全 文 ：第 25卷第 1期
2007年 1月 干 旱 地 区 农 业 研 究Agricultural Research in the Arid Areas Vol.25 No.1Jan.2007
　
收稿日期:2006-04-10
基金项目:国家自然科学研究基金项目(30360070)
作者简介:宛涛(1959—),男 ,内蒙古呼和浩特市人 ,教授 ,主要从事遗传育种的教学和孢粉学研究。
内蒙古白刺属植物遗传多样性的 RAPD分析
宛　涛1 ,蔡　萍2 ,伊卫东1 ,张晓明3 ,张辰波1
(1.内蒙古农业大学生物工程学院 , 内蒙古呼和浩特 010018;2.锡林浩特牧业学院 ,
内蒙古 锡林浩特 026000;3.呼伦贝尔大学 , 内蒙古海拉尔 021008)
　　摘　要:利用随机扩增 DNA多态性(RAPD)技术对 4 种不同地理种群的白刺属(Nitraria L.)植物进行了遗
传多样性分析。 15 个引物扩增出 118 个位点 ,其中多态性位点 95 个(80.5%), 各引物的 Nei s 指数和 Shannon s
多样性指数差别较大 ,利用 UPGMA方法构建分子系统树。结果表明:白刺属植物的遗传分化程度和基因流因种
而异 ,除球果白刺以外 , 其余 3 种白刺的种群间有很大的基因流 ,其遗传一致度在 0.8561 ～ 0.9694 之间 , 而种间遗
传分化程度较低 ,故 4 种白刺有着相近的祖先 , 这与形态学和细胞学的分析结果一致 , 说明 RAPD分析方法可从分
子生物学角度为白刺属植物的系统学分类提供更为有利和可靠的证据。
关键词:白刺属;RAPD分析;亲缘关系;遗传变异
中图分类号:S793.9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7601(2007)01-0225-05
　　白刺属(Nitraria L .)植物属于蒺藜科(Zygo-
phyl laceae)的落叶灌木 ,耐盐旱生植物 ,多分布于亚
洲 、欧洲 、非洲和澳洲 。在我国主要分布于西北 、华
北和沿海地区[ 1 ,2] ,是内蒙古西部干旱 —半干旱荒
漠 、盐碱地和沙地等植被的主要建群种 ,在维持荒漠
生态系统平衡方面具有重要的作用[ 3] 。
20世纪 90年代发展起来的 RAPD 、RFLP 等技
术已经普遍应用在植物遗传资源的评价 、种间遗传
分化和居群生态学研究中 。许多研究者利用这些新
技术对诸多植物居群的遗传结构 、种间分化 、遗传变
异和生态因子偶合关系进行了深入研究和探讨 ,但
是关于白刺属植物遗传多样性 、种间分化的研究尚
未报道 。因此本文采用 RAPD 方法研究白刺属植
物的遗传分化 ,分析其种间关系 、种群遗传结构。旨
在从分子水平上解释白刺属植物的遗传进化 ,并为
白刺属植物的种源区划 、选育以及保护生物学等研
究提供分子水平的理论依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
本试验所需的白刺属植物材料均采自内蒙古自
治区境内的野生种 ,每个居群随机抽取 20个植株 ,
每个植株随机抽取嫩叶 4 ～ 5片 ,并置于 0 ～ 4℃的
环境下保鲜 ,迅速运往实验室 ,样品于-70℃低温冷
冻保存。供试材料的详细情况见表 1 。
1.2　试验方法
DNA提取采用 CTAB法[ 4]稍加修改 ,具体为:
取约 0.5 g叶片放入研钵内 ,加入液氮迅速研磨;把
研磨后的样品移至 7 ml的离心管中 ,加入 2 ml细
胞裂解液 ,65℃水浴 90 min ,期间充分混匀 3 次;加
入等量的氯仿/异戊醇(24∶1)混合液缓慢混匀 ,以
6 000转/min(低温 4℃)离心 10 min;取上清液加入
等量的-20℃异丙醇 ,轻轻倒置混匀后静置几分钟 ,
待出现絮状沉淀;回收絮状物后用 CTAB 回溶 ,重
复以上步骤两次;把絮状 DNA 回收后用 75%的乙
醇漂洗两次晾干;把提取的 DNA 溶于灭菌双蒸水
中 , 4℃下保存备用 。
RAPD-PCR参照李宽钰等(1997)的方法[ 5] ,
用 Biometro PCR仪进行扩增 。反应体系为 25 μL:
10×PCR Buffer 2.8 μL ,25μmol/L M gCl2 2.5 μL ,
25μmol/L dNTPs 0.25 μL ,1U Taq polymerase(上
海生工), 3.57 μmol/L 随机引物 1 μL , 20 ng 模板
DNA ,灭菌双蒸水定容到 25 μL ,之后加两滴石蜡
油。反应条件为:94℃预变性 5 min后 ,94℃变性 1
min ,42℃退火 1 min , 72℃延伸 2 min ,共 40个循
环 ,然后 72℃延伸 7 min 。扩增产物采用1.3%琼脂
糖(加拿大BBI 公司)凝胶在 0.5×TBE缓冲液中进
行电泳分离 ,GIS-2008凝胶显像仪下观察 、记录并
照相 。
在电泳图谱上同一个位点 ,有扩增条带出现计
为 1 ,无扩增带计为 0[ 6] ,作 0/1矩阵输入计算机 ,采
用 POPGEN32(加拿大 Ualberta 大学编写)进行遗
传参数分析和种间聚类分析 , 种间分化研究采用
UPGMA(非加权组成配对法 , Unweighted-pair-
g roup method using an arithmetic average)法建立系 统聚类分枝树状图 。
表 1　供试材料
Table 1　Materials used in this study
编号
Number
物种
Species
采集地
Localit y
生境
Habitat
居群数
Populations
1
小果白刺
N .sibir ica
乌拉特前旗、乌海 、巴彦浩特 、吉兰泰 、
巴彦诺日公 、磴口
Wulateqianvallage , Wuhai , Bayanhaote ,
Jilantai , Bayannuorigong , Dengkou
轻度盐渍化低地 、荒漠草原 、
荒漠地带
Light of degree salinize dow n
land , hungry grassland , barren
desert zone
3
2
白刺
N .ta ngutorum
磴口 、乌海 、巴彦浩特 、河屯池 、吉兰泰 、
巴彦诺日公
Dengkou , Wuhai , Bayanhaote , Het-
unchi , Jilantai , Bayannuorigong
荒漠草原 、荒漠地带
Hungry grassland ,
barren desert zone
2
3
球果白刺
N.sphaerocarpa
达赉库布 、居延海
Dalaikubu , Juyanhai
沙砾质戈壁
Grit qualit y gobi desert
3
4
大白刺
N .roborowskii
河屯池 、吉兰泰 、巴彦诺日公 、乌力吉 、
达赉库布
Hetunchi , Jilantai , Bayannuorigong ,
Wuliji , Dalaikubu
戈壁滩
Desert area
3
2　结果与分析
2.1　RAPD多态性分析
从 86个随机引物(上海生工公司合成)中选取
15个能获得清晰条带 ,反应稳定的引物 ,例如 S42
和S317的 RAPD扩增图谱(见图 1),共检测到 118
个位点。各引物扩增带数为 3 ～ 11 不等(见表 2)。
在检测的 4 个种群中 RAPD 标记片段表现出丰富
的基因多样性 ,植物种群间平均多态性比例达到
77.53%,平均每个引物扩增出 7.89个位点 。其中
球果白刺的多态性比例最高 ,达到 80.50%,大白刺
的多态性比例最低 ,为 74.57%。检测的结果表明:
除大白刺外 ,其它 3种的各种群内都检测出约 72个
位点 ,多态率都达到 70%以上 ,最高的是球果白刺
种群(采集于额济纳旗的达赉库布),多态性比例达
到 76.27%;大白刺种群内检测到的多态位点较少 ,
最多为 86个 ,占 72.88%(采于阿拉善右旗的河屯
池),最少为 38 个 ,占 32.2%(采于吉兰泰)。从 4
种白刺种群的多态位点分析可以看出白刺属植物的
种内 、种群内变异很广泛 ,这可能是干旱和养分等胁
迫以及荒漠异质环境下植物适应的遗传表现之
一[ 7～ 9] 。
图 1　S42和 S317 的 RAPD扩增图谱
Fig.1　RAPD patterns amplified respectively w ith the primers S42 and S317
226　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 25卷
表 2　引物及其序列和扩增结果
Table 2　List of fifteen primers , sequences , and amplification results
引物
Primers
序列
5′Sequence 3′
小果白刺
N.sibirica
白刺
N.tangutorum
球果白刺
N.sphaerocarpa
大白刺
N.roborowskii
OPD7 T TGGCACGGG 9/ 7 9/ 8 9/8 9/ 8
S3 CATCCCCCTG 7/ 7 7/ 7 7/6 7/ 7
S6 TGCGCCCTTC 5/ 4 5/ 3 5/4 5/ 4
S20 GGACCCT TAC 8/ 6 8/ 5 8/6 8/ 4
S24 AATCGGGCTG 9/ 7 9/ 7 9/7 9/ 7
S27 GAAACGGGTG 11/ 7 11/ 7 11/7 11/ 7
S37 GACCGCTTGT 8/ 6 8/ 6 8/6 8/ 6
S40 GT TGCGATCC 7/ 7 7/ 6 7/7 7/ 6
S42 GGACCCAACC 10/ 9 10/ 9 10/9 10/ 8
S79 GT TGCCAGCC 6/ 4 6/ 4 6/5 6/ 3
S267 C TGGACGTCA 7/ 5 7/ 3 7/5 7/ 5
S290 CAAACGTGGG 8/ 6 8/ 6 8/6 8/ 6
S307 GAGCGAGGCT 7/ 6 7/ 6 7/6 7/ 5
S317 GACACGGACC 9/ 7 9/ 6 9/7 9/ 6
S1299 CTCGATCACC 7/ 6 7/ 6 7/6 7/ 6
总和 Total 118/ 94 118/ 89 118/95 118/ 88
多态性比例＊Diversity 79.66% 75.42% 80.50% 74.57%
　　注:＊总扩增带数/多态性扩增带数。Note:＊ total amplification st rip/ polymorphic amplifi cation st rip.
2.2　遗传多样性分析
从琼脂糖凝胶电泳结果表明:白刺属植物
RAPD扩增产物的分子量较大 ,一般为 500 ～ 3 500
bp ,种群内平均每个位点的等位基因数都比较高 ,种
群间差异不大 ,只有分布在吉兰泰的大白刺种群内
平均每个位点的等位基因数比较低 ,详见表 3。
表 3　白刺属植物种群的 RAPD分析的遗传多样性
Table 3　RAPD polymorphism of species of Nitraria
供试材料
M aterials
多样性指数
Diversity index
na ne h I
小果白刺
N.sibirica
1 1.7288 1.5098 0.2872 0.4202
2 1.7203 1.4796 0.2767 0.4087
3 1.7373 1.4979 0.2830 0.4163
白刺
N .tang utorum
1 1.7373 1.5363 0.2990 0.4348
2 1.7203 1.5135 0.2862 0.4173
球果白刺
N.sphaerocarpa
1 1.7627 1.5460 0.3037 0.4419
2 1.7034 1.5393 0.2947 0.4253
3 1.7203 1.5402 0.2996 0.4340
大白刺
N.roborowskii
1 1.2542 1.2246 0.1190 0.1679
2 1.6356 1.4367 0.2490 0.3660
3 1.7288 1.4854 0.2757 0.4059
　　注:na:平均每个位点的等位基因数;ne:平均每一个位点有效
等位基因数;h:Nei s基因多样度;I:Shannon s信息指数。
Note:na:Observed number of alleles;ne:Ef fective number of alle-
les(Kimura and Crow ;1964);h:Nei s(1973)gene diversity;I:
Shannon s Information index (Lew ont in;1972).
本研究中采用 Nei s基因多样度和 Shannon s
信息指数估计白刺属植物种群内的遗传变异程度。
由表 4中可以看出小果白刺 、白刺和球果白刺的不
同种群内遗传变异水平差异不大 ,Nei s基因多样
度和 Shannon s信息指数分别为 0.2823 、0.2926 、
0.2951以及 0.4151 、0.4263 、0.4337;大白刺三个种
群内的遗传变异程度有明显的差异 ,Nei s基因多
样度和 Shannon s 信息指数分别为 0.1190 、
0.2490 、0.2757和 0.1679 、0.3660 、0.4059。4种白
刺属植物在不同物种与同一物种的不同种群之间 ,
Nei s基因多样度和 Shannon s信息指数有着相同
的变化趋势。
2.3　群体间遗传关系分析
白刺属植物不同地理种群之间遗传分化程度的
计算结果表明:不同地理种群的分化程度不同。用
遗传分化系数来评价遗传变异来源[ 10 ,11] ,其结果是
白刺的两个种群间分化程度最小 , 只占总变异的
8.71%,其次是小果白刺和球果白刺 ,在总变异中分
别占 10.07%和 15.36%,而种群间分化程度最明显
的是大白刺的三个种群 , 变异量占总变异的
28.94%。用遗传分化系数进一步计算基因流的结
果:白刺的两个种群间的基因流最大 ,其它白刺种群
的基因流大小依次为小果白刺 、球果白刺 、大叶白
刺。
227第 1期　　　　 　　　宛　涛等:内蒙古白刺属植物遗传多样性的 RAPD分析
不同种群的遗传度和遗传距离表明:4种白刺
属植物中 ,小果白刺三个种群的距离最近 ,大白刺三
个种群的距离最远。该结果再次说明大白刺种群之
间遗传分化比较明显[ 12 , 13] 。
2.4　种间遗传关系分析
不考虑划分的地理种群 ,根据种间多态位点对
白刺属植物进行种间分化分析 ,可得出以下结果:扩
增片段中种内共有片段数比较多 ,118个位点中可
找到 23个种内共有的位点 ,占总位点的 19.49%;
而特有片段数比较少。计算种间的遗传一致度 、遗
传距离及根据多态位点利用 UPGMA 方法构建分
子系统树的结果表明:小果白刺和白刺的遗传一致
度较近 ,球果白刺和大白刺的遗传一致度最远;小果
白刺和白刺的亲缘关系比较近 ,而大白刺和其它三
种白刺的亲缘关系比较远(详见表 5 、图 2)。由此可
看出供试的 4种白刺属植物是由共同祖先演化而
来 ,而且亲缘关系比较近[ 14～ 16] 。
表 4　白刺属植物种群的遗传分化比较
Table 4　Compare the heredity polarization of Nitraria
供试材料
Materials
总种群内基因多样性
Ht
种内基因多样性
Hs
遗传分化系数
Gst
基因流
Nm
小果白刺 N.sibir ica 0.3139(0.0365) 0.2823(0.0304) 0.1007 4.4666
白刺 N.tangu torum 0.3205(0.0398) 0.2926(0.0377) 0.0871 5.2405
球果白刺 N.sphaerocarpa 0.3487(0.0379) 0.2951(0.0327) 0.1536 2.7552
大白刺 N .roborowskii 0.3020(0.0387) 0.2146(0.0270) 0.2894 1.2277
表 5　白刺属植物的遗传一致度和遗传距离
Table 5　Heredity identical and distance of Nitraria
供试材料 Materials 小果白刺 N.sibirica 白刺 N.tangutorum 球果白刺 N .sphaerocarpa 大白刺 N .roborowskii
小果白刺 N.sibir ica ＊＊ 0.8690 0.8608 0.8315
白刺 N.tangu torum 0.1315 ＊＊ 0.8500 0.8369
球果白刺 N.sphaerocarpa 0.1400 0.1513 ＊＊＊ 0.8117
大白刺 N.roborowski i 0.1709 0.1652 0.1924 ＊＊＊
　　注:＊＊是遗传 Nei s相似系数 , ＊＊＊是遗传距离。Note:＊＊ is the Nei s heredi ty similar modulus , ＊＊＊ is heredity ident ical.
图 2　根据 Nei s 遗传距离构建的 4种白刺系统进化树
F ig.2　Construct system evolution tree of four Nitraria L.in base of Nei s heredity distance
注:POP1 、POP2 、 POP3和 POP4分别代表小果白刺 、白刺 、球果白刺和大白刺。
Note:POP1 、POP2 、 POP3 and POP4 respectively represent N .sibirica , N.tangu torum , N.sphaerocarpa and N.roborowskii.
3　讨　论
1)利用 15 个引物对 4 种白刺属植物进行
RAPD分析 ,检测到 118个位点 ,不仅反映出这 4种
白刺属植物的遗传背景复杂 、多样性丰富 ,还可计算
出种群内的遗传变异 、种群间的分化和种间的亲缘
关系。因此 ,RAPD技术是白刺属植物系统学研究
的有效补充手段 。
2)周泽扬等[ 18]的研究表明:在 RAPD研究中 ,
所分析的位点数多少 ,是关系到研究可行性和结果
可靠性的至关重要的问题。当位点数在 20以下时 ,
得到的遗传差异的结果极不可靠 ,随着位点数的增
加所提供的信息量及可靠性增加。当位点数超过
70个时 ,所提供的信息可靠性趋于稳定 。本研究得
到白刺属植物的位点数 118 个 ,因此本研究的结果
较为可靠 。
3)多态位点百分率是普遍采用的度量遗传变
异水平高低的指标[ 17] 。扩增的DNA片段出现频率
小于 0.99的位点为多态位点 ,检测到的位点中能反
映变异水平的最直接的指标 。从 4种白刺种群的多
228　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 25卷
态位点分析可以看出白刺属植物的种内 、种群内变
异很广泛 ,这与其他学者在毛乌素沙地的柠条 、羊
柴 、新疆典型荒漠区的梭梭和以色列进化谷的野大
麦等试验中获得的研究结果相似 ,都有相对较高的
多态比例现象 ,这可能是干旱和养分等胁迫及荒漠
异质环境下植物适应的遗传表现之一[ 7～ 9] 。
4)不同地理种群遗传多样性检测得出:白刺属
植物有很高的种群内遗传多样性 ,而种群间遗传分
化程度较低 ,有明显的基因流 。这种遗传结构特征
是白刺属植物在西部盐碱地和荒漠地区广泛分布的
遗传基础。大白刺 3 个种群之间有遗传分化现象 ,
这与生境恶化 、采样群体大小以及地理隔离有关系 ,
有待于进一步研究。
参 考 文 献:
[ 1] 　中国植物志编辑委员会.中国植物志[ M] .第四十三卷第一分
册.北京:科学出版社 , 1998.168.
[ 2] 　内蒙古植物志编辑委员会.内蒙古植物志[M ] .(第二版).第三
卷.呼和浩特:内蒙古人民出版社 , 1987.414—418.
[ 3] 　马全林.濒危植物绵刺光合的生理生态学特征[ J] .西北植物学
报 , 1999 , 19(6):165—170.
[ 4] 　马兵钢 ,牛建新.库尔勒香梨基因组 DNA 提取及 RAPD 体系
建立[ J] .新疆农业科学 , 2001 , 38(1):18—22.
[ 5] 　李宽钰 ,黄敏仁 ,王明庥.用 RAPD 探讨毛白杨起源[ J] .植物分
类学报 , 1997 , 35(1):24—31.
[ 6] 　周永红.用 RAPD 分子标记探讨鹅观草属的种间关系[ J] .植物
学报 , 1999 , 41(10):1076—1081.
[ 7] 　魏　伟 ,王洪新 ,胡志昂 ,等.毛乌素沙地柠条群体分子生态学
初步研究:RAPD证据[ J] .生态学报 , 1999 ,(1):16—22.
[ 8] 　葛颂 ,王可青 ,董　鸣.毛乌素沙地根茎灌木羊柴的遗传多样
性和克隆结构[ J] .植物学报 , 1999 , 41 ,(3):301—306.
[ 9] 　SHENG Yan , ZHENG Wei-hong , PEI Ke-quan.Population Ge-
netic St ructu re of a Dominant Desert Tree , Haloxylon ammoden-
dron(C henopodiaceae), in the S outheast Gurbantunggut Desert
Detected by RAPD and ISSR M arkers[ J] .Acta Botanica S inica ,
2004 , 46(6):675—681.
[ 10] 　El-Kassaby Y A.Genetie varitihin w ithin and among conifer
populat ions:review and evaluat ion of methods[ A] .Fineschi S ,
Malvolt i M E and Cannata F , et al.Biochemical Makers in the
Population Geneties of Forest Trees[ C] .The Nehelands:The
Hague , 1991.61—76.
[ 11] 　钟　敏 ,王洪新 ,胡志昂 ,等.干旱和湿润生境条件下辽东栎
群体的遗传结构及其适应意义的初步研究[ J] .植物学报 ,
1995 , 37:661—668.
[ 12] 　Nybom H , barti sh I v.Ef fects of life history t rait s and sampling
strategies on genetic diversity estimates obtained w ith RAPD
markers in plants[ J] .Perspectiues in Plaant Ecology , Euolution
and Systematics , 2000 ,(3):93—114.
[ 13] 　张爱兵 ,谭声江 ,陈建 , 等.空间分子生态学—分子生态学与
空间生态学相结合的新领域[ J] .生态学报 , 2002 , 25(5):
664—681.
[ 14] 　董英山,吕景良 ,江相智.东北地区栽培大豆品种资源分类探
讨[ J] .大豆科学 , 1998 , 17(4):311—317.
[ 15] 　孙立军 ,吕耀昌 ,孔繁玲 ,等.大麦高蛋白种质遗传稳定性分
析[ J] .大麦科学 , 2002 , 3:8—13.
[ 16] 　韩　路 ,贾志宽 ,韩清芳 ,等.苜蓿种质资源特性的灰色关联
度分析与评价[ J] .西北农林科技大学学报(自然科学版),
2003 , 31(3):59—64.
[ 17] 　姜　静,杨传平 ,刘桂丰.应用 RAPD技术对东北地区白桦种
源遗传变异研究[ J] .东北林业大学学报 , 2001 , 29(2):30—
34.
[ 18] 　周泽扬 ,夏庆友 ,鲁　成 ,等.分子系统学研究中分子位点数与
遗传差异信息可靠性的关系[ J] .遗传 ,1998, 20(5):12—15.
RAPD analysis on genetic diversity of nitavia in inner mongolia
WAN Tao
1 , CAI Ping2 , YI Wei-dong1 , ZHANG Xiao-ming3 , ZHANG Chen-bo1
(1.I nner Mongolia Agriulture University , Hohhot 010018 , China;
2.Xilinhaohe Animal Husbandry College , X ilinhaohe 026000 , China;3.Hulunbeier University , Hailaer 021008 , China)
　　Abstract:Four species of Nit raria were analyzed using random amplified polymorphic DNA(RAPD)mark-
ers.15 random primers amplified 118 loci have 95 polymo rphic loci , about 80.5%.The differentees of Nei s
gene diversity and Shannon s informat ion index between each primers produced is big.Dendrog ram was con-
st ructed using UPGMA.The result showed that the polarization of populations and gene fluxes are different in
different species.The polarization and gene fluxes of populat ions of 3 Nitavias are low er except N.sphaerocarpa
.The heredity coherence of each population is change f rom 0.8561 to 0.9694.The polarization in the popula-
tions is low , and they have the together ancestor.This is similar to morphology and cytology result , so RAPD is
a useful supple mentary method in assessing genetic relationship among Nit raria species.
Keywords:Nitraria L .;RAPD;relationship;genetic variation
229第 1期　　　　 　　　宛　涛等:内蒙古白刺属植物遗传多样性的 RAPD分析