全 文 ：3 讨论
根据单因子与正交实验结果，影响 PCR 反应的
各因素的适宜浓度都较广，在一定范围内，条带的数
目和清晰程度差别不大，仅在亮度上有略微的区别，
表明该体系的稳定性与重复性较高。而 RAPD标记
是以 10 bp的随机引物对基因组 DNA进行扩增，不
同引物的退火温度也比较接近，有利于同时对多种
引物进行扩增。
在 400 个随机引物中，只有一个引物在雌雄基
因组上发现了差异条带，说明华中五味子的性别差
异对整个基因组来说是很微小的。RAPD 本身受到
多种因素的制约，可能会影响性别鉴定的准确性，因
此，将其转化为特异性更好的 SCAR标记，是下一步
研究的主要内容。本实验得到的 RAPD 标记，可作
为华中五味子雌雄鉴定的分子依据。
参 考 文 献
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ITS2 序列鉴别 10 种杜鹃属药用植物
刘义梅1，张乐华2，陈士林3，陈科力1*
(1. 湖北中医药大学药学院教育部中药资源和中药复方重点实验室，湖北 武汉 430065;2. 中国科学院庐
山植物园，江西 庐山 332900;3. 中国医学科学院 /北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)
摘要 目的:对 10 种杜鹃属药用植物进行分子鉴别。方法:对 4 个种 5 个样本的核基因 ITS2 片段进行 PCR
扩增并双向测序，所得序列经 CodonCode Aligner 拼接后，结合从 GenBank 上下载的 18 个样品的序列用 MEGA4. 0
软件进行相关数据分析，并用非加权配对算术平均法(UPGMA)构建聚类树。结果:10 种杜鹃属药用植物的 ITS2
序列长度为 242 ～ 245 bp，其所构建的系统树各个种不同的样本均分别聚在一起，表现出单系性。结论:ITS2 序列
能够有效区别 10 种杜鹃属药用植物，对杜鹃属中药材的鉴定具有一定的应用价值。
关键词 杜鹃属;药用植物;ITS2;鉴别
中图分类号:Q943. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)09-1342-04
收稿日期:2011-03-02
基金项目:国际科技合作项目(2007DFA30990) ;卫生部行业科研专项(200802043) ;科技部国际科技合作重点项目(2007DFA31410) ;江西
省学科带头人培养计划项目(2010DD00500)
作者简介:刘义梅(1971-) ，女，博士，副教授，主要从事中药资源及其品质研究;E-mail:liuyimei1971@ 126. com。
* 通讯作者:陈科力，E-mail:Kelichen@ 126. com。
·2431· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 9 期 2011 年 9 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.09.010
杜鹃属(Rhododendron)是杜鹃花科最大的家
族，《中国植物志》英文版收载全世界约有1 000种，
广泛分布于欧洲、亚洲，我国约有 571 种〔1〕。其中兴
安杜鹃(Rhododendron dauricum L. )和羊踯躅(Rho-
dodendron molle (Blum)G. Don)是 2010 版中国药
典收载的中药满山红和闹羊花的基源植物〔2〕，其同
属植物刺毛杜鹃(Rhododendron championae Hook)、
大白杜鹃(Rhododendron decorum Franch. )、马缨杜
鹃(Rhododendron delavayi Franch. )、满山红(Rhodo-
dendron mariesii Hemsl. et Wils. )、照山白(Rhodo-
dendron micranthum Turcz)、马银花(Rhododendron
ovatum Planch. )、大字杜鹃(Rhododendron schlippen-
bachii Maxim. )、杜鹃(Rhododendron simsii Planch. )
也有一定的药用价值，对慢性支气管炎、月经不调、
痛经、产后关节痛、高血压、冠心病、疮肿、骨折等有
较好疗效〔3〕。但杜鹃属药用植物如大白杜鹃(Rho-
dodendron decorum Franch. )和羊踯躅等含有毒性成
分，混淆使用容易引起严重的中毒事件〔4〕;且这些
药用植物同名异物、同物异名现象严重 〔5〕，再加上
杜鹃属近缘植物形态特征比较相近，采用传统的鉴
定方法有一定的局限。
ITS2 片段在物种水平的变异较快，在中药材的
物种鉴定方面具有潜在的研究价值〔6-8〕。本文利用
ITS2 序列对杜鹃属 10 种中药原植物进行鉴别，为
这些药材的分子学鉴定提供证据。
1 材料与方法
1. 1 材料 实验材料采自江西庐山和云南西双版
纳，由中科院庐山植物园张乐华研究员鉴定，数字影
像信息及凭证标本分别保存于湖北中医药大学和庐
山植物园标本馆。实验材料来源和 GenBank 下载
的数据见表 1。
表 1 杜鹃属 10 种药用植物材料来源
序号 植物中文名 拉丁学名 采集地 标本号 GenBank登录号
1 兴安杜鹃 Rhododendron dauricum HM854158
2 刺毛杜鹃 Rhododendron championae 中科院昆明植物所 LS0508MT02 HQ707044
3 刺毛杜鹃 Rhododendron championae AF393426
4 大白杜鹃 Rhododendron decorum DQ295782
5 大白杜鹃 Rhododendron decorum DQ677623
6 大白杜鹃 Rhododendron decorum EF028351
7 大白杜鹃 Rhododendron decorum FJ873388
8 马缨杜鹃 Rhododendron delavayi 中科院庐山植物园 LS0512MT01 HQ707047
9 马缨杜鹃 Rhododendron delavayi AY962556
10 满山红 Rhododendron mariesii AF297202
11 满山红 Rhododendron mariesii AF432470
12 照山白 Rhododendron micranthum 中科院昆明植物所 LS0536MT02 HQ707061
13 羊踯躅 Rhododendron molle 中科院庐山植物园 LS0567MT01 HQ707062
14 羊踯躅 Rhododendron molle 中科院昆明植物所 LS0567MT02 HQ707063
15 马银花 Rhododendron ovatum AF393424
16 马银花 Rhododendron ovatum AF432421
17 马银花 Rhododendron ovatum AF432476
18 马银花 Rhododendron ovatum AF432477
19 大字杜鹃 Rhododendron schlippenbachii AB105237
20 大字杜鹃 Rhododendron schlippenbachii AF404816
21 杜鹃 Rhododendron simsii AB105234
22 杜鹃 Rhododendron simsii AF285848
23 杜鹃 Rhododendron simsii AF432423
注:未注明出处，均表明为直接从 GenBank下载的数据
·3431·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 9 期 2011 年 9 月
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA 提取:取植物叶片约 10 mg，硅胶干
燥，经液氮研磨后，使用植物 DNA 提取试剂盒
(Tiangen Biotech Co. ，China)提取总 DNA。
1. 2. 2 PCR扩增及测序:采用引物扩增 4 种 5 个
样本的 ITS2 基因片段，引物 ITS2F(5-GCGATACTT-
GGTGTGAAT-3)和 ITS3R(5-GACGCTTCTCCAG-
ACTACAAT-3)由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。PCR 反应体积为 50 μL，体系内含 MgCl2
4 μL (25 mM)、dNTP 4 μL (2. 5 mM)、PCR buffer 5
μL(10 ×)、引物各 2. 0 μL (2. 5 μm) (Sangon Co. ，
China)、聚合酶 2. 0U (Biocolor BioScience ＆ Tech-
nology Co. ，China)、总 DNA 约 1 μL (－ 30 ng)。扩
增程序为 94 ℃，5 min;94 ℃，30 s;56 ℃，30 s;
72 ℃，45 s;40 cycles;72 ℃，10 min。PCR扩增产物
经纯化后，使用 ABI 3730XL 测序仪 (Applied Bio-
systems Co. ，USA)双向测序。
1. 2. 3 数据处理:测序峰图用 CodonCode Aligner
V 2. 06 (CodonCode Co. ，USA)校对拼接，连同 Gen-
Bank上下载的 ITS 序列，使用基于隐马尔可夫模型
的 HMMer 注释方法去除两端 5. 8S 和 26S 区段获得
ITS2 间隔区序列〔9〕。用 MEGA 4. 0 分析比对并进
行遗传距离等分析，用 UPGMA 法对比对的序列构
建系统聚类树。利用 bootstrap (1 000 次重复)检验
各分支的支持率。
2 结果与分析
2. 1 序列比较 10 种 23 个样本的杜鹃序列长度
为 242 ～ 245 bp，GC 含量为 57. 9% ～ 60. 1%，根据
Kimura-2-P 参数遗传距离模型计算得到的序列间遗
传距离，最远的 2 个种是刺毛杜鹃与杜鹃，距离值为
0. 0699;最近的是马缨杜鹃与大白杜鹃，距离值
0. 0083。大字杜鹃与羊踯躅的遗传距离值为
0. 0341 ～ 0. 0385，与满山红的遗传距离值为 0. 0253
～ 0. 0296。
2. 2 聚类分析 基于 ITS2 序列，通过非加权配对
算术平均法所构建的 UPGMA系统聚类树图可以看
出，10 个种的不同样本均分别聚在一枝，表现出单
系性，与其他同属近缘种能够很明显区分开。
3 讨论
从基于 ITS2 序列构建的 23 个样本的 UPGMA
树看(见图 1) ，10个杜鹃属药用植物的不同样本分别
聚在一枝，每一枝的 bootstrap 支持率都大于 85%，与
所列其他同属药用植物能够很明显区分开，说明 ITS2
可以准确的鉴别杜鹃属这 10种药用植物。
图 1 基于 ITS2 序列构建的 23 个样本的 UPGMA树
注:bootstrap 1 000 次重复，枝上仅显示自展支持率≥85%的数值
·4431· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 9 期 2011 年 9 月
中国药典收载的中药满山红的基源植物为兴安
杜鹃(Rhododendron dauricum L. ) ，在《中国植物志》
上划分为迎红杜鹃亚属，而来源于映山红亚属的另
一植物满山红(Rhododendron mariesii Hemsl. et
Wils. )也可做药用〔1〕，由于满山红的植物名与来源
于兴安杜鹃的满山红药材名相同常常被混用。结果
表明这两种植物间的遗传距离值为 0. 0295，远远大
于种内的遗传距离值，图 1 聚类树显示 2 个种分别
聚为不同的 2 枝，用 ITS2 很容易鉴别这 2 种同名异
物药材基源。
杜鹃属 23 个样品 10 个种的遗传距离表明最近
的 2 个种是马缨杜鹃与大白杜鹃，这 2 个种同属于
常绿杜鹃亚属常绿杜鹃组;遗传距离最远的是刺毛
杜鹃与杜鹃，这 2 个种分属于马银花亚属长蕊组和
映山红亚属映山红组。大字杜鹃兼有映山红亚属轮
生叶组和羊踯躅亚属的某些特征，其系统位置一直
存在争议。Slemuer〔10〕将大字杜鹃置于映山红亚属
轮生叶组中，而 Judd 等〔11〕将大字杜鹃归并到羊踯
躅亚属。本实验结果表明大字杜鹃与映山红亚属轮
生叶组的满山红遗传距离值小于羊踯躅亚属的羊踯
躅，说明大字杜鹃与映山红亚属轮生叶组植物的亲
缘关系较近。
综上所述，ITS2 序列不仅能够准确区别 10 种
杜鹃属药用植物，同时对于探讨杜鹃属不同物种间
的亲缘关系亦能起到一定的作用。
参 考 文 献
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