全 文 ：收稿日期:2014-01-10
作者简介:易帆(1989-) ，男，在读硕士研究生，专业方向:药用植物亲缘学;E-mail:fantasyee91@ gmail. com。
* 通讯作者:彭勇，E-mail:ypeng@ implad. ac. cn。
15 种常见冬青属药用植物的分子鉴别
易 帆，韩凤鸣，彭 勇*
(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)
摘要 目的:建立 ITS区段的冬青属植物分子鉴别方法。方法:以 15 种冬青属植物为材料，采用离心柱型试剂
盒提取总 DNA，采用一对通用引物对 ITS区段进行 PCＲ扩增和测序;利用MEGA5. 0 软件分析，寻找差异位点，构建
系统发育树。结果:测序后得到 15 种冬青属植物 ITS比对序列为 759 bp，种间存在 216 个差异位点。结论:ITS 区
段可以用于鉴别冬青属植物。
关键词 冬青属;ITS;序列分析
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)06-0974-03
Molecular Identification of 15 Species of Ilex Genus Based on ITS Sequence Analysis
YI Fan，HAN Feng-ming，PENG Yong
(Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，
China)
Abstract Objective:To establish molecular method for identification of Ilex plants using the internal transcribed spacer(ITS)bar-
code. Methods:DNA was extracted using centrifugal columnar kits. The ITS sequences of all experimental samples were amplified and
sequenced using a pair of universal primers. The alignment and the phylogenetic tree were performed in MEGA5. 0. Ｒesults:The length
of ITS sequence in each species was 759 bp，in which there were 216 sites discrepancy. Conclusion:DNA barcoding technology based on
ITS sequence can be used to identify plants of Ilex genus.
Key words Ilex genus;ITS;Sequence analysis
冬青属是冬青科 4 个属中我国仅有的一个属，
约有 200 余种，分布于秦岭以南及长江流域以南各
省区，而以西南及华南的种类最为丰富，浙江、广东、
广西等省为冬青属植物集中分布区〔1〕，其中 43 种及
变种可供药用〔2〕。近年还有冬青属的新种被发现。
研究表明，大部分冬青属的植物都具有治疗心血管
疾病、降血脂、降血压、抗肿瘤、抗生育、抗氧化、抗炎
抗菌及对肾脏的药理作用〔3〕。然而，冬青属近缘植
物形态相似，同时广泛存在杂交的现象，因此难以根
据形态学或显微特征对其进行准确的鉴定。为了获
得该属植物准确的系统分类及保证该属药用植物的
种质，急需建立可靠的鉴别方法。
随着分子生物学技术的迅猛发展，DNA 分子标
记在药用植物鉴定方面的应用已取得许多进展〔4-7〕。
ITS序列是位于 rDNA中，介于 18S和 26S 之间的非
编码转录间隔区。由于其所受选择压力小，保守性
适中，DNA碱基替换速率较快，从而具备核酸序列
的高度变异性及长度保守性。ITS 序列表现出的变
异水平比较适合于属间、属下和种间等分类单元的
系统学研究，使其成为植物系统与进化研究中的重
要分子标记。
本研究利用 ITS 序列对国内 15 种冬青属植物
进行序列比较分析，探讨冬青属植物种间的遗传变
异情况及其亲缘关系，为该属系统学研究提供资料。
1 材料与方法
1. 1 材料 用于本实验研究的冬青属植物样本共
15 份，采集于湖南省张家界、贵州云台山及重庆南
川等地，由笔者彭勇教授鉴定，凭证标本保存于中国
医学科学院药用植物研究所标本馆。样品信息见表
1。
1. 2 试剂 提取植物基因组 DNA 用十六烷基三
甲基溴化铵(CTAB)、β-巯基乙醇购自 SIGMA公司，
植物基因组 DNA 提取试剂盒购自北京天根生化科
技有限公司。琼脂糖(A-garose)购自 Gene 公司。
TaqDNA聚合酶、dNTPs、超纯水等购自上海生工生
物技术和服务公司;引物由北京奥科生物技术有限
公司合成;其他试剂均为国产分析纯。Marker:
GeneＲuler Express DNA Ladder(MBI Fermentas 公
司)。
1. 3 仪器 Gel Doc 2000 凝胶成像系统(美国
BIO-ＲAD 公司) ，PTC-200 PCＲ 仪(美国 BIO-ＲAD
公司) ;TGear微型离心机(北京天根生化科技有限
·479· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 6 期 2014 年 6 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.06.026
表 1 冬青属植物样品信息
样品编号 中文名 拉丁学名 采集地 登录号
1 榕叶冬青 Ilex ficoidea Hemsl. 湖南张家界黄石寨 KF113863
2 硬毛冬青 Ilex hirsuta C. J. Tseng ex S. K. Chen et Y. X. Feng 湖南湘西羊峰山 KF113864
3 海南冬青 Ilex hainanensis Merr. 湖南吉首德夯 KF113865
4 五棱苦丁茶 Ilex pentagona S. K. Chen，Y. X. Feng et C. F. Liang 贵州云台山 KF113866
5 华中枸骨 Ilex centrochinensis S. Y. Hu 湖北宣恩 KF113867
6 大果冬青 Ilex macrocarpa Oliv. 湖南湘西羊峰山 KF113868
7 毛冬青 Ilex pubescens Hook. et Arn. 湖南湘西羊峰山 KF113869
8 猫儿刺 Ilex pernyi Franch. 湖南湘西羊峰山 KF113870
9 溪畔冬青 Ilex lihuaensis T. Ｒ. Dudley 湖南湘西谷苗河 KF113871
10 刺叶珊瑚冬青 Ilex corallina Franch. var. aberrans Hand. -Mazz. 湖南湘西羊峰山 KF113872
11 冬青 Ilex chinensis Sims 湖南湘西羊峰山 KF113873
12 革叶冬青 Ilex cochinchinensis(Lour.)Loes. 湖南湘西羊峰山 KF113874
13 南川冬青 Ilex nanchuanensis Z. M. Tan 重庆南川 KF113875
14 珊瑚冬青 Ilex corallina Franch. 重庆南川 KF113876
15 阔叶冬青 Ilex latifrons Chun 重庆南川 KF113877
公司) ;DK-8D 型电热恒温水槽(上海医用恒温设备
厂) ;DYY-7 型电泳槽、DYY-12 型电源(北京六一仪
器厂)。
1. 4 方法
1. 4. 1 样品处理:取采集的 15 种冬青属植物新鲜
叶片用硅胶进行干燥后，保存于 － 70 ℃超低温冰箱
备用。
1. 4. 2 DNA提取、PCＲ扩增和测序:选取干燥后的
冬青属植物叶片每份约 10 mg，采用植物基因组
DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提
取总 DNA。设计冬青属 ITS 序列的引物对(ITS4:
TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS5:GGAAGTAAAA-
GTCCTAACAAGG)由北京奥科生物技术有限公司
合成。PCＲ 反应体系总体积 50 μL，其中包含上下
游引物和 dNTP 各 1 μL(2. 5 mmol /L) ，MgCl2 4 μL
(25 mmol /L) ，PCＲ buffer 5 μL(10 ×) ，0. 6 μL Ex
Taq，总 DNA 4 μL，用 ddH2O 补足体积。扩增程序
为:94 ℃，变性 4 min;94 ℃ 变性 50 s，55 ℃退火 50
s，72 ℃延伸 60 s，35 个循环;72 ℃延伸 10 min，产物
置 4 ℃保存。其余各序列的 PCＲ 反应条件、通用引
物及扩增程序参考文献〔7，8〕。PCＲ 扩增产物为核糖
体 DNA的 ITS片段(包括 ITS1、5. 8SrDNA 和 ITS2)
经纯化后，送北京生工生物技术和服务公司进行上
下游引物双向测序。
1. 4. 3 数据处理:测序后所得结果采用 Codon
Code Aligner 3. 71 软件校对拼接，除去引物区间及
低质量序列，利用 ClustalⅩ V2. 01 进行多序列比
对，寻找碱基差异位点后，进行 BLASTN(Nucleotide
BLAST)比对，确定所获序列。用 MEGA5. 0 软件中
邻接法(neighbour-2-joining method，NJ)构建系统发
育树，bootstrap(重复 1 000 次)检验各分支支持率。
计算基于 Kimura-2-Parameter(K2P)双参数模型。
2 结果与分析
2. 1 DNA提取 由图 1 可知，DNA 样品在凝胶电
泳上都得到了清楚的条带，无大程度降解，可供后续
实验。
图 1 15 种冬青属植物 PCＲ扩增电泳图
1 ～ 15. 1 ～ 15 号样品 M. Maker
2. 2 ITS 区 PCＲ 扩增与序列注释 对 ITS 区的
PCＲ 扩增获得了 759 bp 的片段。对各样品的 PCＲ
产物测序结果进行序列拼接，向 GenBank 提交了序
列，获得相应的序列登录号(见表 1)。HMMer 注释
法分别得到冬青属 15 种常见植物以“TTGTCG”为
始端和以“GCGAGC”为末端约 600 bp 的 ITS 区序
列全长。
2. 3 多重比对及系统发育树构建 15 种冬青属植
物的 ITS序列多重对比后的序列长度为 759 bp，其
中差异位点 216 个。种间最小遗传距离存在于溪畔
冬青和珊瑚冬青，为 0. 0044;各物种可相互区别。
有研究表明，G + C 含量是一个比较原始的特征，它
与 DNA分子结构的稳定性有关，G + C含量越高，分
·579·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 6 期 2014 年 6 月
子结构越稳定。根据 MEGA5. 0 所测出各样品 G +
C含量介于 45. 59% ～54. 02%，最低值为猫儿刺，最
高值为毛冬青。
根据 ITS序列，构建系统发育邻接(NJ)树(图
2) ，各物种得到了清楚的鉴别。利用青荚叶 Hel-
wingia japonica (Thunb. )Dietr. 确定 15 种冬青属植
物进化程度。结果显示，革叶冬青、海南冬青、华中
枸骨、阔叶冬青、五棱苦丁茶、猫儿刺、冬青及珊瑚冬
青聚为一类，而毛冬青、溪畔冬青、刺叶珊瑚冬青、硬
毛冬青、南川冬青、榕叶冬青及大果冬青聚为另一大
类，与传统分类学一致。
图 2 基于 ITS序列的 15 种冬青属植物的邻接(NJ)树
3 讨论
冬青属植物作为中国药典所记载的常用药材原
植物，应用广泛，具有重要的药用价值。在前期实验
中，笔者选取了 ITS、ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH等
序列作为候选鉴别，通过比较候选序列的 PCＲ扩增
效率、测序成功率和序列获得率，发现 psbA-trnH 序
列扩增效率最高，ITS次之，ITS2 最低。而测序成功
率及鉴别率 ITS 最高，故将其作为最佳研究条带进
行后续数据分析。
近年来，ITS 序列分析已经广泛地应用于解决
科内不同等级的系统发育和分类问题〔8，9〕，但在不
同的植物类群及不同分类等级上，ITS 序列的价值
有所不同〔10，11〕。有实验表明，在沙参属种信息位点
只有 3. 9%〔11〕，苋属植物中只有 5. 4%〔12〕，而从本
实验中冬青属植物获得的信息位点达到了 9. 6%，
能够清楚地将冬青属这 15 种植物分辨出来，因此该
属的 ITS序列在探讨冬青属内组的划分、种间关系
及各性状在该属中分类作用方面具有较高的参考价
值。
大果冬青与榕叶冬青在叶片形态及果实形状上
十分相似，叶革质，卵形或卵状椭圆形。用传统的形
态学方法难以区分，但根据构建的系统发育树能够
清楚的辨别出这两种植物。
实验结果表明，15 种冬青属植物 ITS 序列区段
有较多的差异位点，说明该序列分析可用于冬青属
植物的鉴定，作为系统学分析的参考工具，同时该方
法也可为来源于同属植物的药材鉴别提供参考。
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