全 文 ：《食品工业》2015 年第36卷第 2 期 108
响应面法优化 杨梅叶中黄酮提取工艺的研究
李尚谦，张斌，郭辉，钱俊青*
浙江工业大学药学院（杭州 310014）
摘 要 杨梅叶中的黄酮类活性成分具有抑制血小板聚集、调血脂、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等作用。使用乙醇浸
体法提取杨梅叶中的黄酮类活性成分, 并采用响应面法优化提取工艺条件。最终得到最佳提取条件为料液比1∶64
(g/mL), 提取温度52.5 ℃, 乙醇体积分数为64%, 提取时间为4.5 h, 杨梅黄酮提取率达到4.01 mg/g。
关键词 杨梅; 黄酮; 提取; 响应面
Extracting Total Flavonoids from Myrica rubra Leaves Determined by Using
Response Surface Methodology
Li Shang-qian, Zhang Bin, Guo Hui, Qian Jun-qing*
College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology (Hangzhou 310014)
Abstract To de termine the proper factor for extracting total fl avonoids from Myrica rubra leaves, several factors, such as the
temperature, concentration of extraction solvent, time, and the solid/liquid ratios, were investigated and the optimal conditions
were obtained from the experiments with response surface methodology. The optimum condition for extracting total fl avonoids
was in 64% ethanol at 52.5 ℃ for 4.5 h and the solid/liquid ratios was 1∶64 (g/mL). The extraction percentage of fl avonoids
was 4.01 mg/g with the described conditions.
Keywords Myrica rubra; fl avonoids; extract; orthogonal experiments
杨梅（Myrica rubra）属杨梅科杨梅属果树，多
年生绿性乔木，现在长江流域以南均有栽培，主产浙
江、福建、江苏、江西、湖南及广东省[1]。目前以杨
梅为材料的研究主要集中在杨梅果的保鲜、杨梅产品
的开发以及杨梅中花色苷的组分鉴定、色泽稳定性以
及抗氧化性等方面。在传统医学中，杨梅被用于治疗
各种胃肠道疾病，如腹泻、肠胃炎等[2]。杨梅树皮味
苦、性温，而杨梅树皮、叶具有散淤止血、止痛之功
效，民间用于治疗跌打损伤、骨折、痢疾、胃和十二
指肠溃疡、牙痛等[3]。杨梅叶中含有杨梅素、槲皮素
等多种黄酮类化合物，具有降血糖、酪氨酸酶抑制、
血小板活化因子拮抗、肝脏保护，抗氧化等作用[4-8]。
美国FDA已允许将杨梅素应用于医药、食品、保健品
和化妆品。
鉴于杨梅树叶在资源上具有明显的优势，因此充
分开发利用杨梅叶中的杨梅黄酮类成分具有十分重要
的现实意义。为了利用杨梅叶中黄酮类成分物质，详
细研究了乙醇浸提杨梅叶中黄酮类化合物的提取工艺
条件，并运用响应面法对提取工艺进行了优化，为杨
梅叶的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料：采自浙江省杭州市小和山的杨梅（M.
rubra）叶子阴干后，粉碎备用。
试剂：乙醇，Ca(OH)2，Al(NO3)3，NaNO2，盐酸
均为分析纯。
1.2 试验仪器与设备
HH-4 数显恒温水浴锅：金坛市江南仪器厂；
N-1000 旋转蒸发仪：TOKYO KIKAKIKAI CO. LTD.；
DHG-9143BS-Ⅲ 电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医
疗器械制造有限公司；725 型紫外可见分光光度计：
上海光谱仪器有限公司；JJ500 型精密电子天平：常
熟双杰测试仪器厂；CL-100 双层铁皮电炉：浙江嘉
兴市凤桥电热器厂。
1.3 标准曲线的绘制
精密称取4.3 g杨梅素标准品置于25 mL容量瓶
中，加10%乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得质
量浓度为172 μg/mL的标准溶液。精密吸取标准溶液
0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL分别置于10 mL
容量瓶中，加0.3 mL 5% NaNO2混合后静置6 min，加
入0.3 mL 10% Al(NO3)3，混合后静置6 min，加入4 mL
1 mol/L的NaOH溶液，加入0.4 mol 30%的乙醇静置10
min后。以0.0 mL为空白，分别在510 nm处测定吸光
度，以吸光度（A）对质量浓度（C，μg/mL）进行线
性回归，得回归方程C=209.29A-1.223，R2=0.999 8。
线性范围为8.6~51.6 μg/mL。
1.4 杨梅叶黄酮提取率的测定
*通讯作者；基金项目：浙江省创新团队项目（2010R50032）
工艺技术
《食品工业》2015 年第36卷第 2 期 109
准确称取2.0 g杨梅叶粉末于250 mL三角烧瓶中，
按要求加入一定量的提取剂，在一定温度下浸泡一定
时间后，趁热减压抽滤，加水定容于100 mL容量瓶
中，作为待测液。待测液0.5 mL于10 mL容量瓶中，测
定其在510 nm处测定吸光度（A）。根据标准曲线计
算出相关浓度以及提取出黄酮量，并计算出黄酮的提
取率，计算方式如式（1）。
黄酮类化合物提取率=黄酮类化合物质量（mg）/
干物料质量（g） （1）
2 结果与分析
2.1 水提法
2.1.1 碱水浴法
分别取2.00 g样品5份，分别加水100 mL，用
NaOH水溶液分别调pH至5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，在
50 ℃下恒温水浴4 h，以盐酸水溶液调pH至4.0，抽
滤，定容，测其A，得黄酮类化合物提取率与pH的关
系（图1）。
图1 碱水浴法中pH对提取率的影响
2.1.2 沸水法
取样品2.0 g，加水100 mL，浸泡30 min，煮沸60
min，煎煮3次，过滤，合并滤液，定容，测其吸光度
求得提取率为2.0 mg/g。
2.2 乙醇浸提法
在2.00 g样品中，加入100 mL 80%的乙醇，50 ℃
下恒温水浴4 h，抽滤，定容，测其吸光度求得提取率
为3.15 mg/g。
由以上结果可看出乙醇浸提法与另两个方法相比
有较大优势，所以选用乙醇浸提法为试验的提取
方法。
2.3 乙醇浸提杨梅叶黄酮的结果与分析
2.3.1 料液比对提取的影响
在2.00 g样品中，分别加入40，80，120和160 mL
40%的乙醇，50 ℃下恒温水浴2 h，抽滤，定容，测
其A，得黄酮类提取率与料液比的关系（图2）。由
图2可以看出，提取率在料液比为1︰20~1︰60（g/
mL）时。随料液比增大提取率较快增大，但当料液
比大于1︰60（g/mL）后，提取率增加不大。从提取
效果，减少溶剂用量和降低浓缩负荷等综合考虑，
用量不宜过大，故将料液比定在1︰60（g/mL）左右
较合适。
图2 料液比对提取率的影响
2.3.2 时间对提取的影响
取2.00 g样品7份，分别加入60%乙醇100 mL，在
50 ℃下分别恒温水浴2，3，4，5，6，12和24 h，抽
滤，定容，测其A，得黄酮类提取率与提取时间的关
系（图3）。由图3可以看出，在2~4 h随提取时间的延
长提取率较快增大，4~6 h时提取率趋于平缓。这可能
是由于浸提4 h左右黄酮类化合物在乙醇溶液中的基本
溶出，达到溶出平衡状态，再延长时间意义不大。综
合各方面考虑，提取时间以4 h左右为宜。
图3 提取时间对提取率的影响
2.3.3 乙醇体积分数对提取的影响
在2.00 g样品中，分别加入100 mL不同体积分数
的乙醇，60 ℃下恒温水浴4 h，抽滤，定容，测其A，
得黄酮类提取率与乙醇体积分数的关系（图4）。由
图4可以看出，乙醇的提取效果以60%体积分数为最
好。乙醇体积分数高于60%，随乙醇体积分数增加提
取率下降。试验中发现，随乙醇体积分数的提高，叶
绿素等物质的溶出也增加，从而影响了黄酮类物质的
溶出，并给纯化带来较大的麻烦。结合图3，确定提
取剂乙醇体积分数在60%左右为宜。
图4 乙醇体积分数对提取率的影响
2.3.4 温度对提取的影响
图5 温度对提取率的影响
工艺技术
《食品工业》2015 年第36卷第 2 期 110
取2.00 g样品5份，分别加入40%乙醇100 mL，分
别在30 ℃，40 ℃，45 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃和65
℃下恒温水浴4 h，抽滤，定容，测得黄酮类提取率与
温度的关系（图5）。由图5可以看出，在30 ℃~60 ℃
随提取温度的升高提取率较快增大，特别是45 ℃~60
℃。60 ℃后提取率趋于平缓。这可能是由于黄酮类化
合物在乙醇溶液中的溶解度随着温度的升高而增大，
同时由于温度升高提取液黏度减少，扩散系数增加，
促使提取速度加快，但温度过高，一方面其中的活性
成分易被破坏，杂质的溶出量增加，给后续的操作带
来不便，成本费用增大，另一方面造成溶剂损失。综
合各方面考虑，提取温度以60 ℃左右为宜。
2.3.5 响应面优化试验
通过单因素考察，筛选出来影响较大的3个因
素：料液比，提取温度和乙醇体积分数，以黄酮提取
率为考察指标，应用Design Expert（7.1）软件对试验
结果进行统计分析，中心复合设计（Central Composite
Design，CCD）结合响应面方法（Response Surface
Methodology，RSM），每个显著影响变量以5个水平
（-1.682，-1，0，+1，+1.682）对结果进行数模分析
并优化，各因素水平取值设置见表1，试验设计及结
果见表2。
表1 响应面分析因子及水平表
因素 水平-1.68 -1 0 1 1.68
料液比 /(g·mL-1) 1 ∶ 43 1 ∶ 50 1 ∶ 60 1 ∶ 70 1 ∶ 77
提取温度 /℃ 33 40 50 60 67
乙醇体积分数 /% 43 50 60 70 77
表2 响应面分析方案及试验结果
试验号 因素 提取率 /mg·g-1料液比 提取温度 乙醇体积分数
1 1.68 0 0 3.72
2 0 -1.68 0 3.31
3 -1 1 1 3.37
4 0 0 0 3.96
5 -1 -1 -1 3.21
6 -1 -1 1 3.35
7 1 -1 1 3.49
8 0 1.68 0 3.51
9 -1.68 0 0 3.31
10 -1 1 -1 3.37
11 0 0 -1.68 3.53
12 0 0 0 3.95
13 0 0 0 3.98
14 1 -1 -1 3.33
15 0 0 1.68 3.81
16 1 1 -1 3.56
17 0 0 0 3.91
18 0 0 0 4.03
19 1 1 1 3.87
20 0 0 0 4.02
利用Design-Expert软件对表2的试验数据进行二
次多项回归拟合，获得回归方程为：Y=3.98+0.12A+
0.082B+0.079C+0.054AB+0.041AC-0.001 25BC-
0.18A2-0.21B2-0.12C2。
式中：Y-提取率预测响应值；A-料液比的编码
值；B-提取温度的编码值；C-乙醇体积分数的编码
值。回归模型的方差分析见表3。
表3中，“Prob＞F”＜0.05表明模型影响显著，
“Prob＞F”＜0.01表明影响极显著。由方差分析可
得，该模型“Prob＞F”=0.000 1，说明此模型差异
极为显著，可接受；失拟项“Prob>F”=0.147 5＞
0.05，失拟项不显著，说明模型在整个回归区域的
拟合度很好，接近真实的响应曲面情况，模型建立
合理；CV（变异系数）表示模型的精确度，CV值
越高，模型可信度越低，试验模型中CV=1.70%，较
低，说明模型精确度高，试验可信。模型的决定系数
R2=97.57%，矫正系数Adj R2=95.38%，表明预测值与
实际值之间具有高度相关性，故可以利用此模型对提
取率进行预测。
表3回归方程各项的方差分析表明，一次项和二
次项对响应值的影响均为极显著；交互项中AB为显
著影响项；说明各因素主效应显著，因素间的相互作
用也较大。
表3 响应面二次项模型方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F
模型 1.52 9 0.17 44.55 <0.000 1
A 0.20 1 0.20 51.98 <0.000 1
B 0.093 1 0.093 24.53 0.000 6
C 0.086 1 0.086 22.59 0.000 8
AB 0.023 1 0.023 6.10 0.033 1
AC 0.014 1 0.014 3.59 0.087 2
BC 1.25E-005 1 1.250E-005 3.301E-003 0.955 3
A2 0.44 1 0.44 117.24 <0.000 1
B2 0.65 1 0.65 172.08 <0.000 1
C2 0.21 1 0.21 55.46 <0.000 1
残差 0.038 10 3.787E-003
失拟项 0.028 5 5.543E-003 2.73 0.147 2
纯误差 0.010 5 2.030E-003
总和 1.56 19
R2=97.57% Adj R2=95.38% CV=1.70%
2.3.6 曲面图与等高值线图的分析
为了进一步探究A（料液比），B（提取温
度），C（乙醇体积分数）的交互作用对响应值（Y）
的影响，采用Design-Expert软件绘制了等高线图以及
对应的三维响应曲面图（见图6~图8）。响应图可以
直接反应各因子对响应值影响的大小，由等高线图
得到最优条件下各因子的取值。图6表示乙醇体积分
数为60%，提取时间为4.5 h情况下，料液比与提取温
度之间的交互作用响应面图，图7表示提取温度为50
℃，提取时间为4.5 h情况下，料液比与乙醇体积分数
工艺技术
《食品工业》2015 年第36卷第 2 期 111
之间的交互作用响应面图。图8表示料液比为1︰60
（g/mL），提取时间为4.5 h情况下，乙醇体积分数与
提取温度之间的交互作用。

图6 料液比与提取温度交互作用等高线图及相应响
应面图

图7 料液比与乙醇体积分数交互作用等高线图及
相应响应面图

图8 提取温度与乙醇体积分数交互作用等高线图及
相应响应面图
椭圆和线间疏密程度可反映出两变量交互作用的
大小。椭圆形和线间距离较密，则表示交互作用大，
椭圆形和线间距离较疏，则表示交互作用小；同理，
响应曲面倾斜度大说明交互作用大，反之则小。由图
结合之前p值分析可得，两两因素间对响应值（Y）
均有一定的交互作用，其中A（料液比）B（提取温
度）的交互作用较为显著。
通过对回归方程进行求导，可得极值点坐标
A=64.28，B=52.49，C=64.03，此时模型取得最优解
为Y=4.03 mg/g，为了验证模型预测的准确性进行3次
验证试验，分别选择料液比为1︰64（g/mL），提取
温度为52.5 ℃，乙醇体积分数为64%，所得实际提取
率为4.01 mg/g。优化培养基的实际试验值与模型预测
值4.03 mg/g非常接近。回归分析和验证试验结果表明,
此方法合理可行。理论值和预测值之间非常接近，在
误差允许的范围内。
3 结论
通过对杨梅叶总黄酮的不同提取方法的研究和
响应面法优化得到，乙醇浸提最佳工艺条件为：料
液比1︰64（g/mL），提取温度52.5 ℃，乙醇体积分
数为64%，提取时间为4.5 h，在此条件下理论提取率
为4.03 mg/g，与该条件下实际测量值4.01 mg/g基本相
符，说明试验的模型拟合程度较高，准确有效，可用
于杨梅叶中总黄酮提取工艺的优化筛选。
参考文献：
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究[J]. 食品科学, 2004, 25(08): 80-83.
工艺技术
信 息
据报道，由于鳄梨具有高热量、高脂肪，因此一直
不被视为健康水果。然而近期科学家发现，它拥有降低低
密度脂蛋白（坏胆固醇）的能力，对于患有心血管、糖尿
病及肥胖人士具有保护作用。美国宾州大学开展了相关实
验，研究发现，鳄梨对降低坏胆固醇有显着效果。
宾州大学的营养学家柯瑟顿（Penny M. Kris-Etherton）
博士说，这些食谱通常是在实验室对食品的严密控制下进
行才有这些结论，是概念性的验证。我们需要把重点放在
让人们吃有利于心脏健康的饮食，包括鳄梨和其他拥有好
脂肪的食物。据柯瑟顿博士的研究，鳄梨抑制坏胆固醇的
效果比其它的油脂类食物更好。
食品伙伴网 2015-01-15
美国研究：鳄梨可降低坏胆固醇含量