全 文 ：山西大学学报（自然科学版）３７（３）：４３４－４３８，２０１４
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
　
　　 文章编号：０２５３－２３９５（２０１４）０３－０４３４－０５
＊ 远志属腊叶标本ＤＮＡ提取方法研究
樊杰，申飞翔，何益，马全级，箫迪，白妍，束明月
（山西中医学院，山西 太原０３００２４）
摘　要：以远志属植物腊叶标本为例，研究如何从植物腊叶标本中提取到高质量的ＤＮＡ。在改良ＣＴＡＢ法的基础
上，对水浴时间、水浴温度、沉淀时间进行优化。结果表明，降低水浴温度为４５℃，延长水浴时间为５－６ｈ，延长沉
淀时间为１－２ｈ，可以从远志属腊叶标本中提取到用于ＰＣＲ反应的ＤＮＡ。
关键词：远志属；腊叶标本；ＤＮＡ提取；改良ＣＴＡＢ法
中图分类号：Ｑ９４６　　　文献标志码：Ａ　　　ＤＯＩ：１０．１３４５１／ｊ．ｃｎｋｉ．ｓｈａｎｘｉ．ｕｎｉｖ（ｎａｔ．ｓｃｉ．）．２０１４．０３．０２２
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｕｓ　Ｐｏｌｙｇａｌａ
ＦＡＮ　Ｊｉｅ，ＳＨＥＮ　Ｆｅｉｘｉａｎｇ，ＨＥ　Ｙｉ，ＭＡ　Ｑｕａｎｊｉ，ＸＩＡＯ　Ｄｉ，ＢＡＩ　Ｙａｎ，ＳＨＵ　Ｍｉｎｇｙｕｅ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔａｉｙｕａｎ０３００２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｔ　ｉｓ　ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｃｉｍｅｎｓ　ｄｕｅ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｃ－
ｏｎｄａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ａｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｕｓ　Ｐｏｌｙｇａｌａ，ｈｏｗ　ｔｏ　ｅｘｔｒｃｔ　ｅｎｏｕｇｈ　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｉｔｏｎ　ｉｓ　ａ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｐｒｏｂ－
ｌｅｍ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｅｏｄ，ｌｉｎｋｓ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，
ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ｅｔ　ａｌ．，ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　ａｔ　４５℃ｆｏｒ
ａ　ｓｏｍｅｗｈａｔ　ｌｏｎｇ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　５－６ｈａｎｄ　ａ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　１－２ｈｏｕｒｓ　ｃａｎ　ｅｘｔｒａｃｔ　ＤＮＡ
ｆｏｒ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍＰｏｌｙｇａｌａｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙｇａｌａ　Ｌ．；ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ；ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ
植物ＤＮＡ提取一般使用新鲜叶片或硅胶干燥叶片。近些年来，植物的腊叶标本也成为重要的ＤＮＡ提
取材料，但一直存在提取ＤＮＡ质量差的问题［１－３］。一方面由于腊叶标本制作过程中的高温和（或）化学试剂
造成了腊叶标本ＤＮＡ的严重降解，同时使标本中次生代谢物增多；后期的长期常温存放也有影响［１，４－５］。另
一方面是植物类群本身的原因，如药用植物，它们含有丰富次数代谢物，其中多酚，多糖类会影响ＤＮＡ提
取［２－６］。针对以上问题，已有研究大多集中在如何去除杂质［１，４－５］。最近的研究集中在存放不同年代的植物腊
叶标本的 ＤＮＡ 提取上，一般越古老的标本提取 ＤＮＡ 的困难越大，特别是如何增加 ＤＮＡ 提取量的问
题［２，６］。
远志属（Ｐｏｌｙｇａｌａ）是一个世界大属，约５００种，我国有４２种８变种［７－８］，其中药用２２种［９］。为了研究我
国远志属的分子系统关系，我们首先提取该属材料的ＤＮＡ。该属部分种的ＤＮＡ提取材料为腊叶标本，我
们用改良ＣＴＡＢ法［１４］无法提取到满足后续ＰＣＲ反应的 ＤＮＡ。远志属主要含有皂苷、口山酮、寡糖酯
类［９－１３］，对ＤＮＡ提取基本不造成影响，本研究以这些材料为对象，研究如何从不同存放年代的腊叶标本中提
取到高质量的ＤＮＡ。
＊ 收稿日期：２０１４－０２－１０；修回日期：２０１４－０３－０４
　　 基金项目：山西省自然科学基金（２０１２０１１０３４－２）；山西中医学院博士科研启动基金（２０１４）；山西中医学院创新团队项目
　　 作者简介：樊杰（１９７２－），女，山西襄汾人，讲师，博士，研究方向：中药资源学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｊｉｅ６７８９＠１６３．ｃｏｍ
１　材料与方法
１．１　材料
本研究ＤＮＡ提取材料均为腊叶标本叶片材料，均取自中国科学院植物研究所标本馆（ＰＥ），详见表１。
表１　样品来源
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓａｍｐｌｅ　ｓｏｕｒｃｅｓ
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
种 名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
采集地
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
保存方法（常温）及保存时间（年）
Ｓｔｏｒａｇｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ
（ｎｏｒｍａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ｙｅａｒｓ）
凭证标本
Ｖｏｕｃｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ
１　 Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｗｉｌｄ．
巴拉圭
Ｐａｒａｇｕａｙ
１２　 ０１５０４０６９（ＰＥ）
２
华南远志
Ｐｏｌｙｇａｌａ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ　Ｄｕｎｎ
河南新县
Ｘｉｎｘｉａｎ，Ｈｅｎａｎ
３１　 ０１８５３５７０（ＰＥ）
３
黄花倒水莲
Ｐｏｌｙｇａｌａ　ｆａｌｌａｘ　Ｈｅｍｓｌ．
江西安福
Ａｎｆｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ
５０　 ００６３０５４２（ＰＥ）
４
远志
Ｐｏｌｙｇａｌａ　ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ　Ｗｉｌｄ．
陕西绥德
Ｓｕｉｄｅ，Ｓｈａａｎｘｉ
５９　 ００６３１９３２（ＰＥ）
５
荷包山桂花
Ｐｏｌｙｇａｌａ　ａｒｉｌｌａｔａ　Ｂｕｃｈ．－Ｈａｍ．ｅｘ　Ｄ．Ｄｏｎ
云南宾川
Ｂｉｎｃｈｕａｎ，Ｙｕｎｎａｎ
６７　 ００６３０２３９（ＰＥ）
６
红花远志
Ｐｏｌｙｇａｌａ　ｔｒｉｃｈｏｌｏｐｈａ　Ｃｈｏｄａｔ
海南铜甲
Ｔｏｎｇｊｉａ，Ｈａｉｎａｎ
８１　 ００７４４００４（ＰＥ）
　　ＰＥ，中国科学院植物所标本馆
１．２　方法
１．２．１　ＤＮＡ提取方法
在常用的改良ＣＴＡＢ法［１４］基础上，主要从水浴温度和水浴时间环节入手，同时考虑其他环节，如ＣＴＡＢ
浓度、沉淀时间等［２－３］（表２）。主要过程为：取０．１ｇ腊叶标本叶片材料，加０．０１ｇＰＶＰ，并在提前－２０℃预
冷的研钵中迅速研磨至粉状后，迅速转移到预热至水浴温度的提前加入７μＬβ－巯基乙醇的ＣＴＡＢ溶液中水
浴，氯仿∶异戊醇（２４∶１）抽提２次，加入２／３体积的提前－２０℃预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒３次，－２０℃
放置１～２ｈ，用体积分数７０％乙醇清洗２次，晾干后，加入１×ＴＥ溶液溶解。
１．２．２　ＤＮＡ质量检测方法
１．２．２．１　琼脂糖凝胶电泳法
表２　ＤＮＡ提取步骤的优化实验
Ｔａｂｌｅ　２　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
提取方法
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
水浴温度（摄氏度）
Ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ｄｅｇｒｅｅｓ　ｃｅｌｓｉｕｓ
水浴时间（ｈ）
Ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　ｔｉｍｅ
沉淀时间（ｈ）
Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ
抽提次数
Ｃｉｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ＣＴＡＢ浓度
ＣＴＡＢ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
１ Ｉｍ　Ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　 ６５　 ０．５～１　 ０．５　 ２　 ２×
２ Ｉｍ　Ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　１　 ６５　 １　 ０．５　 ２　 ３×
３ Ｉｍ　Ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　２　 ５５　 ５～６　 ５　 ２　 ２×
４ Ｉｍ　Ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　３　 ５０　 ５～６　 ５　 ２　 ２×
５ Ｉｍ　Ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　４　 ４５　 ５～６　 ５　 ２　 ２×
６ Ｉｍ　Ｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　５　 ４５　 ５～６　 １－２　 ２　 ２×
　　２×：每１００ｍＬ水溶液中含有２ｇＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵）。
　　２ｇ　ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）ｐｅｒ　１００ｍＬ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
　　用质量浓度０．８℅的琼脂糖凝胶电泳。取５μＬＤＮＡ样品，加３μＬ上样缓冲液混匀后，加入胶孔内，在
１００Ｖ电压下电泳４０ｍｉｎ。
１．２．２．２　ＰＣＲ扩增及测序检测
ＰＣＲ扩增片段为ＩＴＳ和ｔｒｎＬ。其引物除参考文献中的引物外［１５］，对一些ＰＣＲ没有结果的种类还根据
ＧｅｎＢａｎｋ中该属已有的序列设计了新引物（见表３），ＩＴＳ１片段有３个种（华南远志、红花远志和黄花远志），
虽然设计了很多新引物，但ＰＣＲ未果，所以本文没有这３个种的ＩＴＳ１引物及序列报道。ＰＣＲ总体积为
５３４　　　　　　　　 　　　　　 　　　樊杰等：远志属腊叶标本ＤＮＡ提取方法研究
２５μＬ，包括：１２．５μＬ　Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｔａｑ），１０μｍｏｌ·Ｌ
－１引物各０．５μＬ，０．５～１μＬ模板（１０～５０
ｎｇ），用灭菌超纯水补足反应体积。ｔｒｎＬ扩增程序直接参考文献［１５］；ＩＴＳ扩增程序为：９４℃，３ｍｉｎ；３３个
循环：９４℃，１ｍｉｎ；５８℃，１ｍｉｎ；７２℃，１ｍｉｎ　２０ｓ；７２℃，６ｍｉｎ［１５］。ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测。
ＰＣＲ产物送华大基因公司测序。
表３　ＰＣＲ反应中使用的新引物
Ｔａｂｌｅ　３　Ｎｅｗ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｉｎ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒｓ
扩增片段
ＰＣＲ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
序列（５’－３’）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
１ ＩＴＳ２Ｆ２ ＩＴＳ２ ｃｇａａａｔｇｃｇａｔａｃｔｔｇｇｔｇｔｇａａｔｔ
２ ＩＴＳ２Ｒ２ ＩＴＳ２ ｇｃｔｔａａａｃｔｃａｇｃｇｇｇｔｇｇ
３ ＩＴＳ２Ｆ１ ＩＴＳ２ ｇｃａｃｇｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇｔｇｔｃａ
４ ＩＴＳ２Ｒ１ ＩＴＳ２ ｔｇｃａｔｃｇｃａｇｃｇｃａｇｔｇｇｇｔ
５ ｃ１　 ｔｒｎＬ　 ｔａａｃａａｔｇｇｇｃａａｔｃｃｔｇ
６ ｄ１　 ｔｒｎＬ　 ｇａｃｔｔｇａａｃｃｃｔｃａｃｇａｔ
７ ｃ２　 ｔｒｎＬ　 ｔｇａｇｃｃｔｔｇｇｔａｔｇｇａａａ
８ ｄ２　 ｔｒｎＬ　 ｇａａｔｇｇｇａｃｔｃｔａｔｃｔｔｔａｔ
１．２．２．３　核酸测定仪检测
核酸蛋白质测定仪为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　ｐｌｕｓ。除荷包山桂花ＤＮＡ用灭菌超纯水稀释２０倍外，
其余样品均稀释１０倍后进行检测。测定的指标主要为：Ａ２６０／Ａ２８０，表示 ＤＮＡ 纯度，Ａ２６０／Ａ２８０ 在
１．８－２．０之间表示无蛋白质污染；ＤＮＡ含量，单位为μｇ·ｍＬ
－１。
２　结果与分析
２．１　基因组ＤＮＡ电泳分析
在紫外分析仪上观察，腊叶标本提取的ＤＮＡ均无条带，也无弥散，说明ＤＮＡ浓度太低，琼脂糖凝胶电
泳失败。
２．２　ＰＣＲ扩增及测序
除Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ外，ＩＴＳ片段均无法一次完成ＰＣＲ扩增，所以分为ＩＴＳ１和ＩＴＳ２两段扩增。所
有样品用改良ＣＴＡＢ法［１４］及改良ＣＴＡＢ法１提取的ＤＮＡ在ＰＣＲ扩增后均没有条带；除Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒａ　ｆｌｏｒｉ－
ｂｕｎｄａ外，用改良ＣＴＡＢ法２、３提取的ＤＮＡ在ＰＣＲ扩增后均无结果；除黄花倒水莲和红花远志外，改良ＣＴＡＢ
法４提取的ＤＮＡ在ＰＣＲ扩增后在相应位置有条带（华南远志的ＩＴＳ１片段由于引物问题除外）；全部样品用改
良ＣＴＡＢ法５提取的ＤＮＡ在ＰＣＲ扩增后在相应位置均有条带且测序成功（华南远志、黄花倒水莲、红花远志
的ＩＴＳ１片段由于引物问题除外），Ｂｌａｓｔ表明均为远志属序列，ＧｅｎＢａｎｋ序列号见表４。
表４　本研究获得的ＧｅｎＢａｎｋ序列号
Ｔａｂｌｅ　４　ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
种 名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
ＧｅｎＢａｎｋ序列号
ＧｅｎＢａｎｋ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｏ．
ＩＴＳ１ ＩＴＳ２　 ｔｒｎＬ
１　 Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｗｉｌｄ． ＫＪ４６２４６３ ＫＪ４６２４６９ ＫＪ４６２４８２
２
华南远志
Ｐ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ
－ ＫＪ４６２４７３ ＫＪ４６２４７９
３
黄花倒水莲
Ｐ．ｆａｌｌａｘ
－ ＫＪ４６２４７２ ＫＪ４６２４７８
４
远志
Ｐ．ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ
ＫＪ４６２４６４ ＫＪ４６２４７０ ＫＪ４６２４７６
５
荷包山桂花
Ｐ．ａｒｉｌｌａｔａ ＫＪ４６２４６５ ＫＪ４６２４７１ ＫＪ４６２４７７
６
红花远志
Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｌｏｐｈａ
－ ＫＪ４６２４７４ ＫＪ４６２４８０
６３４ 山西大学学报（自然科学版）　　　　　　　 　　　　　　　　３７（３）　２０１４　
２．３　核酸测定仪检测ＤＮＡ含量均满足ＰＣＲ反应，但部分样品纯度不够
用改良ＣＴＡＢ法５提取的ＤＮＡ其Ａ２６０／Ａ２８０值为１．３８－２．１１，浓度为２８５．００～２　５８４．００μｇ·ｍＬ
－１
（见表５）。其中黄花倒水莲的Ａ２６０／Ａ２８０值为１．３８，说明纯度不够，有蛋白质污染。
表５　改良ＣＴＡＢ法５提取的ＤＮＡ检测结果
Ｔａｂｌｅ　５　Ｔｅｓｔｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＣＴＡＢ５
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
种 名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
保存方法及时间
Ｓｔｏｒａｇｅ　ｍｅｔｈｏｄ（ｎｏｒｍａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）
ａｎｄ　ｔｉｍｅ（ｙｅａｒｓ）
ＤＮＡ含量（μｇ·ｍＬ
－１）
ＰＮＡ　Ｃｅｎｔｅｎｔ
Ａ２６０／Ａ２８０
１　 Ｂｒｅｄｅｍｅｙｅｒａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｗｉｌｄ． １２　 ３０４．００　 １．９８
２
华南远志
Ｐ．ｇｌｏｍｅｒａｔａ
３１　 ３８６．００　 ２．１１
３
黄花倒水莲
Ｐ．ｆａｌｌａｘ
５０　 ２８５．００　 １．３８
４
远志
Ｐ．ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ
５９　 ６５０．００　 １．９８
５
荷包山桂花
Ｐ．ａｒｉｌｌａｔａ ６７　 ２　５８４．００　 １．８７
６
红花远志
Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｌｏｐｈａ
８１　 ４２３．００　 ２．００
３　讨论
３．１　ＤＮＡ的纯度问题还是浓度问题
ＤＮＡ的纯度被认为是腊叶标本提取ＤＮＡ中的主要问题之一，直接影响到后续的分子操作［１，４－５］。近些
年，由于腊叶标本的差异性，特别是保存多年的腊叶标本，ＤＮＡ提取的浓度问题受到重视［２－３］。对于远志属，
本研究认为ＤＮＡ浓度问题是首要问题，在ＤＮＡ浓度保障的情况下，ＤＮＡ纯度对后续ＰＣＲ反应也造成一
定影响，如黄花倒水莲，Ａ２６０／Ａ２８０偏低，ＰＣＲ条带较弱。
３．２　水浴的温度和时间及沉淀时间
腊叶标本染色体中与ＤＮＡ结合的核蛋白不易分离，需要降低水浴温度并延长水浴时间［２－３］，或加入蛋
白酶［３］，才能够让足够多的 ＤＮＡ游离出来。已有的报道中水浴温度范围为５５～６０℃，水浴时间１－５
ｈ［２－３］。本研究中远志属腊叶标本的水浴温度进一步降低为４５℃，水浴至少５ｈ。可以看出，不同植物类群的
腊叶标本，水浴温度和水浴时间需要筛选。
腊叶标本普遍存在ＤＮＡ降解，ＤＮＡ片段较短，延长沉淀时间有利于沉淀较多的ＤＮＡ片段，但同时也
会增加其他物质的沉淀，所以，合理的沉淀时间是关键。有些研究认为长时间的沉淀是腊叶标本ＤＮＡ提取
的一个重要的环节［１－２，１６］，如Ｓｒｋｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ［１］的沉淀时间长达２周。而我们的研究表明，对于远志属的腊叶
标本而言，１－２ｈ的沉淀时间是最适合的。
３．３　标本的存放时间对腊叶标本ＤＮＡ提取的影响
一般认为存放时间越久，腊叶标本中ＤＮＡ降解的越严重；但最近的研究表明其影响要比不同植物类群
及不同制作方法造成的影响小得多［１，４－５］。本研究也基本验证了这个观点，１２－８１ａ的腊叶标本，提取的
ＤＮＡ质量与存放时间没有明显的相关性。
４　结论
远志属的腊叶标本材料用改良ＣＴＡＢ法［１４］或提高ＣＴＡＢ浓度均未能提取到满足后续ＰＣＲ反应的
ＤＮＡ；适当降低水浴温度并延长水浴时间分别为４５℃，水浴５－６ｈ，可以提取到满足后续ＰＣＲ反应的
ＤＮＡ，并测序成功。但扩增的ＤＮＡ片段大约５００ｂｐ以下。腊叶标本存放时间长短对提取ＤＮＡ的质量造
成一定的影响，但不是很明显。
参考文献：
［１］　Ｓｒｋｉｎｅｎ　Ｔ，Ｓｔａａｔｓ　Ｍ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　Ｊ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｏｗ　ｔｏ　Ｏｐｅｎ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｓｕｒｅ　Ｃｈｅｓｔ？Ｏｐｔｉｍｉｓｉｎｇ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｈｅｒｂａｒｉ－
７３４　　　　　　　　 　　　　　 　　　樊杰等：远志属腊叶标本ＤＮＡ提取方法研究
ｕｍ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ［Ｊ］．ＰｌｏＳ　ｏｎｅ，２０１２，７（８）：ｅ４３８０８．
［２］　Ｃｏｔａ－Ｓáｎｃｈｅｚ　Ｊ　Ｈ，Ｒｅｍａｒｃｈｕｋ　Ｋ，Ｕｂａｙａｓｅｎａ　Ｋ．Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ＣＴＡＢ　Ｍｅｔｈｏｄ　Ａｄａｐｔｅｄ　ｆｏｒ　Ｈｅｒｂａｒｉ－
ｕｍ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ａｎｄ　Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐ，２０１２，２４（２）：１６１．
［３］　李东宣，杨改刚，侯瑶，等．农家遗存稻谷古ＤＮＡ提取及ＰＣＲ分析 ［Ｊ］．分子植物育种，２０１１，９：１３１２．
［４］　Ｓｔａａｔｓ　Ｍ，Ｃｕｅｎｃａ　Ａ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　Ｊ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．ＤＮＡ　Ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｈｅｒｂａｒｉｕｍ　Ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．ＰｌｏＳ　ｏｎｅ，２０１１，６：ｅ２８４４８．
［５］　Ｈａｒｒｉｓ　Ｓ　Ａ．ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｐｅｃｉｅｓ：ａｎ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｐ１ａｎｔ　Ｓｙｓｔ　Ｅｖｏｌ，
１９９３，１８８：５７．
［６］　Ａｎｄｒｅａｓｅｎ　Ｋ，Ｍａｎｋｔｅｌｏｗ　Ｍ，Ｒａｚａｆｉｍａｎｄｉｍｂｉｓｏｎ　Ｓ　Ｇ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　２００－ｙｅａｒ－ｏｌｄ　Ｈｅｒｂａｒ－
ｉｕｍ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎ：Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｌｉｎｎｅａｎ　Ｅｒａ［Ｊ］．Ｔａｘｏｎ，２００９，５８（３）：９５９．
［７］　中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志［Ｍ］．第４３卷．北京：科学出版，１９９７．
［８］　陈书坤．中国远志属植物的分类研究 ［Ｊ］．植物分类学报，１９９１，２９（３）：１９３．
［９］　赵云生，严铸云，李占琳．远志属药用植物有效物质群结构特点及其生理活性 ［Ｊ］．中医药学刊，２００５，２３（８）：１４２０．
［１０］　杨学东，张丽杰，梁波．远志科植物中寡糖酯类成分 ［Ｊ］．中草药，２００２，３３（１０）：９５４．
［１１］　杨学东，徐丽珍，杨世林．远志属植物中口山酮类成分及其药理研究进展 ［Ｊ］．天然产物研究与开发，１９９９，１２（５）：８８．
［１２］　李文魁，林新，彭勇．中国远志属药用植物资源及传统疗效 ［Ｊ］．时珍国药研究，１９９７，８（６）：４８１．
［１３］　宋成芝，吴章康，华燕．远志属药用植物化学成分和生物活性研究进展 ［Ｊ］．中国民族民间医药，２００８（３）：２８．
［１４］　Ｄｏｙｌｅ　Ｊ　Ｊ，Ｄｏｙｌｅ　Ｊ　Ｌ．Ａ　Ｒｅｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｓｍａｌ　Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｆｒｅｓｈ　Ｌｅａｆ　Ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ　Ｂｕｌｌ，
１９８７，１９：１１．
［１５］　Ａｂｂｏｔｔ　Ｊ　Ｒ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ　ａｎｄ　ａ　Ｒｅｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｄｉｅｒａ［Ｄ］．Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｅ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｌｏｒｉｄａ，２００９．
［１６］　ＤｒáｂｋｏｖáＬ，Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ　Ｊ，Ｖｌｃｅｋ　Ｃ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｓｅｖｅｎ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｉｎ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ　Ｈｅｒ－
ｂａｒｉｕｍ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｏｆ　Ｊｕｎｃａｃｅａｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐ，２００２，２０：
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
１６１．
作者文摘的编写
文摘是以提供文献内容梗概为目的、不加评论和补充解释，简要明确地记叙文献重要内容的独立短文。其基本要素包括
研究的目的、方法、结果、结论，具有独立性和自明性。
①目的———研究、研制、调查等的前提、目的和任务所涉及的主题范围。
②方法———所用的原理、理论、条件、对象、材料、工艺、结构、手段、装备、程序等。
③结果———实验的、研究的结果、数据，被确定的关系，观察结果，得到的效果，性能等。
④结论———结果的分析、研究、比较、评价、应用，提出的问题，今后的课题，假设，启发，建议，预测等。
⑤其他有价值的重要信息。
文献可分为报道性文摘、报道／指示性文摘和指示性文摘，作者文摘一般要写成前两种，字数在４００字左右为宜，且对结
果、结论宜写得详细，并将列述的创新点表达出来。
摘要的作用：
文摘具有重要的引导价值。首先，摘要是影响文献被检索和引用的重要因素。其次摘要为读者快捷准确地了解论文的
主要内容提供了方便。
编写文摘的注意事项：
①要客观如实地反映一次文献，切不可加进作者的主观见解、解释或评论。
②要着重反映新内容和作者特别强调的观点。
③要排除本学科领域已成常识的内容，不得简单重复题名和引言中已有的信息。
④要用第三人称写法，应采用“对……进行了研究”、“报告了……现状”、“进行了……调查”等记述方法。对一次文献的主
题、内容、性质、水平做出客观、准确、简明的描述，要求结构严谨，层次分明，表达准确，言简意赅，没有歧义。书写要合乎语法、
逻辑关系，要采用规范化的科学技术名词术语，对新术语、缩略语等在首次出现时应加以说明。
⑤文摘不用非公知公用的术语和符号，不用数学公式和化学结构式，不用引文和图表。
８３４ 山西大学学报（自然科学版）　　　　　　　 　　　　　　　　３７（３）　２０１４