全 文 ：经济林研究 20 0 5, 2 1 ( 2 ) : 5一 7
尸俐对
按属植物叶片 D N A 抽提
李志辉 , , 庞 统 “ , 杨模华 `
( 1
. 中南林学院资源与环境学院 , 湖南 株洲 4 12 0 0 6 ; 2 . 雷州林业局 , 广东 湛江 5 2 4 3 4 8)
〔摘 要 ] 对植物组织 D N A 抽提是在分子水平上对植物进行系统分析与研究的基础性工作 。 我们使用改 良 c T A B 法抽提按属植物
叶片中总的 D N A 获得了成功 ,其纯度和得率完全能满足常规分子生物学操作的要求 。 与 D N A 得率有关的几个 问题在此一并探讨 。
[关扭词」按属植物 ; D N A 抽提 ; 叶片 ; 改 良 c T A B 法
[中圈分类号〕 5 7 92 . 39 「文献标识码 ] A [文章编号习10 0 3一 s g s x ( 2 0 0 3 ) 0 2一 00 0 5一 0 3
D N A E x t r a c t i o n f r o m t h e L e a v e s o f E u e a l y P t u s P l a n t s
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D N A
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K e y w o r d s
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u e a l y p t u s p l a n t ; D N A e x t r a e t io n ; le a f b l a d e ; im p r o v e d C T A B m e t h o d
近年来 ,随着分子基因技术 的迅速发展 , 以 D N A 为基础的基因分析法 已广泛应用于林木遗传育种 ,人们
已逐步在林木细胞分子水平上认识林木性状 ,并已有可能直接在分子水平操作定向改良林木性状 。分子标记是
继形态标记 , 细胞学标记和生化标记后发展起来 的 、 以 D N A 多态性为基础 的一种新的遗传改 良工具 , 是基 因
型特殊的易于识别的表现形式 。 与其他三种遗传标记相 比 , 分子标记直接以 D N A 的形式表现 ,在植物体各组
织 ,各发育时期均可检测到且数量极多 , 多态性极多 ,多态性高 ,表现为 “ 中性 ” 。 抽提生物基因组 D N A 是进行
分子生物学研究的第 一步 。 生物基因组 D N A 主要包 括核 D N A (n D N A ) 、 线粒体 D N A ( m t D N A ) 和叶绿体
D N A (叩D N A ) 。 动物与微生物细胞无细胞壁 ,组成相对较为简单 ,其 D N A 抽提也较简单 ,植物组织 D N A 的抽
提步骤则要复杂得多 , 而且 由于不同植物间的化学成分差异 ,其 中主要是酚类物质对 D N A 抽提的影响很大 ,
因而具体到不同的植物其抽提方法又略有不同 。 按属植物种类很多 ,不同的种类之间组成成分差异也较大 。 本
研究的目的是探索一种简单而通用的按属植物 D N A 抽提方法 ,为进一步开展按属植物在 D N A 分子水平上的
系统分析研究奠定基础 。
1 材料和方法
1
.
1 实验材料
实验材料采 自湖南省资兴市国有林场的按树实验林 , 采集时间为 2 0 0 0 年 10 月 , 刚采集 的树叶先放在有冰
块的采样箱中冷藏 ,后置于一 76 `C 超低温冰箱中保存备用 。 用于 D N A 抽提实验的按属植物共 15 种 , 树种编号
如下 : A 赤按 , B 多枝按 , C 灰按 , D 山按 , E 直杆蓝按 , F 广叶按 , G 樟脑按 , H 二棱按 , I 园角按 , J 邓恩按 , K 红
〔收稿 日期 〕 2 0 0 3一 0 2一 2 5
〔基金项 目〕 湖南省 自然科学基金 “ 耐寒按树 的分子分类及鉴定 ” (0 。 J Y Z o 2 3) 。
〔作者简介〕 李志辉 ( 1 9 5 7一 ) ,男 ,湖南安化人 ,教授 ,博士 , 主要从事林木栽培和育种研究 。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2003. 02. 002
6 经 济 林 研 究 第 21 卷
按 , L 异色按 , M 巨按 , N 巨尾按 , O 尾叶按 。 这些种类的抗寒性有较大的差别 。
1
.
2 D N A 抽提试荆
① 2一 M E 甲一琉基乙醇 (体积分数 ) 9 9% ) ;② Z X C T A B 抽提液 ( C T A B 粉末 2 0 9 · L 一 ` , T r i s 一 H C L 0 . 1
m o l
·
L 一 ` p H 8
.
0
,
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.
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L 一 ’ , E D T A 0
.
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L 一 ` p H 8
.
0 ) ; ③ z o x C T A B / N a C I溶液 ( C T A B 粉末
10 0 9
·
L 一 ’ ; N a CI 40
.
95 9
·
L 一 ’ ) ; ④氯仿 /异戊醇或氯仿 /辛醇 (体积比 24 : 1 ) ; ⑤异丙醇 (体积分数 > ” % ) ;
⑥ N a C I溶液 (1 m ol · L 一 ’ ) ;⑦体积分数大于 9 . 5%和等于 76 %的乙醇 ;⑧ T E 缓冲液 ( T ir s 一 H C L 0 . 01 m ol ·
L
一 `
p H 5
.
0
,
E D T A 0
.
0 0 0 1 m o l
·
L 一 ’ p H 8
.
0 ) ;⑨ R N A s e A 。
1
.
3 实验方法和步骤
①称取 4一 5 克新鲜嫩叶加人液氮速冻后用研钵研磨成粉状 , 装入耐有机溶剂的玻璃瓶中 ,加人 2 10 拌L 一
琉基乙醇 ,用玻璃棒搅拌均匀 , 迅速放人一 20 ` C 的冰柜中 ,冷冻 12 一 15 h ;②向玻璃瓶中加人 60 ` C Z x C T A B 各
20 m L 于 60 C温浴 30 一 60 m in ,并不时摇匀 ;③转人 50 m L 离心管中 ,各加入等体积的氯仿 /异戊醇 (体积比为
24
: 1 )
,于手摇机上轻轻摇动 , 使氯仿 /异戊醇与 C T A B 缓 冲液充分混均 ,上部呈乳状液 为止 ; ④室温 ( 20 C )
4 0 0 印m离心 25 m in ;⑤取出离心管 ,静置片刻 ,取上清液移至另一干净的 50 m L 离心管中 。 先加人 1 / 10 体积
(约 Zm I J ) 10 x C T A B (预先加热到 60 ` C ) ,混匀后 , 再加人等体积的氯仿 /异戊醇 (体积比为 24 : 1 ) , 轻轻混匀 20
一 3 0 m in ; ⑥室温 ( Zo C ) 4 0 0 0 印 m 离心 2 0 m i n ; ⑦返回⑤再做一次 ;⑧室温 ( Z o C ) 4 0 0 0 r p m 离心 2 0 m i n ; ⑨
用 1 0 Ou L 移液器移出上清液 ,加人 2 3/ 体积的冷冻异丙醇 , 轻轻晃动至絮状物 出现 ; L离心收集沉淀物 ,
( 20 C )4 0 0 印m 离心 15 m in ;@倾去上清液 ,将离心管倒置在吸水纸上 , 在空气中干燥沉淀 1一 Z h ; L分别向
各管中加人已灭菌的 3 拌L I M N a C I和 5拼L R N a s e A , 于 5 6 C水浴 一2一 1 5 h ; IM N a C I能重悬 C T A B /核酸复
合物 ,有助于 R N as e A 消化除掉核酸中的 R N A ; L向水浴 12 一 15 h 后的离心管中加入 2 倍体积的冷冻无水乙
醇沉淀 D N A ,可见管 中有气泡状物产生 ;L用 自制的小钩钩出 D N A 沉淀 ,分别放人 1 . 5 m L 离心管 中 ,用 76 %
的乙醇 中洗 10 一 20 m in ;L倒出 76 % 乙醇 , 再加人无水乙醇洗 10 m in ;L倒出无水乙醇 ,在空气中干燥至没有
液珠出现为止 ;L用 1 . 4 m L T E 缓冲液溶解 D N A ;L在 D U 6 40 核酸蛋白分析仪上测定 D N A 浓度后 ,放人一
20 C 冰箱保存 。
2 结果与分析
2
.
1 改良 C T A B 法抽提按属植物叶片 D N A 获得了成功
针对按树叶片表面拥有较厚 的蜡质层 , 叶片中富含单宁 、 酚类物质等特有成分 ,为避免 D N A 被完全氧化 ,
我们采用谭晓风等抽提山茶叶片 D N A 时所使用的改 良 C T A B 法抽提按树叶片 D N A 。 即在抽提前加人 日一琉
基 乙醇以抑制多酚类物质氧化 ,用异丙醇沉淀 D N A ,并且增加了一次氯仿 /异戊醇的抽提次数 以尽可能除去其
中的蛋白质 、 多糖等碳水化合物 ,用 R N A se A 消化除去总 D N A 中的 R N A 。 测定所得 D N A 样品的浓度和纯度
显示 ,按属植物叶片 D N A 抽提获得了成功 (如图 1 所示 ) ,抽提样品 D N A 纯度均在 1 . 4 ~ 1 . 8 之间 , 并且 D N A
得率很高 , 每克叶片平均可获 80 产g D N A , 最高值为 3 40 拜g · g 一 ’ 。
2
.
2 与 D N A 得率有关的几种现象
抽提 D N A 效果的好坏一般从抽提
过程中所出现的一些现象就可以判别 。
( 1) 充分地释放并溶解细胞总 D N A
能大大抽高 D N A 抽提得率 。 被充分研磨
的叶片 ,在加入 Z X C T A B 抽提缓冲液后
温浴时间在一定范围内延长 , 加人氯仿 /
异戊醇后轻摇混匀越充分 的样品 , D N A
得率高 , D N A 浓度 、 纯度也会相 应地 有
所提高 。
( 2) 叶片本身所具有 的性质与叶片 图
1 C T A B 法抽提按树叶片 D N A 的 D N A 沉淀 圈
采集过程中应有的 D N A 保护措施严重影响 D N A 得率 。 抽提上清液呈清亮浅绿色的样品在加人异丙醇沉淀
D N A 时均可看到成 团的白色絮状物 , 此类样品 D N A 得率高 ; 而抽提上清液呈褐色或红褐色的样品在加入异
第 2期 李志辉等 :按属植物叶片 N D A抽提
丙醇沉淀 N D A时很难得到沉淀 ,则此类样品 D N A 得率几乎为零 。 未能得到沉淀的样品我们再次利用叶片重
复抽提 ,除极少数样品得到 D N A 沉淀外 ,重复抽提的其它样品仍未得到沉淀 。 这可能是植物叶组织中酚类物
质氧化呈褐色并与 D N A 结合 ,适宜的条件引起叶片中 D N A 被 D N A se 酶降解 , 因而 D N A 得率受到影响 。
( 3) 在抽提过程中 D N A 沉淀前向上清液中加人 10 x C T A B 时 , 晃动样品有絮状物出现但不能澄清的样
品 ,后续的 D N A 得率也相当低 ,这可能是那些不能澄清的絮状物引起 了 D N A 提前沉淀 。
( 4) 对抽提上清液加氛仿 /异戊醇去除蛋 白质等杂质时离心后中间层杂质含量高的样品 D N A 得率高 。
( 5 ) 抽提 D N A 得率与叶片发育程度有关 。 发育不完全过于幼嫩的叶片其 D N A 得率比刚发育成熟叶片抽
提的 D N A 得率低 ,但比老叶片 D N A 得率高 ,这与叶片中蛋白质 、糖类等杂质的含量有关 。
( 6) 不同按树种类因叶片中特殊成分含量的不同 , D N A 得率有差异 . 在本研究 中发现不同种按树其抽提
效果及 D N A 得率有较大的差异 , 巨按得率最高 , 可达 34 。 拼g · g 一 ` , 而山按 、 二棱按等高山类按树种类 D N A 得
率均较少 , 只有 12 ~ 15 ” g · g 一 ` , 这可能因按树种类不 同 , 其叶片中酚类 、 单宁和脂类等杂质含量差异较大 , 从
而影响了抽提过程中 D N A 的得率 。
( 7) 加人 尽一疏基 乙醇能有效地防止在抽提过程中出现的氧化现象 , 有效地保护 D N A 免遭降 。
3 讨论
3
.
1 有关植物 D N A 抽提
本研究 中我们用 C T A B 法抽提了 15 种按树叶片的 D N A 。 从植物组织中提取和分析 D N A 是植物分子生
物学的一个基本方面 。 分离不同来源的细胞总 D N A 有多种方法 ,但基本原理和主要步骤是相同的 。 目前关于
植物总 D N A 的抽提方法主要有两种 , 即 C s CI 梯度离心法和洗涤剂法 (如 S D S 法和 C T A B 法 ) 。 其可以分为两
个 阶段 : 在第一个阶段 ,植物细胞破裂后释放 出总 D N A ,这是一个关键的阶段 ,若不能破碎所有的细胞或者在
破碎细胞过程中 D N A 不能得到保护都会大大降低 D N A 的最后得率 ; 在第二个阶段 , D N A 与其他细胞组分如
蛋白质 、 碳水化合物 、 膜和细胞壁相分离 ,在这个阶段 ,重要 的是要保证大量的 D N A 不能混杂在细胞碎片中 ,
D N A 要与蛋 白质和其他污染物完全分离 , 因为这些污染物的存在会干扰下一步的分析 。 C s CI 梯度离心法抽提
植物细胞 D N A 纯度高 、 质量好 ,但 由于仪器设备 比较贵重 ,使用受到限制 ; 而洗涤剂法主要是 C T A B 法抽提植
物细胞总 D N A 不需要贵重的仪器设备 ,操作较为简单 , 能适用于许多植物的 D N A 抽提 ,且纯度又能满足分子
生物学实验的要求 , 因而从植物组织中抽提 D N A 多用此法 。
3
.
2 几点需要注意的问题
实验证 明 ,这种改 良的 C T A B 法适用于按树叶片 D N A 的抽提 , 提取的 D N A 量多 , 质量好 。 为了提高
D N A 的纯度和得率 ,建议有如下几点需要注意 :
( 1) 植物总 D N A 提取时 ,应使植物细胞壁有效破碎的同时尽量保持 D N A 的完整性 ,这是提取的重要一
环 。 国外文献中多采用冷冻干燥的材料进行提取 , 因为这种材料很容易粉碎 ,而且在这种情况下 D N A se 活性
极低 ,研磨时不会引起 D N A 降解 。 D N A 降解来 自两方面 , 即物理因素和 D an s e 活性 。 物理因素主要是机械剪
切力 ,溶液在震荡 、搅拌 、 转移 、 反复冻融 、 渗透压骤变及细胞急剧破裂内容物外泄的过程中 , 都会产生强烈的机
械剪力 。 因此我们在抽提过程 中 ,各项操作均温和进行 ,避免剧烈振荡和过度搅拌 ,转移 D N A 的吸头也剪去了
尖部 , 以扩宽管 口 。 为了防止 D an se 的降解作用 ,提取时所用的器具 、 研钵 、 离心管 、 溶液等都经过 了高压灭菌 。
同时在提取液中加人了二价金属离子鳌合剂 E D T A 来消除外源及内源 D an se 活性 。
( 2) 选用发育近乎完全而鲜嫩的叶片 , 因为过嫩 的叶片中蛋 白质 、 糖类含量多 , 不利于 D N A 的较好抽提 ,
而过老的叶片表面蜡质层较厚 ,不利于充分研磨破碎细胞以完全地释放 出 D N A乙
( 3) 在抽提过程 中 ,应尽量缩短抽提所需的时间 , 动作迅速 ,减少酚类物质的氧化 ,影响 D N A 得率 。
( 4) 所抽提的沉淀中含有核 D N A , 叶绿体 D N A ,线粒体 D N A 和植物总 R N A ,我们用 R N A se A 消化除去
D N A 中混杂的 R N A , 能达到纯化 D N A 的目的 。
( 5) 利用 C T A B 法抽提 D N A ,在 D N A 沉淀以前应保持在 15 ` C 以 上的室温 中进行 ,低于 15 ` C 时会引起
D N A 与 C T A B 复合物的提前沉淀 。
( 6) 在加人 T E 溶解样品 D N A 前 ,使 D N A 沉淀在空气中干燥 ,完全地除掉 C T A B 、 氯仿 、 异戊醇 、 异丙醇
及乙醇等小分子物质是非常必要的 。 (下转第 18 页 )
经 济 林 研 究 第 21 卷
但在这里必须强调 ,茶树的轻修剪与春季生产高档茶之间矛盾 ,会影响 “ 明前茶 ” 的生育及其产量 。 以上从
茶多酚 、 氨基酸 、 可溶性糖 、 水浸出物 、 叶绿素 5 个方面对轻修剪时期进行的分析表明 , 不同修剪时期对茶多酚
和氨基酸的影响差异不明显 : 对可溶性糖的差异性较显著 ;而对水浸出物和叶绿素影响达到极显著水平 。 从多
重比较分析来看 , 以 10 月份进行秋季轻修剪 的差异性最 明显 。 因此 ,为开发高档茶 ,可以改春轻修剪为秋轻修
剪 ,使茶树有充足时间恢复生机 ,促进春茶芽多发 、 早发 , 提高春茶产量和产值 。
2
.
2
.
6 不 同修剪程度对早市茶品 质的影响
试验结果表明 ,在 10 月份不同修剪程度对早市名优茶茶多酚 、 可溶性糖 、 水浸出物 、 叶绿素含量有极显著
性影响 ;而氨基酸含量无明显著影响 。 多重比较结果表明 ,对于茶多酚 , 未修剪和深度修剪之 间有显著性差异
(表 5 ) ;在氨基酸方面 3 个处理无显著性差异 ; 对于可溶性糖和水浸出物 ,轻修剪和未修剪之间差异不明显 ; 对
于叶绿素 ,轻修剪和深度修剪之间无显著性差异 。 而从 5 种成分相比而言 , 以未修剪的平均含量较高 (表 5 ) 。
以 _上的试验结果分析表 明 , 未修剪的茶树各种品 表 5 不 同修剪深度对早市名优茶品质成分含 t 差异显著性表
质性状均较好 ,但并不能说明不进行修剪就好 , 因为若
茶树长期不修剪 , 蓬面不整齐 , 芽叶顶端优势不能去
除 ,将会影响新梢的萌芽 。 从产量测定结果来看 , 春茶
前不修剪芽叶发得早 ,产量高 。 因此 , 无论从产量还是
内质分析 , 春茶前不修剪对早市茶生产是有好处的 。 对
于修剪程度较深的茶树 , 由于枝叶去除多 ,茶树恢复所
需能量和营养多 , 因而茶树不仅萌发迟 ,而且内含成分
相应也较低 , 不利于名优茶生产 。
成分 平均含量 差异显著 ( 。 . 01 )
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28301切乐467..2茶多酚
氨基酸
可溶性糖
3 结论与讨论
( 1) 在修剪时间方面 , 采取 10 月份秋轻修剪早市
茶茶多酚 、 氨基酸 、 可溶性糖 、 叶绿素 、 水浸出物均优于
其它时期的修剪处理 。 从修剪深度来看 , 以未修剪为
好 ,深度修剪内含成分含量较低 。
水浸出物
叶· 绿素
变异来源
深度修剪
轻修剪
未修剪
深度修剪
轻修剪
未修剪
深度修剪
轻修剪
未修剪
深度修剪
轻修剪
未修剪
深度修剪
轻修剪
未修剪 2 . 4 8
( 2) 从品质成分分析来看 , 早市茶生产茶园的修剪应掌握春茶前可以不修剪 , 即使修剪也应宜早不宜迟 , 在
l() 月份较为理想 。
〔参 考 文 献」
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(上接第 7 页 )
(7) 将所得 D N A 溶于 T E 液中 (或无水 乙醇 )于一 20 c 保存 , T E 液中的 E D T A 可赘合二价金属离子以抑
制 D N A 酶活性 , T E 的 p H 值为 8 ,可减少 D N A 的脱氨反应 ,在这种条件下 D N A 可保存石 a 以上 。
〔参 考 文 献〕
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