全 文 ：基金项目:江苏省自然科学基金资助项目(BK2002201)
作者简介:毕志明 ,男 ,博士 ,副教授　　＊通讯作者:李萍 ,女 ,教授 ,博士生导师　　Tel:(025)85391244　　E-mail:liping2004@ 126.com
番荔枝属植物树皮中二萜类成分的 HPLC-ELSD分析
毕志明 1 ,蒯玉花 1 ,任美婷1 ,李萍 1＊ ,章永红 2(1.中国药科大学生药学教研室 ,南京 210038;2.南京中医药大学第一临床医学院 ,
南京 210002)
摘要:目的　建立一种 HPLC-ELSD分析方法 ,测定不同产地 、不同种番荔枝属植物树皮中 4种贝壳杉烷型二萜的含量。方法
　采用 AgilentZORBAX80AExtend-C
18
柱 , 0.3%冰醋酸溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱 [ 0 ～ 40 min, 60% ～ 0%(A);40% ～
100%(B)] ,流速 0.6 mL· min-1 , 蒸发光散射检测器(ELSD)。结果　4种贝壳杉烷型二萜与相邻杂质能较好分离 , 理论塔板
数按 16α-hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-oicacid(Ⅲ)计算不低于 49 000。贝壳杉烷型二萜成分以海南产圆滑番荔枝中含量最
高。结论　该方法精密度高 、分离效果好 ,分析准确 , 适合于该属植物中二萜类成分的含量测定;不同产地 、不同种植物中各成
分均存在一定的差别 。
关键词:HPLC-ELSD;番荔枝属;贝壳杉烷型二萜
中图分类号:R917　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2007)23-1827-03
DeterminationofEnt-KauraneDiterpenesinBarksfromGenusannonabyHPLC-ELSD
BIZhi-ming1 , KUAIYu-hua1 , RENMei-ting1 , LIPing1＊ , ZHANGYong-hong2(1.DepartmentofPharmacognosy, China
PharmaceuticalUniversity, Nanjing210038, China;2.FirstCollegeofClinicalMedicine, NanjingUniversityofTraditionalChineseMedi-
cine, Nanjing210002, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToestablishaHPLC-ELSDmethodfordeterminingthecontentsofent-kauranediterpenesinGenusan-
nonabarksfromdiferentlocationsorspecies.METHODS　TheseparationwasperformedonaAgilentZORBAX80AExtend-C18
columnwithagradientelution.Themobilephaseconsistedofaceticacidandacetonitrilwiththeflowrateat0.6mL· min-1 .Thede-
tectorwasELSD.RESULTS　Fourent-kauranediterpeneswereseparatedfromdopantwel.Thecontentofent-kauranediterpeneswas
highestinA.squamosaL.(hainan).CONCLUSION　ThemethodisaccurateandsuitableforquanlityofditerpenesinGenusan-
nona.Thereiscontentdifferenceamongdifferentlocationsorspecies.
KEYWORDS:HPLC-ELSD;Genusannona;ent-kauranediterpenes
　　番荔枝属植物全世界共约 120种 ,分布于美洲
热带地区 ,少数产于热带非洲 ,我国云南 、广东等地
有栽培 。药理研究[ 1-3]表明 ,其中的贝壳杉烷型二萜
类成分有较强的抗肿瘤活性 ,但对此类成分的定量
研究鲜有报道。本实验利用化学成分研究[ 4-5]所分
得的贝壳杉烷型二萜类成分作为对照品 ,对番荔枝
属不同产地 、不同种植物树皮进行了二萜类成分的
定量分析 ,为进一步的研究提供科学的参考依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器
Agilent1100系列高效液相色谱仪 ,蒸发光散射
检测器(Altech2000),空气压缩机(天津蓝珂科技
实业公司), HPChemstation色谱工作站 , Rheodyne
7725i手动进样阀 , BP211D十万分之一电子天平
(Sartorius)。
1.2　试药
二萜类成分对照品 16α-hydroxy-17-acetoxy-ent-
kauran-19-oicacid(Ⅲ )、 19-hydroxy-16β-ent-kauran-
17-oicacid(Ⅱ)、16α-hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-
oicacid(Ⅳ)、 16β, 17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic
acid(Ⅰ )(均从海南儋洲产圆滑番荔枝树皮中分离
得到 [ 4-5] ,结构经 TLC、NMR数据及文献比对确证
(图 1)。在本实验色谱条件下按面积归一化法测定
纯度 ≥98%)。乙腈(色谱纯), Milipore-Q超纯
水 ,冰醋酸(分析纯)。实验样品经鉴定核对 ,凭证
标本存放于中国药科大学生药学教研室 。
2　实验方法
2.1　色谱条件
·1827·中国药学杂志 2007年 12月第 42卷第 23期　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2007December, Vol.42No.23
图 1　4种贝壳杉烷型二萜类成分的结构式
Fig1　Structuresoffourent-kauranediterpenes
色谱柱:AgilentZORBAX80AExtend-C18柱
(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相:0.3%冰醋酸
(A)-乙腈(B), 梯度洗脱程序:0 ～ 40 min, 60% ～
0%(A);40% ～ 100%(B)。流速:0.6 mL· min-1;
柱温:36℃;ELSD参数:漂移管温度 104 ℃,载气流
速 2.8 L· min-1。进样量:10 μL。现论板数以
(Ⅲ)计不低于 49 000。
2.2　溶液的配制
2.2.1　对照品溶液的配制　分别精密称取 4种贝
壳杉烷型二萜对照品各 2 mg置 2 mL量瓶中 ,加甲
醇溶解并定容配制成 1.0 g· L-1的溶液 ,即为混合
对照品溶液 。
2.2.2　供试品溶液的制备　取药材约 2 g,精密称定 ,
加甲醇适量回流 3h,趁热滤过 ,滤液回收甲醇至干 ,残
渣加水适量使混悬 ,加乙酸乙酯振摇萃取 3次 ,合并乙
酸乙酯萃取液 ,回收至干 ,残渣用甲醇溶解并转移至 10
mL量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度定容。用 0.45μm的微
孔滤膜滤过 ,取续滤液作为供试品溶液。
3　结　果
3.1　ELSD检测条件的优化
漂移管温度和载气流速是 ELSD检测器中至关
重要的两个调节参数 ,由于所有样品中均含有 16α-
hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-oicacid,因此选取该
成分的 信噪比 (S/N)为 指标进 行考 察。在
ELSD2000 Control软件提供的推荐参数的基础上 ,
漂移管温度从 100 ～ 108 ℃、载气流速从 2.4 ～ 3.2
L· min-1进行变化 ,最后得出最佳检测条件为:漂移
管温度 104℃,载气流速 2.8L· min-1。
3.2　线性关系
分别精密吸取 “ 2.2.1”混合对照品溶液 ,加甲
醇分别配制成 0.75, 0.33, 0.14, 0.07 , 0.033, 0.015
g· L-1的梯度混合对照品溶液 。按 “ 2.1”色谱条件
进样 ,以峰面积的常用对数值对浓度的常用对数值
进行线性回归 ,得回归方程 ,见表 1。
3.3　精密度实验
表 1　4种贝壳杉烷型二萜类成分的标准曲线
Tab1　Calibrationcurvesforfourent-kauranediterpenes
Analyte Calibrationcurve r
Linearrange
×10-2 /g· L-1
LOD
/mg· L-1
LOQ
/mg· L-1
Ⅰ y=1.748 1ρ-1.257 7 0.999 6 1.67 ～ 33.3 10 16.7
Ⅱ y=1.644 4ρ-0.948 8 0.999 0 1.54 ～ 100 10 15.4
Ⅲ y=1.830 4ρ-1.336 2 0.999 5 2 ～ 16.7 10 15.4
Ⅳ y=1.802 5ρ-1.342 5 0.999 0 9.1 ～ 100 16.7 20
　　以中间浓度的混合对照品溶液连续进样 6次 ,计
算各色谱峰的峰面积(Pa)和保留时间(tR)的相对标准
偏差(RSD)来考察日内变异 ,其日内 PaRSD≤4%, tR
RSD≤0.2%;日间变异通过连续进样 3d,每天 2次测
定 ,日间 PaRSD≤5%, tRRSD≤0.2%。结果表明精密
度良好。
3.4　稳定性实验
取圆滑番荔枝树皮(海南),按 “2.2”项下操作
制备供试品溶液 ,于 0, 2, 8, 12, 24, 48 h分别测定 ,
计算各色谱峰峰面积 , RSD≤5%,结果表明供试品
溶液在 48 h内稳定。
3.5　方法重现性实验
取圆滑番荔枝树皮(海南),按 “2.2.2”项下操
作平行制备供试品溶液 5份 ,分别测定 ,计算各成分
的含量的平均值分别为 0.08%, 0.23%, 0.05%,
0.44%, RSD分别为 4.1%, 2.5%, 2.3%, 0.7%,表
明测定方法重现性良好 。
3.6　加样回收率实验
精密称取已知含量的圆滑番荔枝树皮 (海南
产)1g,分别加入适量对照品 ,按 “ 2.2.2”项下操作
平行制备供试品溶液 5份 ,用 0.45 μm的微孔滤膜
滤过 ,取续滤液 ,以 10 μL的进样量注入色谱仪 ,按
“2.1”色谱条件分别测定 ,记录各色谱峰峰面积 ,计
算回收率 ,测定结果见表 2。
3.7　样品含量的测定
按 “ 2”项下的有关方法测定不同产地 、不同种
番荔枝属植物中贝壳杉烷型二萜的含量 ,测定结果
见表 3 ,图 2。
4　讨　论
番荔枝属植物树皮中所含贝壳杉烷型二萜类成
分的紫外吸收均为末端吸收 ,使用紫外低波长检测
时 ,往往灵敏度低 。 ELSD作为近年发展起来的通
用质量型检测器 ,对二萜类化合物具有很好的响应 ,
检测灵敏度高 ,使得分析结果更加可靠。 ELSD检
测器中的漂移管温度和载气流速是两个至关重要的
调节参数 ,直接影响被分析物质的响应值。样品的
响应值一般会随着温度和流速的降低而升高 ,但同
·1828· ChinPharmJ, 2007December, Vol.42No.23　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2007年 12月第 42卷第 23期
　　表 2　圆滑番荔枝树皮中 4种贝壳杉烷型二萜类成分的回
收率
Tab2　Recoveryofthefourent-kauranediterpenesinthebarks
ofAnnonaglabra
Analyte Contained/mgAdded/mg Found/mgRecovery/% RSD/%
Ⅰ 0.78 0.85 1.61 100 4.5
0.78 0.87 1.69
0.78 0.93 1.70
0.78 0.90 1.72
0.78 0.88 1.61
Ⅱ 2.28 2.37 4.54 96.8 2.2
2.28 2.37 4.56
2.28 2.35 4.63
2.28 2.34 4.50
2.28 2.35 4.58
Ⅲ 0.5 0.54 1.00 96.0 3.3
0.5 0.50 0.98
0.5 0.52 0.99
0.5 0.51 1.00
0.5 0.50 1.00
Ⅳ 4.38 1.00 5.36 99.2 1.1
4.38 0.99 5.36
4.38 1.00 5.39
4.38 1.00 5.37
4.38 1.01 5.38
表 3　不同产地番荔枝属植物树皮中 4种贝壳杉烷型二萜
类成分的含量测定
Tab3　Contentsoffourent-kauranediterpenesinthebarksof
Annonafromdifferentlocations
Plant Location(Time) Conent/mg· g
-1
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
AnonaglabraL. Hannanzhanzhou(2005.9) 0.78 2.28 0.50 4.38
A.glabraL. Guangdongzhanjiang(2005.9) trace0.13 0.13 0.65
A.glabraL. Yuannanxishuangbanna(2005.10) trace0.09 0.13 0.48
A.squamosaL. Guangdongzhanjiang(2005.9) 0.23 0.21 0.27 trace
A.squamosaL. Yuannanxishuangbanna(2005.10) - 0.19 trace -
A.reticulataL. Guangdongzhanjiang(2005.9) - - - -
A.reticulataL. Yuannanxishuangbanna(2005.10) trace0.10 0.09 0.10
A.atemoyaHort. Guangdongzhanjiang(2005.9) tracetracetrace -
A.muricataL. Yuannanxishuangbanna(2005.10) - - - -
A.montanaMacf.Guangdongzhanjiang(2005.9) - - - -
A.montanaMacf.Yuannanxishuangbanna(2005.10) - - - -
注:“ -”未检测到
Note:“ -”notdetected
时噪音值也增高 ,因此要想达到理想的检测效果不
能单纯依靠降低温度和载气流速。本实验中以信噪
　　
图 2　对照品和样品色谱图
A-混合对照品;B-圆滑番荔枝(海南儋洲);1-16β, 17-dihydroxy-ent-kau-
ran-19-oicacid(Ⅰ );2-19-hydroxy-16β-ent-kauran-17-oicacid(Ⅱ);3-16α-
hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oicacid(Ⅲ );4 - 16α-hydro-19-acetoxy-
ent-kauran-17-oicacid(Ⅳ)
Fig2　RepresentativeHPLCchromatography
A-mixedreferencestandards;B-AnnonaglabraL.(Hainanzhanzhou);1-16β ,
17-dihydroxy-ent-kauran-19-oicacid(Ⅰ );2 -19-hydroxy-16β-ent-kauran-17-oic
acid(Ⅱ );3 -16α-hydroxy-17-acetoxy-ent-kauran-19-oicacid(Ⅲ );4-16α-
hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-oicacid(Ⅳ)
比优化参数 ,确定最佳检测条件为:漂移管温度 104
℃,载气流速 2.8 L·min-1。
从所测结果发现 ,不同种 、不同产地的番荔枝属
植物树皮中化学成分存在明显差异 ,圆滑番荔枝
(Annonaglabra)中二萜类成分含量明显高于其他
种。章永红等 [ 1-3]对圆滑番荔枝 、刺果番荔枝 、番荔
枝 、牛心番荔枝和毛叶番荔枝的抗癌药效学研究发
现 ,圆滑番荔枝有较强的抑制肿瘤活性 ,且发现其中
二萜类成分具有抗肿瘤活性 。本实验所测结果与活
性研究结果相一致 。
REFERENCES
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thebarkofAnnonaglabraLinn[J].ChemIndForestProd(林产
化学与工业), 2006, 26(2):13-15.
(收稿日期:2006-10-19)
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