全 文 ：1306 环球中医药 2015 年 11 月第 8 卷第 11 期 Global Traditional Chinese Medicine，November 2015，Vol. 8，No. 11
·巴西草药研究专题·
基金项目:国家国际科技合作专项(2011DFA31370)
作者单位:100102 北京中医药大学中药学院［臧艺玫(硕士研
究生)、顾选、王娟、肖瑶、吴浩忠、刘春生、马长华］，针灸推拿学院
(赵百孝) ;北京华邈中药工程技术开发中心(顾选) ;河南省药品审
评认证中心(余春霞) ;中医养生学研究所［韩丽(硕士研究生) ］
作者简介:臧艺玫(1990 － ) ，女，2013 级在读硕士研究生。研
究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:meiyee0810@ sina． com
通讯作者:刘春生(1964 － ) ，博士，教授，博士生导师。研究方
向:药用植物与分子生药学。E-mail:max_liucs@ 263． net
基于显微—DNA条形码—产地分析联用的
巴西柑橘属植物药 FARINHA DE LARANJA
(枳壳)基原鉴定研究
臧艺玫 顾选 余春霞 王娟 韩丽 吴浩忠 肖瑶 赵百孝 刘春生 马条华
【摘要】 目的 利用显微 － DNA条形码 －产地分析联用的方法对巴西柑橘属植物药 FARINHA
DE LARANJA粉末进行基原鉴定研究。方法 应用显微鉴定的方法对药材粉末的基原进行初步判定;
再提取样品 DNA，扩增 ITS 序列，利用 NCBI 数据库中的 BLAST 功能分析相似度，对样品品种进行
DNA条形码鉴定;最后结合产地信息对数据库中的序列进行筛选。结果 显微-DNA条形码-产地综
合分析结果表明，该样品为芸香科柑橘属 Citrus L．植物酸橙 Citrus aurantium的干燥未成熟果实粉末。
结论 巴西植物药 FARINHA DE LARANJA的鉴定可为扩大枳实、枳壳等中药材的药用资源提供依据。
【关键词】 柑橘属; 药材粉末; 基原鉴定; DNA条形码
【中图分类号】 R284 【文献标识码】 A doi:10. 3969 / j. issn. 1674-1749. 2015. 11. 008
The variety identification of FARINHA DE LARANJA powder in Brazil based on a combined analy-
sis of microscopic-DNA barcoding-origin ZANG Yi-mei，GU xuan，YU Chun-xia，et al． School of Chi-
nese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China
Corresponding author:LIU Chun-sheng，E-mail:max_liucs@ 263． net
【Abstract】 Objective o study the variety identification of a kind of herbal powder of FARINHA
DE LARANJA of Citrus L． in Brazil with a combaned analysis of microscope － DNA barcoding － origin．
Methods Microscopic identification was used to identify the variety of samples preliminarily;then ITS se-
quences were amplified by PCR and sequenced，and BLAST in NCBI database was used to calculate the
similarity of sequences to identify variety of samples．，Finally，the DNA barcoding identification results
were screened and analyzed according to its geographical origin information． Results The combined analy-
sis of microscopic － DNA barcoding － origin indicated that FARINHA DE LARANJA collected from market in
Brazil was the dried fruit powder of Citrus aurantium． Conclusion The identification of Brazil FARINHA
DE LARANJA could enrich the alternative resources of Zhiqiao and Zhishi．
【Key words】 Citrus L．; Powder; Varieties identification; DNA barcoding
植物药基原鉴定的基本方法包括植物文献学
研究、产地调研、标本采集和实验室植物分类鉴定
等［1］，但对于粉末类药材，由于其植物形态特征大
部分已被破坏，以上方法均难以实行。笔者在巴西
市场收集药材样本时发现，一种名为 FARINHA DE
LARANJA的粉末类药材来源无法确定，因此有必要
对该药材进行基原鉴定。
由于不同科、属植物的显微结构具有不同特
征，故可利用显微鉴别的方法初步对药材粉末进行
鉴定［2］;DNA条形码技术具有准确、快速、能鉴别无
背景信息物种的优点［3-5］，可对属内植物进行较为
准确的鉴定;最后结合该属植物在产地的分布状
况，可完成药材粉末的基原鉴定。本文拟采用显微-
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DNA条形码-产地分析联用的方法对 FARINHA DE
LARANJA粉末进行基原鉴定，以期为扩大柑橘属药
用资源提供依据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
FARINHA DE LARANJA 样品 10 份，每份200 g，
2012 年 4 月购买于巴西隆城市场药材集散地，样品
的凭证标本保存于北京中医药大学标本室。
1． 2 试剂
广谱植物基因组 DNA 快速提取试剂盒(北京
博迈德生物有限公司，批号:69632855)、rTaq酶(上
海生工生物工程有限公司，批号:695673BE)、乙醇
(北京化工厂，批号:1124120381060079)、琼脂糖
(BIOWEST，批号:142045)、ddH2O等。
1． 3 仪器
显微镜(OLYMPUSCX-21，中国) ，SY-601 超级
恒温水浴(天津欧诺仪器仪表有限公司) ，L-901 涡
旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ，
JA1103N千分之一精密电子天平，SIGMA3K-15 低
温高 速 离 心 机 (SIGMA 公 司) ，TECHNE TC-
3000PCR扩增仪，Bio-Rad 电泳仪，水平电泳槽(北
京六一仪器厂) ，JS-680B 全自动凝胶成像分析仪
(上海培清科技有限公司) ，GRANT 制冰机，超纯水
制备系统，KQ5200E 型超声波清洗器，SANYO －
80℃超低温冰箱(SANYO 公司) ，DHG-9145A 型电
热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
1． 4 基于显微的鉴定方法
按照《中华人民共和国药典》(一部)［6］中显微鉴
定的方法，比较样品与中药材枳实显微特征的异同。
1． 5 DNA条形码鉴定方法
取 10 份样品，观察形态，形态结果一致。每份
样品取 40 mg进行 DNA提取。各份样本分别用液
氮冷冻后研磨成细粉，按照广谱植物基因组 DNA
快速提取试剂盒操作步骤提取样品 DNA，1%琼脂
糖凝胶电泳检查 DNA 纯度及完整性。采用 ITS
(internal transcribed spacer)序列通用引物对样品
进行 PCR 扩增，ITS-R:5-CGTAACAAGGTTTCCG-
TAGGTGAA -3，ITS-F:5-TTATTGATATGCTTA-
AACTCAGCGGG -3。PCR 扩增条件:50 μL 体系
含 2 × Taq PCR MasterMix 25 μL，ITS-R(5 μmol /L)
2． 5 μL，ITS-F(5 μmol /L)2． 5 μL，DNA 模板
4 μL，ddH2O 16 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性
5 分钟，94 ℃变性 1 分钟，55 ℃退火 1 分钟，72℃
延伸 1 分钟，35 个循环;72℃ 再延伸 10 分钟。
PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一
明亮者即扩增成功。PCR 扩增产物经纯化后，送
上海生工生物工程有限公司测序部测序。各样品
均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。
利用 ContigExpress软件对测序获得的正、反向序
列进行拼接，以 TCGA/T和GACCC /TC作为 ITS序列
边界截取 ITS序列，然后利用相似度法分析序列。
根据 NCBI 中相似度搜索法(basic local align-
ment search tool，BLAST)功能，检索样品的 ITS 序列，
本文以相似度 90%以上为属的鉴定依据，以相似度
97%以上的最高相似度物种为物种鉴定依据，获得鉴
定结果。若 BLAST 比对后得到的序列相似度均在
97%以下，则认为数据库中可能未注册该序列，此时，
根据“DNA条形码鉴定方法”仅能鉴定到属水平;该
属中未注册序列的物种可能为鉴定结果。
1． 6 基于产地分析的鉴定方法
根据“基于 DNA 条形码鉴定方法”项下获得的
科、属和种的鉴定结果，依据《巴西植物志》记载的
巴西分布的该属植物物种信息，依次分析最高相似
度物种的产地是否相符合，如果符合，则为产地鉴
定结果，继续进行下一项分析;如果不符合，则分析
第二最高相似度物种，以此类推，分析直至相似度
97%的物种。若相似度在 97%以上的物种产地均
与样品产地不相符合，则认为数据库未注册该样品
序列，无法根据“基于产地分析的鉴定方法”准确鉴
定到种水平。
2 结果
2． 1 FARINHA DE LARANJA粉末的显微鉴定结果
FARINHA DE LARANJA 粉末的显微特征如下:
粉末黄白色或浅黄色;中果皮细胞较多，类圆形或
形状不规则，壁大多呈不规则增厚;草酸钙方晶存
在于果皮和汁囊细胞中，呈斜方形、多面体形或双
锥形，直径 3 ～ 30 μm;汁囊组织淡黄色或无色，细胞
多皱缩，并与下层细胞交错排列;螺纹导管、网纹导
管及管胞细小;果皮表皮细胞表面观多角形、类方
形或长方形，见图 1、图 2。显微特征分析表明，本品
粉末的显微特征与中药材枳壳基本相同［7］，而无枳
实的“橙皮苷结晶、油室碎片”等显微特征，故初步
判定该粉末的来源为柑橘属 Citrus L．植物酸橙 Cit-
rus aurantium的干燥未成熟果实。
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图 1 FARINHA DE LARANJA的粉末图
1．中果皮细胞 2．草酸钙方晶 3．汁囊组织
4．导管 5．果皮表皮细胞
图 2 FARINHA DE LARANJA粉末的显微图
2． 2 DNA条形码鉴定结果
2． 2． 1 科属的鉴定 10 份样品的测序峰图良好，
测序结果一致，选择一条序列用于后续分析。截取
ITS片段后，经 BLAST 检索，样品与芸香科柑橘属
Citrus L． 植物相似度最高，相似度范围为 90% ～
100%，与其他属相似度均低于 97%。因此，该样品
来自芸香科柑橘属 Citrus L．植物。
2． 2． 2 种的鉴定 根据分子鉴定指标(相同物种
相 似 度 达 到 97% 以 上 ) ，Citrus clementina
(XM006423861． 1， 100%)、 Citrus reticulata
(FJ641932． 1，100%)、Citrus sinensis (JN681150． 1，
100%)及 Citrus aurantium(AB456074． 1，98%)等
植物可能为 FARINHA DE LARANJA 的基原，其中，
最佳鉴定结果为 Citrus clementina。
2． 3 基于产地分析的鉴定结果
《巴西植物志》记载柑橘属 7 种植物 C． auranti-
um、C． decumana、C． limetta、C． limonum、C． medica、
C． spinosissima(未注册)、Citrus vulgaris，根据 DNA
条形码鉴定结果，最佳鉴定结果不在巴西分布，在
相似度 97%以上的可能基原中，只有 Citrus auranti-
um在巴西生长，且在巴西以果实入药，因此，根据产
地分析，FARINHA DE LARANJA 的基原为芸香科柑
橘属酸橙 Citrus aurantium。
3 讨论
粉末类的药材易于取用且冲泡便捷，但由于性
状特征不明显，其真伪鉴别一直是植物药鉴定中的
难点。显微鉴定是传统鉴定中的常用方法之一，它
能够对药用部位进行较为准确的判断，但由于属内
植物可能存在组织特征的相似性，部分近缘种药材
较难利用显微鉴别区分［8］。DNA 条形码技术准确
度更高，且不依赖于药材形态及鉴定人员经验［9］，
更适用于粉末类药材的鉴定。DNA 条形码的序列
分析主要依靠 NCBI 数据库中注册的序列，还需根
据本批药材的已知产地来源对数据库中的序列依
次进行筛选，最终结合入药部位确定最佳鉴定结果。
本文研究表明，本次收集的 FARINHA DE
LARANJA药材的基原植物为芸香科酸橙 Citrus au-
rantium的干燥未成熟果实，与 2010 版《中华人民共
和国药典》(一部)中记载的枳壳基原植物相同。但
其是否可被当做枳壳使用，尚需对其主要化学成分
进行含量测定及分析研究。
巴西是全世界柑橘属 Citrus L．产品产量最大的
国家，酸橙作为柑橘属的一种，产量也高于其他产
地［10-11］。因此，中国可在巴西建立酸橙栽培基地，
适当的进口巴西酸橙幼果和未成熟果实，进而扩大
中药材枳实和枳壳的药用资源。
参 考 文 献
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［2］ 刘萌萌，李峰．显微鉴定新技术在中药材鉴定中的应用进展
［J］．辽宁中医药大学学报，2011，13(12) :50-52．
［3］ 陈士林．中药 DNA 条形码鉴定体系及研究方向［J］． 世界科
学技术—中医药现代化，2011，13(5) :747-754．
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［J］．世界科学技术—中医药现代化，2010，12(3) :331-336．
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［J］．药物分析杂志，2014，34(11) :2066-2070．
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中的研究进展［J］．食品与药品，2013，15(4) :295-299．
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的研究［D］．重庆:西南大学，2008．
(收稿日期:2015-08-22)
(本文编辑:董历华)