全 文 ：第 47 卷 第 3 期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vol． 47 No． 3
2013年 6 月 Journal of Henan Agricultural University Jun． 2013
收稿日期:2013 － 01 － 03
基金项目:国家科技支撑计划专题(2013BAD01B06) ;郑州市科技领军人才计划(10LRC177)
作者简介:卢妍妍，1986 年生，女，山东聊城人，硕士研究生，主要从事林木遗传育种方向研究．
通讯作者:茹广欣，1963 年生，男，河南洛阳人，教授，博士．
文章编号:1000 － 2340(2013)03 － 0272 － 06
泡桐属植物 ISSR-PCR反应体系的优化
卢妍妍，李海英1，2，茹广欣1，林彩丽3，陈志涛1，杨 阳1
( 1．河南农业大学林学院，河南 郑州 450002; 2．华北水利水电学院，河南 郑州 450002;
3．中国林业科学研究院森林生态环境和保护研究所，北京 100091)
摘要:为建立和优化泡桐属植物高效、稳定的 ISSR-PCR反应体系，本试验采用了 5 因素 4 水平的正交试验以及
单因素梯度优化相结合的方法，筛选出了泡桐属植物最适的 ISSR-PCR 反应体系，即 20 μL 体系中含 buffer 2． 5
μL，Taq酶 2． 0 U ，Mg2 + 3． 75 mmol·L －1，0． 4 mmol·L －1 dNTPs，引物 0． 35 mmol·L －1，模板 40 ng．扩增程序为:
94 ℃预变性 5 min，然后 94 ℃变性 30 s，55 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 90 s，40个循环，72 ℃延伸 7 min，最后 4 ℃保
温．
关键词:泡桐属植物;正交试验;单因素; ISSR体系优化
中图分类号:S 792． 43 文献标志码:A
Establishment and optimization of ISSR-PCR
reaction system of the genus Paulownia plants
LU Yan-yan1，LI Hai-ying1，2，RU Guang-xin1，LIN Cai-li3，CHEN Zhi-tao1，YANG yang1
(1． College of Forestry，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China;2． North China institute
of Water Conservancy，Zhengzhou 450002，China;3． Research Institute of Forest Ecology，Environment
and Protection，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China)
Abstract:To establish and optimize the efficient and stable ISSR-PCR reaction system for the genus
Paulownia plants，this study adopted the five-factor and four-level orthogonal design and single-factor
gradient optimization method to establish and screen the plants of the genus Paulownia optimal ISSR-
PCR system，in 20 μL reaction solution，containing 2． 5 μL buffer，2． 0 U Taq-polymerase，3． 75 mmol·
L －1 of Mg2 +，0． 4 mmol·L －1 of dNTPs，0． 35 mmol·L －1 of primers，and 40 ng of template DNA． Am-
plification program was devised:initial denaturating at 94 ℃ for 5 min，denaturing at 94 ℃ for 30 s，
annealing at 55 ℃ for 45 s，and extension at 72 ℃ for 90 s，40 cycles;ending with a final extension at
72 ℃ for 7 min，then stored at 4 ℃ ．
Key words:Paulownia;orthogonal design;single factor;ISSR system establishment and optimization
简单重复序列中间区域简称 ISSR，是ZIETKIEWICZ
等［1］根据 SSR 的特点于 1994 年提出并发展起来
的一种新型的分子标记技术，用于检测 2 个 SSR
之间一段短 DNA 序列上的多态性．该技术采用的
是单一引物，无需预先知道基因组序列信息，因此
检测迅速且成本低．与其他分子标记相比，ISSR具
有操作简便、模板用量少、所得结果可重复性高等
优点，被认为是一种集 RAPD 与 SSR 标记技术优
DOI:10.16445/j.cnki.1000-2340.2013.03.024
第 3 期 卢妍妍等:泡桐属植物 ISSR-PCR反应体系的优化 273
点于一体的理想分子标记技术［2，3］．目前已广泛应
用于植物种属鉴定、植物种质资源以及遗传多样性
的研究中，成为构建遗传图谱的重要工具［4］，是一
种较为理想的分子标记方法． 泡桐属(Paulownia
Sieb． ＆ Zucc．)植物原产中国，全国 23 个省(市)、
自治区均有其自然分布区与栽培区，是重要的速生
经济林树种．该属植物具有独特的生物学特性，能
与多种作物进行农林间作，是华北平原人工栽培的
农林复合生态系统的重要树种之一，对于改变生态
环境、保障农业稳产丰收以及在短期内提供大量的
商品用材具有重要作用． 就泡桐而言，学术界的研
究主要集中于白花泡桐的形态分类和变异［5 ～ 8］、无
性系自然接干性状的遗传变异［9］、泡桐丛枝支原
体［11，12］等方面的研究，而对于泡桐属植物分子学
方面的研究迄今比较少． 本研究对影响 ISSR-PCR
反应体系的各因素浓度进行试验，旨在建立适合某
一种属的最佳 ISSR-PCR 反应体系，为更好地利用
ISSR分子标记技术研究泡桐属植物的遗传多样性
打下良好基础．
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
试验所用材料分别为:1．毛泡桐;2．白花泡桐;
3．华东泡桐;4．川泡桐;5．台湾泡桐;6． 楸叶泡桐;
7．鄂川泡桐;8．成都泡桐;9．兰考泡桐;10． 山明泡
桐;11．宜昌泡桐;12．建始泡桐;13．白花兰考泡桐;
14．山地毛泡桐 1;15．山地毛泡桐 2;16．亮叶泡桐．
各材料均采自江西九江共青城泡桐种源试验育种
基地的泡桐幼嫩叶片．本试验所用 ISSR 引物参照
加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列，由生工
生物工程(上海)股份有限公司合成． 其他试剂:
Taq酶，10 × PCR Buffer，Mg2 +均购自生工生物工程
(上海)股份有限公司，dNTPs，DL2000 DNA marker
由北京全式金生物技术有限公司提供．
1． 2 方法
1． 2． 1 泡桐基因组 DNA 的提取及检测 以泡桐
嫩叶为材料，参照陈锋等［13］的方法，略加改动提取
基因组 DNA． 提取液中含 2 mol·L －1 EDTA(pH
8． 0 乙二胺四乙酸二钠) ) ，10 mol·L －1 Tris-HCl
(pH 8． 0) ，10 mol·L －1 NaCl 及 10%的 SLS(硫酸
月桂酸钠) ，将所得絮状沉淀干燥后加双蒸水进行
稀释，－ 20 ℃保存备用． 然后用质量分数 1． 5%的
琼脂糖凝胶电泳对提取的 DNA 质量进行检测，使
用前将其稀释为 40 mg·L －1 ．
1． 2． 2 ISSR-PCR正交试验设计 采用 L16(4
5)的
正交试验方法对 Taq 酶，Mg2 +，dNTPs，引物和模板
DNA 进行 5 因素 4 水平筛选(表 1) ，根据表 1 制备
总体积为 20 μL的反应体系． 除上述变化因素外，
每管中还加入 2． 5 μL 10 × PCR Buffer，引物选用
UBC807，PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min，然
后 94 ℃变性 30 s，55 ℃ 复性 45 s，72 ℃延伸 90 s，
40 个循环，72 ℃延伸 7 min，最后 4 ℃保温．取扩增
后的产物 10 μL 在质量分数 1． 5%的琼脂糖凝胶
上进行电泳，电极缓冲液为 1 × Tris － 乙酸(简称
TAE) ，电压为 100 V，80 min 后在凝胶成像分析仪
上观测分析并拍照．
1． 2． 3 PCR 反应体系单因素试验设计 根据正
交试验的结果选择出扩增条带较好的体系，并在此
基础上进行单因子优化，进一步优化所选体系，从
而获得扩增效果更好的体系． 引物选用 UBC807，
分别设置 Taq酶为 1． 00，1． 25，1． 50，1． 75，2． 00 U，
dNTPs浓度为 0． 200，0． 225，0． 250，0． 275，0． 300
mmol· L －1，将 Mg2 + 浓度设置为 2． 500，3． 125，
3． 750，4． 375，5． 000 mmol·L －1，引物浓度设为
0． 20，0． 25，0． 30，0． 35，0． 40 mmol·L －1，20 μL 体
系中模板则设为 30，40，50，60，70 ng． 对某一单因
素进行梯度优化时，其他因子的浓度按照上述正交
设计所得的初始体系中的浓度加入，通过试验确定
这一因子最佳方案［14］．
1． 2． 4 ISSR-PCR 体系退火温度优化 将优化好
的体系，用引物 807 对退火温度进行优化筛选，在
合成引物的理论 Tm值基础上设置退火温度 (Tm －
5 ℃)～(Tm + 5 ℃)［15］，梯度 PCR 仪上自动生成
温度梯度，选出条带数量多且清晰的温度作为最佳
退火温度．
2 结果与分析
2． 1 泡桐属植物叶片 DNA的检测结果
提取的泡桐属植物基因组 DNA 经质量分数
1． 5%的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1 所示．所
提取的 DNA 有较清晰的电泳条带，可用于 ISSR-
PCR扩增．该提取 DNA基因组的方法操作简便、成
本低、所需时间较短，并且所提取的 DNA能够满足
后续工作的需要［16］．
2． 2 ISSR-PCR正交设计分析
由于各因素的浓度组合不同，扩增结果存在着
显著差异．以特异谱带多态性高、背景干扰低、主带
清晰、副带明显为原则［15］，根据 L16(4
5)正交设计
PCR产物电泳结果(图 2) ，最终选择 8 号组合为泡
桐属植物 ISSR-PCR的反应体系．
274 河 南 农 业 大 学 学 报 第 47 卷
表 1 ISSR-PCR正交设计 L16(4
5)
Table 1 Orthogonal design to ISSR-PCR system L16(4
5)
编号
No．
Taq酶 /(U·μL －1)
Taq DNA polymerase
镁离子 /(mmol·L －1)
Mg2 +
脱氧核苷酸 /(mmol·L －1)
dNTPs
引物 /(mmol·L －1)
Primer
模板 /(mg·L －1)
DNA templates
1 0． 075 1． 875 0． 15 0． 25 1． 5
2 0． 075 2． 500 0． 25 0． 30 2． 0
3 0． 075 3． 125 0． 35 0． 35 2． 5
4 0． 075 3． 750 0． 45 0． 40 3． 0
5 0． 100 1． 875 0． 25 0． 30 2． 0
6 0． 100 2． 500 0． 15 0． 40 2． 5
7 0． 100 3． 125 0． 45 0． 25 1． 5
8 0． 100 3． 750 0． 35 0． 35 3． 0
9 0． 125 1． 875 0． 35 0． 35 2． 5
10 0． 125 2． 500 0． 45 0． 40 3． 0
11 0． 125 3． 125 0． 25 0． 25 1． 5
12 0． 125 3． 750 0． 15 0． 30 2． 0
13 0． 150 1． 875 0． 45 0． 40 3． 0
14 0． 150 2． 500 0． 35 0． 35 2． 5
15 0． 150 3． 125 0． 25 0． 30 2． 0
16 0． 150 3． 750 0． 15 0． 25 1． 5
1．毛泡桐;2．白花泡桐;3．华东泡桐;4．川泡桐;5． 台湾泡桐;6．楸叶泡桐;7．鄂川泡桐;8．成都泡桐;9． 兰考泡桐;10． 山明泡桐;11． 宜昌泡
桐;12．建始泡桐;13．白花兰考泡桐;14．山地毛泡桐 1;15．山地毛泡桐 2;16．亮叶泡桐．
1． Paulownia tomentosa;2． Paulownia fortunei;3． East China Paulownia;4． Paulownia fargesii;5． Paulownia kawakamii;6． Paulownia catalpifolia;
7． E Sichuan Paulownia;8． Chengdu Paulownia;9． Paulownia elongata;10． Shanming Paulownia;11． Yichang Paulownia;12． Jianshi Paulownia;
13． White Lankao Paulownia;14． Mountain mao Paulownia one;15． Mountain mao Paulownia two;16． Bright leaf Paulownia．
图 1 泡桐属植物基因组 DNA电泳
Fig． 1 Gel electrophoretogram of the genus Paulownia genomic DNA
1．水平组合 1 ～ 16;M． DNA marker(DL2000)．
1． Horizontal combination one to sixteen;M． DNA marker(DL2000)．
图 2 正交设计 ISSR-PCR体系扩增结果电泳
Fig． 2 Gel electrophoretogram of orthogonal
design ISSR-PCR amplification system
2． 3 ISSR-PCR体系单因素优化结果分析
2． 3． 1 不同单位 Taq 酶对 ISSR-PCR 体系的影响
如图 3 所示，1 ～ 5 泳道代表不同单位 Taq 酶的
扩增产物．结果显示，当加入 1． 25 U 的 Taq 酶时，
扩增条带少且模糊，加入 1． 50，1． 75，2． 00，2． 25 U
的 Taq酶时均能扩出清晰的条带，但 2． 00 U 时条
带最丰富且清晰，因此基于扩增结果好且节约成本
的原则，最终确定 Taq 酶的最优浓度为 1． 00 U
·μL －1 ．
M． DNA marker(DL2000) ;1． 1． 25 U;2． 1． 50 U;
3． 1． 75 U;4． 2． 00 U;5． 2． 25 U;
图 3 不同单位 Taq酶扩增产物电泳
Fig． 3 Gel electrophoretogram
of different unit Taq enzyme
第 3 期 卢妍妍等:泡桐属植物 ISSR-PCR反应体系的优化 275
2． 3． 2 不同浓度的 dNTPs 对 ISSR-PCR 体系的影
响 dNTPs浓度太高容易产生错误掺入，浓度太低
又会降低产率，因此，合适的 dNTPs 浓度是建立
ISSR-PCR 稳定体系的必要条件． 由图 4 可知，
0． 2 ～ 0． 4 mmol·L －1浓度的 dNTPs均可产生条带，
但 1 号泳道条带数目较少，2 ～ 4 号泳道条带多，但
带型比较弥散，相比较而言，5 号泳道条带多且清
晰． 因此，5 号泳道，即 0． 4 mmol· L －1 为最适
dNTPs的浓度．
M． DNA marker(DL2000)1． 0． 2 mmol·L －1;2． 0． 25 mmol·
L －1;3． 0． 3 mmol·L －1;4． 0． 35 mmol·L －1;5． 0． 4 mmol·L －1 ．
图 4 不同浓度的 dNTPs扩增产物电泳
Fig． 4 Gel electrophoretogram of different
concentrations of dNTPs
2． 3． 3 不同浓度的 Mg2 +对 ISSR-PCR体系的影响
Mg2 +是影响 PCR 反应的重要因素之一，可以有
效刺激酶的活性． 但是，其浓度过高会导致扩增样
品背景加深，浓度过低又会降低扩增产量［17］． 因
此，选择合适的 Mg2 +浓度对于 PCR 扩增体系的优
化是非常重要的．由图 5 可知，当Mg2 +浓度为 3． 75
mmol·L －1扩增条带多且清晰．
M． DNA marker (DL2000) ;1． 2． 500 mmol·L －1;2． 3． 125 mmol·
L －1;3． 3． 750 mmol·L －1;4． 4． 375 mmol·L －1;5． 5． 000 mmol
·L －1 ．
图 5 不同浓度的Mg2 +扩增产物电泳
Fig． 5 Gel electrophoretogram of different
concentrations of Mg2 +
2． 3． 4 不同浓度的引物对 ISSR-PCR 体系的影响
由图 6 可知，不同引物浓度对扩增条带数影响不
是很显著，但当引物浓度低时，扩增产物条带比较
暗，说明扩增出的片段量比较少．出于成本考虑，本
试验最终确定引物浓度为 0． 35 mmol·L －1 ．
M． DNA marker (DL2000) ;1 ． 0． 20 mmol·L －1;2． 0． 25 mmol·
L －1;3． 0． 30 mmol· L －1;4． 0． 35 mmol· L －1;5． 0． 40 mmol
·L －1 ．
图 6 不同浓度的引物扩增产物电泳
Fig． 6 Gel electrophoretogram of different
concentrations of primer
2． 3． 5 模板含量的优化 DNA 模板对 PCR 反应
体系的影响如图 7 所示． 结果显示，不同质量浓度
的模板对扩增结果影响不明显，但当模板质量浓度
低时扩增条带出现弥散现象，2，3，5 泳道均有数量
较多且清晰的条带．但是，从节约模板的角度出发，
本试验最终确定 DNA 模板质量浓度为 2． 0 mg
·L －1 ．
M． DNA marker(DL2000) ;1． 1． 5 mg·L －1;2． 2． 0 mg·L －1;3．
2． 5 mg·L －1;4． 3． 0 mg·L －1;5． 3． 5 mg·L －1 ．
图 7 不同模板质量浓度扩增产物电泳
Fig． 7 Gel electrophoretogram of
different template quality
2． 4 优化的反应体系及扩增程序的验证
随机选取 810 和 834 两条引物对优化后的体
系及扩增程序进行稳定性验证．验证结果如图 8 和
276 河 南 农 业 大 学 学 报 第 47 卷
图 9 所示．所选引物对泡桐属植物的 16 份材料(能
扩出的条带多且清晰，无特异性条带，说明该体系
稳定，适合泡桐属植物基因组 DNA的 ISSR-PCR扩
增．
1．毛泡桐;2． 白花泡桐;3． 华东泡桐;4． 川泡桐;5． 台湾泡桐;6． 楸
叶泡桐;7． 鄂川泡桐;8． 成都泡桐;9． 兰考泡桐;10． 山明泡桐;11．
宜昌泡桐;12．建始泡桐;13． 白花兰考泡桐;14． 山地毛泡桐 1;15．
山地毛泡桐 2;16．亮叶泡桐;M． DNA marker (DL2000)．
1． Paulownia tomentosa;2． Paulownia fortunei;3． East China Paulow-
nia;4． Paulownia fargesii;5． Paulownia kawakamii;6． Paulownia
catalpifolia;7． E Sichuan Paulownia;8． Chengdu Paulownia;9． Pau-
lownia elongata;10． Shanming Paulownia;11． Yichang Paulownia;
12． Jianshi Paulownia one;13． White Lankao Paulownia;14． Mountain
mao Paulownia one;15． Mountain mao Paulownia two;16． Bright leaf
Paulownia;M． DNA marker (DL2000)．
图 8 引物 810 对 16 个泡桐属植物的扩增结果
Fig． 8 Amplification results of primer 810
to 16 genus Paulownia plants
1 ～ 16 代表的材料同图 8;M． DNA marker(DL2000)．
The material of one to sixteen representative to figure 8;M． DNA mar-
ker(DL2000)．
图 9 引物 834 对 16 个泡桐属植物的扩增结果
Fig． 9 Amplification results of primer
834 to 16 genus Paulownia plants
3 结论与讨论
在分子水平上，对泡桐的研究只有陈红林
等［18］对 8 种泡桐的 1 a 生枝条韧皮部进行的同工
酶酶谱分析，龚本海等［19］对泡桐属 5 种植物的
SOD同工酶和可溶性蛋白质的分析，卢龙斗等［20］
运用 RAPD 分析方法对泡桐属的 7 个种植物进行
分类，马浩等［21］则对中国泡桐属 15 个植物种类进
行了叶绿体 DNA 的 RFLP 分析，李芳东等［22］运用
ISSR分子标记的方法对泡桐种质资源进行种、变
种、变异类型间、种源间的亲缘关系和遗传多样性
进行研究，并最终将 38 个白花泡桐种源分为 3 组．
而利用 ISSR分子标记的方法对泡桐属不同种植物
的分析则至今未见报道．本试验首先采用正交试验
选出扩增条带较好的体系，然后在此基础上结合单
因素试验对各个因子进一步优化最终选出适合泡
桐属不同种植物的 ISSR-PCR 扩增体系，从而避免
了直接采用单因子梯度试验带来的不必要麻烦．
试验表明，Taq DNA聚合酶的用量将直接影响
多态性的检测及扩增结果的重复性和稳定性，酶含
量过低会降低反应的灵敏度，减少扩增量;反之，则
会降低反应的特异性，使条带弥散． 本试验所获得
Taq DNA聚合酶的用量从电泳结果可知，扩展出的
条带符合 ISSR 分子标记的要求，并取得了较为理
想的结果;Mg2 +是影响 PCR反应的另一关键因素，
不但 Taq DNA聚合酶需要 Mg2 +来激活，而且引物
与模板的结合以及退火温度都受到 Mg2 +的影响．
此外，引物浓度也是影响 PCR 扩增反应的因素之
一．引物浓度过低则扩增产物较少且背景颜色较
浅;反之，则会产生非特异性扩增，容易形成引物二
聚体;而对模板 DNA的用量要求范围较宽．
本研究以泡桐属不同种植物的基因组 DNA为
模板，最终筛选出适合泡桐属不同种植物的 ISSR-
PCR扩增体系为 20 μL 体系中含 buffer 2． 5 μL，
Taq酶 2． 0 U，Mg2 + 3． 75 mmol·L －1，0． 4 mmol·
L －1dNTPs，引物 0． 35 mmol·L －1，模板 40 ng． 目
前，已经运用该体系从 52 条 ISSR 引物中筛选出
10 条扩增条带清晰、多态性高、反应稳定的引物，
用于正式的泡桐属不同种植物的 ISSR分析．同时，
该研究也将为泡桐分子标记育种、遗传图谱构建等
分子生物学的研究奠定良好的基础．
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( 责任编辑:常思敏)