均有特定的变异位点或信息位点。9个龙眼均
有1个特异性的单核苷酸变异位点:青壳宝圆 511
9贵州6号GuizhouNo.6
16施冲蒲Chompoo
15依多Ee-Dor
12十月龙眼Shiyuelongyan
13龙荔Longli
1立冬本Lidongben
2青壳宝圆Qingkebaoyuan
3储良Chuliang
4石硖Shixia
5灵龙Linglong
6车站龙眼Chezhanlongyan
7云南8号YunnanNo.8
8贵州1号GuizhouNo.1
107811
11泸圆106Luyuan106
14万隆安Bandungan
020406080100
111.3
NucleotideSubstitutions(×100)
a
b
处(C-T)、石硖 143处(C-T)、车站龙眼 583处(G-A)、
云南8号197处(A-G)、贵州 1号 533处(T-C)、7811
的 369处 (A-G)、泸圆 106的 474处(缺失 G)、万隆
安534处(T-A)、依多401处(A-G);贵州6号有3个
特异性的单核苷酸变异位点425(C-G)、573(C-T)、
601(A-G);灵龙的47处(C-T)和475处(C-G)2个位
点结合作为特异位点。这为龙眼及其近缘种的系统
发育和分类学的研究提供了新的分子依据。
3 讨 论
3.1 龙眼属内ITS序列的特点
被子植物的ITS具有核苷酸序列的高度变异性
和长度保守性,据 Baldwin等[5]统计,ITS1的长度为
187～298bp,ITS2的长度为 187～252bp;5.8SrDNA
的长度也非常保守,一般为163bp或164bp。而且
不同类群间 ITS1与 ITS2的相对长度变化较大,前
者的变异分布大于后者。
试验结果表明,龙眼和其近缘种龙荔的ITS长
度为 619～646bp,ITS1为 227～235bp,ITS2为 227～
247bp,5.8SrDNA为 164bp,ITS1与 ITS2的相对长
度变化较大。分析表明龙眼ITS1和ITS2的变异位
点分别为 8个和 10个,分别占相应排列长度的
3.41%和 4.03%,但是 ITS1存在 1个 7个碱基的
Gap;龙荔 ITS1、ITS2的变异位点分别为 17个、15
个,占相应排列长度的7.23%、6.05%,表明龙眼属内
ITS1变异分布大于 ITS2,与 Baldwin等[5]、徐红等[12]
266
2期
的观点一致。
在 GenBank中检索到已公布的无患子科 4个
属植物的ITS序列,分别找到代表的品种为:Alec-
tryonexcelsus(登陆号:DQ499140),Sapindusdelavayi
(登陆号:AY207570),Cupaniacinerea (登陆号:
AY635526),Dodonaeaviscosa(登陆号:AY864896)。
由于 Alectryonexcelsus、Dodonaeaviscosa无扩增出
ITS1、ITS2的全长序列,所以只选择其5.8SrDNA与
立冬本、7811、龙荔比对,结果显示所有无患子科植
物的 5.8SrDNA序列长度都是 164bp,有 4个变异
位点,1个信息位点,保守位点 160个,属间变异率
仅为2.43%,表明无患子科植物的5.8SrDNA具有长
度和序列的高度保守性。
3.2 特殊种质—龙荔
龙荔植株主干性状、果实外观和荔枝相似;果实
形状、果肉颜色、种子形状和龙眼相近。对于龙荔的
分类地位有不同的观点:苏伟强等[13]认为龙荔是龙
眼和荔枝的自然杂交种;而易干军等[14]通过 AFLP
分子标记技术研究认为龙荔和龙眼有一定亲缘关
系,在相似系数为0.54时和龙眼能够聚在一起,高
慧颖等[15]运用 RAPD标记技术研究表明相似系数
0.59的水平上龙荔能够与龙眼聚在一起。龙眼 ITS
序列比对结果表明龙荔与龙眼有明显的分化,构建
的系统发育树显示龙荔自为一单树系,且龙荔和龙
眼品种间的同源性范围为94.0%～94.7%,明显低于
龙眼品种内最低 98.1%的同源性;在 ITS2序列的
609bp处有一19个碱基的Gap(GCGTCGCGGTCGT
GACGCA)插入。这些为证实龙荔是龙眼的一个近缘
种提供了分子证据。
3.3 ITS用于龙眼种内鉴定的可行性
近年来,随着分子生物学技术的发展,植物
DNA序列由于进化速率上的差异而被广泛的用于
不同分类阶元的系统发育研究。其中ITS序列在探
讨属下等级及种、种下水平的系统进化关系及种系
关系,甚至在讨论居群间的关系时,也体现了应有的
价值[16-17]。然而在不同的植物类群以及不同分类等级
上,因为起源时间即进化(分化)速率不一样,其 ITS
序列含有的信息量也不同[18]。
结果证明,15个龙眼品种和龙荔 ITS区序列分
化活跃、信息含量丰富。其中青壳宝圆等11个品种
具有各自的特征位点,可以用于构建龙眼分子鉴别
树;灵龙则通过特征变异位点的组合与其它龙眼进
行区分。但是研究发现借助ITS序列差异还不能够
把龙眼完全鉴别,福建的立冬本和广东的储良、泰国
的施冲蒲和台湾的十月龙眼 ITS序列完全一致,需
要借助 RAPD[14]等其它分子标记技术,才能进行有
效区分。
4 结 论
龙眼属内具有丰富的遗传多样性,其ITS序列
长度高度保守、碱基变异位点丰富。龙荔与龙眼种的
同源性明显低于龙眼品种之间的同源性。单一变异
位点或组合位点可以作为特征位点用于部分品种间
的分子鉴别,但个别品种还需要结合其它分子标记
技术或园艺性状进行区分。
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果 树 学 报 25卷268