全 文 ：FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
食 品 科 技
2011年 第 36卷 第 2期
杨梅 (Myrica rubra Sieb . et Zucc . )属 (Myri-
caceae)，原产于中国的亚热带，世界上有 60多种，
中国有 6 种。其中浙江省是我国杨梅的主产区，
全省杨梅面积达到 6万 hm2、产量 20多万 t，约占
全国杨梅栽培面积的产量 20%和产量的 30%。杨
梅枝叶和根皮在中国大陆、台湾地区和日本等地
常用作收敛剂、解毒剂和肠胃止泻剂等[1]。
自 20世纪 80 年代以来，日本和台湾学者对
杨梅枝叶药用成分进行了研究，并先后从杨梅枝
叶的有机溶剂抽提物中分离出杨梅素、单宁和三
萜化合物等几类活性成分[3- 5]。药理研究表明，杨
梅叶甲醇萃取物可治疗α- 萘基异硫氰酸酯诱导
的肝损伤，50%乙醇萃取物可抑制体内黑色素的合
成[6]。国内邹耀洪等[7]从杨梅叶中分离出 5种黄酮
类化合物，分别为杨梅素、杨梅素 - 3- O-β- D-
葡萄糖苷、杨梅素 - 3- O-α- L- 鼠李糖苷、槲皮
素 - 3- O-α- L- 鼠李糖苷、槲皮素 - 3- O-β- D-
葡萄糖苷，这 5种黄酮类化合物有显著的抗氧化
杨梅叶中抑菌成分的筛选及
分离纯化
陈 萍， 张拥军 *， 朱丽云， 陆 雯， 何杰明
(中国计量学院生命科学学院，杭州 310018)
摘要： 为探寻杨梅叶中有抑菌作用的有效成分，以抑菌率作为筛选活性成分的指标，对杨梅叶
的醇提物依次采用多级有机溶剂分步萃取、大孔吸附树脂柱层析、凝胶 Sephadex LH20柱层析等
分离手段进行逐级分离纯化，在分离的每一阶段对分离所得各个组分进行活性定量评估，并追
踪活性强的组分，最后将所得组分经 HPLC检测，可以得到较为单一的组分。
关键词： 杨梅叶；抑菌；分离
中图分类号： TS 202.3 文献标志码： A 文章编号： 1005- 9989(2011)02- 0189- 04
Screening and purification of the antimicrobial
component from the myrica rubra leaves
CHEN Ping, ZHANG Yong-Jun*, ZHU Li-yun，LU Wen, HE Jie-ming
(College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018)
Abstract: The aim was to screen the unknown component with the antimicrobial activity from the myrica rubra
leaves. This experiment adopted alcohol extraction, organic solvent extraction step by step, following the layer-
separation of the macroporous adsorption resin and molecular exclusion chromatography to reveal the unknown
effective ingredients in the myrica rubra leaves, which have the effect of antimicrobial activity. It gained the
simplex group-elements for antibacterial by the detection of HPLC.
Key words: myrica rubra leaves; antimicrobial; separation
收稿日期： 2010-05-04* 通讯作者
基金项目： 浙江省科技攻关计划项目(2007C22G2080004)。
作者简介： 陈萍，女，浙江绍兴人。
提取物与应用
189
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2011.02.044
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作用，这些成分是否同时具有抑菌活性有待于进
一步研究。沈建国等 [8]以烟草花叶病毒为供试病
毒，对杨梅叶提取物抗病毒活性进行测定。结果
表明，杨梅叶提取物具有较强的体外钝化和抗病
毒侵染作用，通过系统预试和含量测定，初步确
定杨梅叶提取物中主要含有黄酮和鞣质两类成分，
两者含量分别在水和体积分数为 70%的乙醇提取
物中较高。另外，关于杨梅树皮中抗炎类化合物
的研究报道较多，HISASHIM[9]已从杨梅树皮中分
离得到黄酮类、单宁类、三萜类、二芳基庚烷类
等化合物。近年来 Ding YW等[10]和Mathieu Tene等
[11]从杨梅树皮中分离出的二芳基庚烷类化合物具有
独特的化学结构，有抗肿瘤、消炎、抗氧化等多
种作用。
然而，有关杨梅叶所含的抑菌成分及其生物
活性的研究报道不多，本文利用浙江省杨梅的种
植优势，开展对浙江省内主要栽培的杨梅不同经
济品种的叶子提取物进行抑菌活性的研究，旨在
为系统开发杨梅植物资源在医药、食品和保健领
域的应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
1.1.2 材料 杨梅叶产自浙江省余姚市，荸荠种。
1.1.3 试剂及培养基 D101型大孔吸附树脂：天
津市海光化工有限公司；凝胶 Sephadex LH20：北
京绿百草科技发展有限公司；其他试剂：分析纯。
1.1.4 仪器 VS- 840K- U 洁净工作台， ZH-
WY- 2102C冷冻恒温培养摇床，ES- 315高压蒸汽
灭菌锅，GZX- 9240MBE数显鼓风干燥箱，PHX型
智能生化培养箱，ZHWY- 110 30 往复式水浴，
SPD- 20A液相色谱仪等。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基 营养肉汤：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10
g，NaCl 5 g，水 1000 mL，pH 7.0～7.2。
营养琼脂：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5
g，琼脂 20 g，水 1000 mL。
1.2.2 醇提工艺条件 新鲜杨梅叶洗净晒干后，粉
碎后过 40~60目筛，取 1200 g，采用 85%的乙醇，
以料醇比为 1∶10，温度为 40℃恒温振荡提取 2 h
后，过滤取滤液，滤渣按上述步骤重提 1次，再
将两次所得的提取液合并浓缩备用。
1.2.3 植物源提取物抑菌率的测定 经过预实验的
探索比较，将提取原液稀释成 0.022 g/mL，吸取 3
mL提取稀释液注入已灭菌的培养皿中，取供试菌
种 50μL(含菌数为 103~104 cfu，概液体培养 6 h)加
入提取物中混匀后，倒入培养基 10 mL混匀，以
不加提取物作为空白对照。
抑菌率(%)=(对照实验菌落数－相应浓度菌落
数)/对照实验菌落数×100
1.2.4 杨梅叶提取液抑菌活性成分的分步萃取 依
次用石油醚、四氯化碳、氯仿、乙酸乙酯、正丁
醇萃取分层，提取液与有机溶剂的体积比为 3∶1，
每种有机溶剂重复 2次，回收有机溶剂，最终得
到 6种物质：石油醚上层、四氯化碳上层、氯仿
下层、乙酸乙酯上层、正丁醇上层、正丁醇下层，
分别做抑菌实验。
1.2.5 大孔吸附树脂的洗脱条件 将抑菌活性最强
的萃取物上大孔吸附树脂柱，溶剂系统依次选用
水、30%酒精、50%酒精、70%酒精和 95%酒精，
每种溶剂至少以 3个柱体积的溶液量分别进行洗
脱，得到 5个组分分别做抑菌实验。
1.2.6 凝胶柱层析的洗脱条件 将过大孔吸附树脂
抑菌活性最强的组分上凝胶柱，溶剂系统为水 -
甲醇进行梯度洗脱，得到的主导组分再经过一次
凝胶柱，薄层板为单一点后，上高效液相色谱检
测纯度。
1.2.7 HPLC的色谱条件 选用 SymmetyShiildRP18
色谱柱(3.9 mm×150 mm，5μm)，流动相为甲醇 -
水(20∶80)，流速 1 mL/min，检测波长 230 nm，柱
温 40℃。
2 实验结果
2.1 杨梅叶提取物的抑菌效果
400 g杨梅叶经 85%的乙醇提取后，醇提物得
率为 9.73%，含量为 2.433 g/100 mL，根据固形物
含量把原液稀释 10 倍后做抑菌实验，对大肠
杆菌的抑菌率为 82.48%，对金黄色葡萄球菌的抑
菌率为 92.21%，抑菌效果较明显，进一步做下面
的分离。
2.2 杨梅叶分步分级后各组分的抑菌效果
2.2.1 杨梅叶分步分级后各组分的得率 杨梅叶提
取液经有机溶剂分级后，测定 6种物质固形物含
量与得率，结果见图 1。
由图 1可知，各萃取物得率如下，石油醚萃
取物 0.943%，四氯化碳萃取物 0.127%，三氯甲烷
萃取物 0.186%，乙酸乙酯萃取物 1.12%，正丁醇
提取物与应用
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萃取物 1.38%，水余留物 0.539%。其中正丁醇萃
取物得率最高，接下来依次为正丁醇萃取物、水
余留物、三氯甲烷萃取物、四氯化碳萃取物、石
油醚萃取物。
2.2.2 杨梅叶分步分级后各组分的抑菌效果 6层
萃取物的固形物含量分别为 0.279、0.435、0.668、
8.246、10.268、2.643 g/100 mL，将 6 种萃取液稀
释到统一的最小固形物浓度 0.279 g/100 mL，将原
液稀释 30倍后，各组分的抑菌率见图 2。
由图 2可知，乙酸乙酯层萃取物的抑菌效果
较好，对革兰阴性的大肠杆菌与革兰阳性的金黄
色葡萄球菌均有明显的抑菌作用，其次正丁醇层
萃取物的抑菌效果略低于乙酸乙酯层萃取物，也
具有较明显的抑菌效果。由于正丁醇属极性较强
有机溶剂，能够萃取极性较大的物质，极性大的
物质相对较难进行分离纯化，故本文为探讨抑菌
效果明显的极性物质的分离效果，对正丁醇萃取
物作进一步的分离纯化。
2.3 大孔吸附树脂柱层析组分的抑菌效果
收集正丁醇层组分上大孔吸附树脂柱后，固
形物含量分别为 0.204、 4.246、 3.824、 1.861、
1.286 g/100 mL，将 5种萃取液稀释到统一的最小
固形物浓度 0.204 g/100 mL，将原液稀释 30倍后，
各组分的抑菌率见图 3。
由图 3可知，5个组分中，50%乙醇洗脱下来
的组分抑菌效果最好，则选用 50%乙醇洗脱下来
的组分进一步分离。
2.4 凝胶柱层析的分离效果
收集经大孔吸附树脂富集的 50%乙醇洗脱组
分，经凝胶 Sephadex LH20柱分离，溶剂系统为水
- 甲醇 (20 ∶80)进行洗脱，得到的主导组分再经
过二次凝胶柱，采用高效液相色谱检测纯度。经
一次柱层析、二次柱层析后的组分，经紫外分光
光度计扫描，图谱见图 4。
由图 4可知，2个组分分别在 207、224 nm和
207、233 nm有吸收，其中 207 nm的吸收峰为溶
剂峰(甲醇)，样品的吸收峰分别在 224 nm和 233
nm，因此选用 224 nm和 233 nm进行紫外检测。
收集 2次过凝胶柱的组分，以及上凝胶柱之
前的组分经 HPLC 检测，选用 Symmety Shiil-
dRP18 色谱柱 (3.9 mm×150 mm，5 μm)，流动
相为甲醇 - 水(20∶80)，流速 1 mL/min，检测波长
分别为 224 nm和 233 nm，柱温 40 ℃。图谱见
图 5、图 6及图 7。
上述实验结果表明，杨梅叶的醇提物经有机
图 3 5种组分的抑菌率
图 5 大孔树脂 50%乙醇组分的 HPLC图谱
电
压
/m
V
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
时间/min
图 4 经一次、二次凝胶层析获得组分的紫外扫描图
190 240 290 340 390 440
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
波长/mm
得
率
/%
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2 3 4 5 6
层萃取物
图 1 杨梅叶不同萃取组分的得率
注：1为石油醚萃取物；2为四氯化碳萃取物；3为三氯甲烷萃取
物；4为乙酸乙酯萃取物；5为正丁醇萃取物；6为水余留物。
抑
菌
率
/%
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 2 3 4 5 6
6层萃取物
对大肠杆菌抑菌率
对金黄色葡萄球菌
抑菌率
图 2 杨梅叶提取不同萃取液层对微生物的抑制效果
注：1为石油醚萃取物；2为四氯化碳萃取物；3为三氯甲烷萃取
物；4为乙酸乙酯萃取物；5为正丁醇萃取物；6为水余留物。
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
抑
菌
率（
%）
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
水 30%乙醇 50%乙醇 70%乙醇 95%乙醇
一次
二次
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溶剂分步萃取后的正丁醇层经大孔树脂分离后主
要可以得到 3个组分，再进一步经凝胶柱分离后，
可以获得较为单一组分，该组分易溶于水，甲醇、
乙醇、丙酮等极性溶剂。
3 讨论
目前关于杨梅叶抑菌作用的研究报道较少，
国外还未见相关研究报道。实验中杨梅叶的 85%
乙醇提取物对常见革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)和
革兰阴性菌(大肠杆菌)均有明显的抑菌效果，尤其
是经大孔树脂的组分对金黄色葡萄球菌的抑制效
果十分明显。由于金黄色葡萄球菌感染后，需要
长时间、大剂量、多种抗生素交替使用才能彻底
除去，因此杨梅叶提取物对两类常见细菌明显的
抑菌效果具有较大实际应用价值。
实验以抑菌活性为筛选指标，对杨梅叶的抑
菌物质依次采用多级有机溶剂分步萃取、大孔吸
附树脂分离、凝胶 Sephadex LH20两次分离后，可
以获得较为单一的组分，关于所分离出组分的确
切的分子结构方面的信息在进一步的研究中。
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图 6 经过一次凝胶组分的 HPLC图谱
电
压
/m
V
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
时间/min
图 7 经过 2次凝胶组分的 HPLC图谱
电
压
/m
V
22
20
18
16
14
12
10
9
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
时间/min
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