全 文 ：中国农业科学 2011,44(8):1553-1561
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.08.003

收稿日期：2010-08-30；接受日期：2010-12-01
基金项目：重庆市重大攻关项目（cq-2009001）、西南大学博士启动基金（swu110059）
联系方式：陈仁芳，Tel：13637918650；E-mail：crf55@163.com


桑属 ITS、trn L-F、rps16 序列与进化分析
陈仁芳 1，张 泽 1,2，唐 洲 2，余茂德 1，徐 立 1，王茜玲 1
（1 西南大学生物技术学院/农业部蚕桑学重点开放实验室，重庆 400716；2 重庆大学农学及生命科学研究院，重庆 400030)

摘要：【目的】分析桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列，探讨系统学价值。【方法】67 份桑资源，经 DNA 提取、
PCR 扩增、测序，测序结果用软件拼接、比对，并从 GenBank 下载桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列进行同源性分析，
计算其长度、G+C（或 A+T）含量、变异位点、信息位点，将 3 个序列合并，以构树、柘树为外类群，采用 MP 法
分析进化关系。【结果】桑 ITS（包括 5.8S）基本序列长度为 576 bp，变异范围为 576—590 bp，G+C 含量为 59.55%
—62.25%，40 个信息位点；trnL-F（包括 tRNA-Leu 内含子）基本序列长度为 923 bp，变异范围为 920—924 bp，
A+T 含量为 65.87%—66.31%，23 个信息位点；rps16 内含子基本序列长度为 929 bp，变异范围为 923—929 bp，
A+T 含量为 67.28%—67.49%，17 个信息位点。3个序列的最适碱基进化模型分别为（GTR+G）、（GTR)和（GTR+G），
可能的分支概率—混合卡方概率值分别为 0.000001、0.027175 和 0.000222，3 个片段合并最适碱基进化模型为
（GTR+G），基于模型用 MP 法分析，在 2 538 个位点中，有 80 个信息位点。分支图结果表明，首先将黑桑（M. nigra）
分出，其它桑种分成 2 支，第一支包括长穗桑、瑞穗桑、蒙桑、鬼桑、鸡桑、山桑、白桑和广东桑，第二支包括
华桑、奶桑和川桑。【结论】桑属 trnL-F 和 rps16 序列信息位点有限，单独研究桑属系统学，价值不大，与 ITS
序列合并研究，则能增加分支图的信息位点，使分支图更近于似然。基于 ITS、trnL-F、rps16 序列 MP 分支图，
新疆黑桑为最原始类型，乌克兰等栽培种为进化类型。
关键词：桑属；ITS、trnL-F、rps16 序列；MP 分析法；进化关系

Morus ITS, trnL-F, rps16 Sequence and Phylogenetic
Analysis of Mulberry Resources
CHEN Ren-fang1, ZHANG Ze1,2, TANG Zhou2, YU Mao-de1, XU Li1, WANG Xi-ling1
（1College of Biotechnology, Southwest University/Key Sericultural Laboratory of Ministry of Agriculture, Chongqing 400716;
2The Institute of Agricultural and Life Sciences, Chongqing University, Chongqing 400030）

Abstract: 【Objective】 In this research, the sequences of Morus-ITS, trnL-F, and rps16 were analyzed to discuss the value of
phylogeny.【Method】A total of 67 mulberry genotypes were analyzed (DNA extraction, PCR amplification, sequencing, software
splicing, alignment, removing non-sequence bases, downloading Morus ITS, trnL-F, rps16 sequences from GenBank and analyzing
percentidentity, calculating length and G+C (A+T) content, mutant sites and informative sites), then these three sequences were
combined. A cladogram, generated using MP, was built by using B. papyrifera and C. tricuspidata as outgroup. 【Result】 The length
of basic sequence of mulberry ITS (including 5.8S) is 576 bp, variation range of 576-590 bp, G+C 59.55%-62.25%, 40 informative
sites. Mulberry trnL-F intergenic sequence (including the tRNA-Leu intron)，the length of basic sequence is 923 bp, variation range
of 920-924 bp, A +T 65.87%-66.31%, 23 informative sites. The length of basic sequence of rps16 intron is 929 bp, variation range of
923-929 bp, A+T 67.28%-67.49%, 17 informative sites. The most possible evolutionary models were (GTR+G), (GTR) and
(GTR+G), respectively. And the optimal evolutionary model of the 3-segment-combined analysis was (GTR+G). In the cladogram,
Morus nigra is separated first, the rest is divided into two branches. BranchⅠof this cladogram consists of 8 species, including
1554 中 国 农 业 科 学 44 卷
M.wittorum, M. mizuho, M.mongolica, M.mongolica var. diabolica, M. Australis, M. Bombycis, M. Alba and M. atropurprea. Other
three members ( M. cathayana, M. Macroura, M. notabilis) falls under branch Ⅱ.【Conclusion】trnL-F and rps16 sequence
information sites of Morus is limited, but combined with the ITS sequences, it can improve the branch map information sites, and
make branch map more reliable. Based on ITS, trnL-F, rps16 sequence MP, M. nigra (Xinjiang) is divided into a single branch, as the
most primitive type, while cultivated species such as Ukraine is the most diverged.
Key words: Morus; ITS, trnL-F, rps16 sequence; MP analysis; phylogeny relationship

0 引言
【研究意义】中国是桑属遗传多样性中心之一，
桑的种质资源极为丰富，研究桑种质资源 ITS、trnL-F、
rps16 序列，有助于阐明桑的系统发育与进化关系。【前
人研究进展】桑属的进化关系过去一直靠形态分类的
方法[1]，20 世纪 80 年代曾用同工酶的方法[2-9]，由于
植物同工酶多态性偏低，易受环境、取样部位和发育
阶段的影响，导致结果不稳定。自 20 世纪 90 年代后
开始采用分子系统学的方法[10-20]。桑属分子系统学研
究，向仲怀等[10]于 1995 年首次应用 RAPD 分子技术，
研究桑属 9 个种 DNA 多态性，并据此认为山桑（M.
bombycis）与鸡桑（M. australis）亲缘关系最近，广
东桑（M. atropurprea）与华桑（M. cathayana）亲缘
关系最近，奶桑（M. macroura）与白桑（M. alba）亲
缘关系最近，而川桑是最早分化出来的桑种。冯丽春
等[11]利用 RAPD 对桑属 12 个种、2 个变种进行了遗传
多样性分析，探讨了桑属的亲缘关系，认为川桑最原
始。杨光伟等[15]用 RAPD 和 AFLP 分析了桑属植物亲
缘关系，认为白桑、广东桑和鲁桑（M. multicaulis）
是比较进化的类群，川桑是最原始的类型。赵卫国等[17]
利用 RAPD 标记与微卫星 DNA，对桑属进行了研究，
认为蒙桑（M. mongolica）最原始。汪伟等[21]基于 trnL
内含子序列探讨了桑属 12 份材料的遗传距离，认为蒙
桑最原始。DNA 是遗传信息的载体，信息量大，所提
供的系统发育信息更具客观性[22]。桑 ITS 序列，史全
良等[23]报道蒙桑 ITS 序列长度为 558 bp，G+C 含量为
58.6%；赵卫国等[18]报道纳溪桑等的 ITS 序列为 551
—561 bp，G+C 含量为 58.61%—61.10%；陈仁芳等[24]
报道基本序列长度为 576 bp，变异范围为 576—590
bp，G+C 含量为 59.55%—62.25%。桑属 trnL-F，汪
伟等报道桑属 tRNA-Leu 内含子长度为 534—561 bp，
A+T 含量为 66.21%；赵卫国等[25]报道育 71-1、桑莲
的 trnL-F 基因间区长度为 414—417 bp，A+T 含量为
64.71%；汪伟等[21]报道桑属 rps16 内含子长度为 887
—922 bp，A+T 含量为 67.35%。【本研究切入点】前
人的研究由于取材的局限性，类型与数量不足，代表
性较窄，多以栽培种为种的代表，加之研究方法并非
为国际上通行的系统发育分析方法，所选片段也为单
一的片段，信息位点有限，研究结果仅部分具参考价
值。陈仁芳等[24]的研究由于只用了 ITS 序列，得到信
息位点有限，分支的客观性受到一定影响，未见用国
际上通行的系统发育分析方法，将多片段联合分析。
【拟解决的关键问题】本研究在前人研究的基础上，
选取不同来源、不同类型桑资源 67 份，并从 GenBank
下载桑属 ITS、trnL-F、rps16序列，用构树（Broussonetia
papyrifera）和柘树（Cudrania tricuspidata）为外类群，
计算 ITS、trnL-F、rps16 序列长度、G+C 含量、变异
位点、信息位点。分析 ITS、trnL-F、rps16 序列系统
学价值。将三片段合并，分析桑属种间的同源性，探
讨系统进化关系。
1 材料与方法
1.1 材料
材料取自西南大学、云南、广西、湖北桑资源圃
和昆明植物园，部分材料野外考察获得。外类群
（outgroup）为构树和柘树（表 1）。
1.2 DNA 提取
采用 CTAB 法[27]并稍加改进，从 0.15 g 左右硅胶
干燥桑叶中提取总 DNA，0.4%琼脂糖凝胶电泳，以
λDNA/HindⅢ marker 为标准，用紫外分光核酸测定仪
（GENEQUANT，Eppendorf，Gemany）检测浓度。
1.3 PCR 扩增
PCR 扩增反应体积为 20 μL，其中含 10 ng DNA
模板、50 ng 正反向引物、2.5mmol·L-1 的 dNTPs、
10×PCR buffer 和 5 U Taq DNA 聚合酶。ITS、trnL-F
序列的扩增程序为 94℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 1
min，72℃ 1 min，共 33 个循环；72℃ 7 min。rps16
序列的扩增程序为 80℃ 5 min；95℃ 1 min，50℃ 1
min，65℃ 4 min，共 30 个循环；65℃ 5 min。引物
根据中国科学院昆明植物研究所提供的GenBank序列
设计。扩增引物为 ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGT
8 期 陈仁芳等：桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列与进化分析 1555
表 1 材料来源
Table 1 Materials for study of phylogeny of Morus from different localities
编号
No.
材料名称
Material name
来源
Source
拉丁名称
Latin name
标本编号
Specimens
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67

68
69
昆明白桑 Kunming baisang
裂叶火桑 lieye huosang
四川鬼桑 Sichuan guisang
广东荆桑 Guangdong jingsang
荥经川桑 Yingjing chuansang
湖北蒙桑 1 号 Hubei mengsangNo.1
神农架蒙桑 Shennongjia mengsang
四川山白过渡 1 号 Sichuan shanbai transition No.1
神农架鸡桑 1 号 Shennongjia jisang No.1
新疆黑桑 Xinjiang heisang
四川山白过渡 2 号 Sichuan shanbai transition No.2
云南毛叶奶桑 Yunnan maoye naisang
四川花叶华桑 Sichuan cleft leaf huasang
珙县川桑 Gongxian chuansang
高海拔鸡桑雌 High altitude jisang♀
金佛山华桑 Jinfoshan huasang
四川长果桑 Sichuan changguosang
神农架山桑 Shennongjia shansang
神农架鸡桑 2 号 Shennongjia jisang No.2
高海拔鸡桑 2 号 High altitude jisang No.2
雅周桑 Yazhousang
天目山华桑 Tianmushan huasang
湖南华桑 Hunan huasang
沙二×伦 109 Sha er×lun109
贵州蒙桑 Guizhou mengsang
伦教 40 号 Lunjiao No.40
金佛山鸡桑 Jinfoshan jisang
四川华桑 Sichuan huasang
云南奶桑 Yunnan naisang
印度 55 India No.55
乌克兰 Ukraine
泰国桑 Thailandsang
川桑 24 Chuansang No.24
广西鸡桑 Guangxi jisang
越南白桑 Vietnam baisang
广西 772 Guangxi No.772
环江 1 号 Huanjiang No.1
钦州桑 Qinzhou sang
云南长穗桑 Yunnan changsuisang
改良鼠返 Gailiangshufan
昆明鬼桑 Kunming guisang
湖北山白过渡 1Hubei shanbai transition No.1
湖北蒙桑 3 号 Hubei mengsang No.3
湖北鬼桑 Hubei guisang
湖北鸡桑 Hubei jisang
湖北光叶华桑 Hubei smooth-leaved huasang
湖北蒙桑 4 号 Hubei mengsang No.4
湖北圆叶华桑 1 号 Hubei yuanye huasang No.1
湖北圆叶华桑 2 号 Hubei yuanye huasang No.2
湖北白桑 Hubei baisang
利川长穗桑 Lichuan changsuisang
湖北华桑 Hubei huasang
湖北全叶白桑 Hubei quanye baisang
湖北山白过渡 2 号 Hubei shanbai transition No.2
湖北全叶山桑 Hubei quanye shansang
龙桑 Long sang
斯里兰卡 1 号 Sri LankaNo.1
斯里兰卡 3 号 Sri LankaNo.3
钦州长果桑 Qinzhou changguosang
剑持 Jianchi
咸丰长穗桑 Xianfeng changsuisang
雅安白桑 Ya’an baisang
新疆白桑 Xinjiang baisang
神农架华桑雌 Shennongjia huasang♀
广东桑大十 Guangdong sangdashi
龙须桑 Longxusang
小官桑 Xiaoguansang
外类群 Outgroup
构树 Goushu
柘树 Zheshu
昆明 Kunming
浙江 Zhejiang
四川 Sichuan
广东 Guangdong
荥经 Yingjing
保康 Baokang
湖北 Hubei
四川 Sichuan
神农架 Shennongjia
和田 Hetian
四川 Sichuan
西双版纳 Xishuangbanna
四川 Sichuan
四川 Sichuan
四川 Sichuan
南川 Nanchuan
四川 Sichuan
神农架 Shennongjia
神农架 Shennongjia
四川 Sichuan
雅安 Ya’an
浙江 Zhejiang
湖南 Hunan
广东 Guangdong
贵州 Guizhou
广东 Guangdong
重庆金佛山 Chongqing jinfoshan
四川 Sichuan
云南河口 Yunnan hekou
印度 India
乌克兰 Ukraine
泰国 Thailand
四川 Sichuan
广西 Guangxi
越南 Vietnam
广西 Guangxi
广西 Guangxi
广西 Guangxi
云南 Yunnan
日本 Japan
昆明 Kunming
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
湖北 Hubei
罗田 Luotian
斯里兰卡 Sri Lanka
斯里兰卡 Sri Lanka
广西钦州 Guangxi Qinzhou
日本 Japan
湖北 Hubei
雅安 Ya’an
和田 Hetian
神农架 Shennongjia
广东 Guangdong
日本 Japan
重庆 Chongqing

重庆 Chongqing
昆明 Kunming
M. alba L.
M. mizuho Hotta.
M.mongolica var.diabolica Koidz.
M. atropurprea Roxb.
M. notabilis Schneid.
M. mongolica Koidz.
M.mongolica Koidz.
M. bombycis Koidz.
M. australis Poir.
M. nigra L.
M. bombycis Koidz.
M. macroura var. mawa Koidz.
M.cathayana Hemsl.
M. notabilis Schneid.
M. australis Poir.
M. cathayana Hemsl.
M. macroura Miq.
M. bombycis Koidz.
M. australis Poir.
M. australis Poir.
M. australis Poir.
M .cathayana Hemsl.
M. cathayana Hemsl.
M. atropurprea Roxb.
M. mongolica Koidz.
M .atropurprea Roxb.
M. australis Poir.
M. cathayana Hemsl.
M. macroura Miq.
M. alba L.
M. alba L.
M. alba L.
M. alba L.
M. australis Poir.
M. alba L.
M. alba L.
M. cathayana Hemsl.
M. alba L.
M. wittorum Handelb-Mazett.
M. alba L.
M. mongolica var. diabolica Koidz.
M. bombycis Koidz.
M. mongolica Koidz.
M. mongolica var. diabolica Koidz.
M. australis Poir.
M.cathayana Hemsl.
M. mongolica Koidz.
M. cathayana Hemsl.
M. cathayana Hemsl.
M .alba L.
M .wittorum Handelb-Mazett.
M. cathayana Hemsl.
M. alba L.
M. alba L.
M. bombycis Koidz.
M. alba var. Tortuosa
M. alba L.
M. alba L.
M. macroura Miq.
M. bombycis Koidz.
M. wittorum Handelb-Mazett.
M. alba L.
M. alba L.
M. cathayana Hemsl.
M. atropurprea Roxb.
M. alba var.pendula Dippel.
M. alba L.

B. papyrifera LHerit. Ex Vent.
C. tricuspidata Burex Lavallee.
XNS0256
XNS0258
XNS0058
XNS0157
XNS0022
XNS0078
XNS0065
XNS0067
XNS0068
XNS0218
XNS0069
XNS0070
XNS0201
XNS0071
XNS0072
XNS0073
XNS0074
XNS0017
XNS0076
XNS0077
XNS0078
XNS0080
XNS0082
XNS0083
XNS0084
XNS0088
XNS0093
XNS0097
XNS0288
XNS0259
XNS0260
XNS0261
XNS0098
XNS0100
XNS0264
XNS0103
XNS0105
XNS0106
XNS0372
XNS0107
XNS0109
XNS0110
XNS0111
XNS0112
XNS0113
XNS0114
XNS0115
XNS0116
XNS0117
XNS0118
XNS0119
XNS0120
XNS0121
XNS0122
XNS0123
XNS0057
XNS0052
XNS0095
XNS0099
XNS0277
XNS0125
XNS0059
XNS0066
XNS0181
XNS0094
XNS0013
XNS0002

XNS0277
XNS0007
1556 中 国 农 业 科 学 44 卷
AACAAGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATG
C-3′；trnL-F-c：5′-CGAAATCGGGTAGACGCTACG
-3′；trnL-F-f：5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′；
rps16-F：5′-GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT-3′，rps16-
R2：5′-TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC-3′。扩增产物
用 Microcon YM100 柱（Millipore 公司）纯化，并调
整 DNA 浓度，送往上海生工生物工程技术服务有限
公司测序。
1.4 数据分析
测序结果采用 Sequencher4.1.4 软件进行拼接；用
ClustalX1.83c 软件比对，根据 GenBank 已发表的鲁桑
（AM042003）18S rRNA 基因 3′端、26S rRNA 基因 5′
端序列和无花果（Ficuscarica cultivar，EU191024）
tRNA-Leu 上游 3′端、tRNA-Leu基因、tRNA-Phe5′端
序列及白桑（EF687683）rps16 基因内含子上游 3′端、
下游 5′端序列，分别确定本试验各材料的 ITS、trnL-F、
rps16 序列范围，并从 GenBank 下载桑属 ITS、trnL-F、
rps16 序列，DNAstar 软件分析同源性、序列长度、
G+C（A+T）含量及变异位点；PAUPVersion4.0b10
软件MP法分析信息位点（informative），并与Modeltest
V3.06[28]软件配合使用，测定碱基进化模型，即可能
的分支概率（hierarchical likelihood ratio，hLRTs）—
混合卡方概率值（mixed chi-square distribution），以
决定 3 个片段是否能合并；将 3 个片段合并后，计算
进化模型、基于模型，用 MP 法分析进化关系。
2 结果
2.1 桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列的同源性及遗传
分歧
用 DNAStar 软件对从 GenBank 下载桑属大叶白
桑（AY345148）等 17 份 ITS 序列、鲁桑（AY271293）
等 27 份 trnL-F 序列、鲁桑（EF687683）等 19 份 rps16
序列及本试验的 67 份材料进行同源性百分比差异和
遗传分歧分析，结果表明，桑属 ITS 序列的同源性
（ percentidentity ）约为 88.1% ，最大遗传分歧
（divergence）为 7.4；trnL-F 序列的同源性约为 94.3%，
最大遗传分歧为 3.7；rps16 序列的同源性约为 90.3%，
最大遗传分歧为 1.2（表略）。
2.2 ITS、trnL-F、rps16 序列的长度、G+C(A+T)含
量、变异位点和信息位点
用 DNAstar 软件对 67 份桑属材料和外类群构树
与柘树进行各序列长度、G+C（A+T）含量和变异位
点分析，PAUPVersion4.0b10 软件 MP 法分析信息位
点（表 2），ITS 序列继陈仁芳等[24]报道后再次确认，
基本序列长度为 576 bp，变异范围为 576—590 bp，
G+C 含量为 59.55%—62.25%，序列比对发现 116 个
变异位点，经 MP 法分析，有 40 个信息位点；trnL-F
序列（包括 tRNA-Leu 内含子）的基本序列长度为 923
bp，变异范围为 920—924 bp，A+T 含量为 65.87%—
66.31%，其中，tRNA-Leu内含子为 487 bp，tRNA-Leu
基因为 69 bp，供试的 67 份桑属材料均相同，碱基排
列为 5′-GTAAGAGGAAAATCCGTCGACTTTAAAA
ATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAATCC
CCAAAAAG-3′，trnL-F 序列为 374 bp。有 24 个变异
位点，23个信息位点；rps16的基本序列长度为 929 bp，
变异范围为 923—929 bp，A+T 含量为 67.28%—
67.49%，有 42 个变异位点，17 个信息位点。
2.3 基于 ITS、trnL-F、rps16 桑属分支进化关系
用 PAUPVersion4.0b10 软件和 Modeltest V3.06[28]
软件计算 67 份桑属材料和外类群构树与柘树的 ITS、
trnL-F 、 rps16 序列最适碱基进化模型分别为
（GTR+G）、（GTR）和（GTR+G），可能的分支
概率，即混合卡方概率值分别为 0.000001、0.027175
和 0.000222，说明序列可以合并。将 3 个片段合并后，
采用 MP 法分析获得进化分支图。树长（tree length）
402，一致性指数（consistency index，CI）为 0.9564，
保持性指数（retention index，RI）为 0.8819，调整后
的一致性指数（rescaled consistency index，RC）为
0.8435。共 2 538 个位点，其中包括 2 197 个不变位点、
261 个变异非信息位点，80 个信息位点。从图中可以
看出，以靴带（bootstrap）支持率为 100%将外类群与
桑属分开。在桑属内，首先将黑桑（Morus nigra）分

表 2 桑属 ITS、trnL-F、rps16 长度、G+C(A+T)和变异位点
Table 2 Morus ITS, trnL-F, rps16 sequence length, G +C (A+T) content and variable sites
序列 Sequence 长度 Length (bp) G+C/A+T (%) 变异位点 Variation locus 信息位点 Informative
ITS
trnL-F
rps16
576—590
920—924
923—929
G+C 59.55—62.25
A+T 65.87—66.31
A+T 67.28—67.49
116
24
42
40
23
17
8 期 陈仁芳等：桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列与进化分析 1557

分支下面括弧内的数值为树长 Brackets below the number of branches of a tree length

图 基于 ITS、trnL-F、rps16 桑属 MP 分支图
Fig. Morus MP cladogram based on ITS, trnL-F, rps16 sequence
1558 中 国 农 业 科 学 44 卷
出，树长 191，其它桑种分成 2 支，靴带支持率为 89%。
第一支包括长穗桑（Morus wittorum）、瑞穗桑（Morus
mizuho）、蒙桑（Morus mongolica）、鬼桑（Morus
mongolica var. diabolica）、鸡桑（Morus australis）、
山桑（Morus bombyci）、白桑（Morus alba）和广东
桑（Morus atropurprea），树长 382—402。第二支包
括华桑（Morus cathayana）、奶桑（Morus macroura）、
毛叶奶桑（Morus macroura var. Mawa）、川桑（Morus
notabilis），树长 386。在第一支中，首先分出靴带支
持率为 87%的咸丰长穗桑和利川长穗桑，树长 382，
紧接着分出靴带支持率为 51%的斯里兰卡 3 号和钦州
长果桑，树长 383。雅安白桑和神农架山桑为第一支
的底层，树长 383—384；乌克兰、小官桑、改良鼠返、
剑持、龙须桑（Morus alba var. pendula）、新疆白桑、
龙桑（Morus alba var. Tortuosa）、印度 55 等栽培种
在项层，树长 398—402。利用 NJ 法、ML 法和 Bayesian
法分析，同样得到类似结果（图略）。
3 讨论
3.1 桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列研究现状与前人
的比较
史全良等[23]报道蒙桑 ITS 序列长度为 558 bp，
G+C 含量为 58.6%，赵卫国等[18]报道纳溪桑、牛耳桑、
珙县黑油桑、纹契桑、伦教 40 号、剑持、德江 10 号
奶桑、吉蒙桑、有毛岩桑、泰国暹罗桑、黔鄂桑 1 号、
贵 14 号长穗桑和四川雅安插桑的 ITS 序列为 551—
561 bp，G+C 含量为 58.61%—61.10%。本研究继陈仁
芳等[24]报道后，再次确认基本序列长度为 576 bp，变
异范围为 576—590 bp，G+C 含量为 59.55%—62.25%，
与前人报道有一定差异，可能是由于取材不同，或确
定序列长度的标准不同造成的。
本试验共用桑属材料 67 份，序列比对共 116 个变
异位点和 40 个信息位点，与陈仁芳等[24]报道的 166
个变异位点和 19 个信息位点有一定的差异，原因是由
于本试验用 DNAstar 软件确定的变异位点，信息位点
与材料多少和外类群有关。报道的序列同源性约为
88.1%，最大遗传分歧为 7.4，主要是增加了从 GenBank
下载的 17 份桑属 ITS 序列。
汪伟等[21]于 2008年报道桑属 tRNA-Leu内含子长
度为 534—561 bp，A+T 含量为 66.21%；赵卫国等[25]
于 2002 年报道育 71-1、桑莲的 trnL-F 基因间区长度
为 414—417 bp，A+T 含量为 64.71%。本研究 trnL-F
基因间区（包括 tRNA-Leu 内含子）的基本序列长度
为 923 bp，变异范围为 920—924 bp，A+T 含量为
65.87%—66.31%，tRNA-Leu内含子长度为 487 bp，
tRNA-Leu基因长度为 69 bp，trnL-F 基因间区长度为
374 bp，与汪伟等的报道基本一致；与赵卫国等报道
有一定差异，这可能是由于确定长度的标准不同引起
的。本研究报道了桑属 trnL-F 序列的同源性约为
94.3%，最大遗传分歧为 3.7。
汪伟等[26]于 2008年报道桑属 rps16内含子长度为
887—922 bp，A+T 含量为 67.35%。本文报道的 rps16
基本序列长度为 929 bp，变异范围为 923—929 bp，
A+T 含量为 67.28%—67.49%，与汪伟等报道的结果
基本一致，但不同材料稍有差异。本研究报道桑属
rps16 序列的同源性约为 90.3%，最大遗传分歧为 1.2。
核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacers，
ITS）是分子系统学应用最广泛的核 DNA 序列[29]，在
被子植物中具有丰富的变异，但相对长度具有保守性，
适合用于低分类群的系统发育研究[30-33]。trnL-F 为编
码转运 RNA（transfer RNA）的 trnL 至 trnF 间区。位
于 cpDNA 大单拷贝区，trnL 中间被一长度为 250—
1 400 bp 的内含子分为 2 部分[34]，trnL 在结构上与 trnF
相邻，两者间有一长为 100—500 bp 的基因间区，这 2
个非编码区拥有丰富的信息位点，适合近缘科间、属
间、属下种间甚至居群水平系统重建[35-36]。rps16 是编
码核糖体蛋白 16S 小亚基基因，也是位于 cpDNA 大
单拷贝区，其内含子具有解决属间系统发育的能力
[37-39]。本研究发现，桑属 ITS 序列变异与生活型有关，
如能形成高大乔木的华桑、奶桑、川桑，具有共同的
变异；trnL-F 序列有 24 个变异位点，发生在少数几条
序列上，有 23 个信息位点，其中也包括柘树、构树外
类群变异的信息位点；rps16 序列有 42 个变异位点，
发生在少数几条序列上，有 17 个信息位点，同样包括
柘树、构树变异的信息位点。总之 trnL-F、rps16 序列
变异很小，往往与所处生态环境有关，即同一地区采
集的材料，往往具有相同的变异。在计算各序列的信
息位点时发现，trnL-F、rps16 序列信息位点不够，单
独进行系统学研究价值不大。
3.2 基于 ITS、trnL-F、rps16 桑属 MP 法分支进化与
陈仁芳等[23]报道的基于 ITS 贝叶斯（mrbayes）
分支进化关系的比较
基于 ITS、trnL-F、rps16 桑属 MP 法分支进化关
系，所用材料是陈仁芳等 [24]报道基于 ITS 贝叶斯
（mrbayes）分支进化关系的基础上，减少 trnL-F 和
rps16 的 PCR 扩增、测序未成功的材料，共用材料 67
8 期 陈仁芳等：桑属 ITS、trnL-F、rps16 序列与进化分析 1559
份，比陈仁芳等[24]的报道少了 6 份材料，但代表桑属
白桑及变种龙桑、龙须桑、瑞穗桑、蒙桑及变种鬼桑
广东桑、川桑、山桑、鸡桑、黑桑、奶桑及变种毛叶
奶桑、华桑、长穗桑等 11 个桑种，4 个变种（Koidz
分类系统），基本代表了陈仁芳等[23]基于 ITS 贝叶斯
（mrbayes）分支进化关系的类型，由于增加了 trnL-F、
rps16 序列，使分支图总位点（total characters）、信
息位点（informative）增加（表 3）。

表 3 2 次分支图参数比较
Table 3 Comparison of the two branches of matrix parameters
参数
Parameter
树长
Tree length
一致性指数
CI
保持性指数
RI
调整后的一致
性指数 RC
总位点
Total characters
不变位点
Constant
变异非信息位点
Uninformative
信息位点
Informative
132 0.9621 0.9123 0.8777 597 477 101 19 分支图
Branching diagram 402 0.9564 0.8819 0.8435 2538 2197 261 80
差异 Difference 270 -0.0057 -0.0304 -0.0342 1941 1720 160 61

ITS、trnL-F、rps16 3 个序列合并后，树长增加，
一致性指数、保持性指数、调整后的一致性指数降低，
原因是由于本研究用的外类群是构树和柘树，而在陈
仁芳等[24]报道时所用外类群是非洲硬木树（Milicia
excelsa，MEU93585）和新西兰鹊肾树（Streblus glaber，
DQ499105）。总位点数、不变位点数、变异非信息位
点数和信息位点增高是由于增加了 trnL-F 和 rps16 序
列及试验用了构树和柘树作外类群。
不同的分支分析方法或增加片段，分支图肯定会
有一定的差异，但就分析某一物种，其基本进化规律
是一致的。如分支图以靴带支持率 100%将外类群与
桑属分开；在桑属内首先将黑桑分出，靴带支持率为
89%，说明黑桑与其它桑种明显不同，遗传特性接近
外类群，根据外类群确定法，是最原始类型。将其它
桑种分成 2 支，将咸丰长穗桑与利川长穗桑分在第一
支，说明长穗桑亲缘关系更近于桑（mulberry）。但
在这一分支中首先被单独分出，靴带支持率为 87%，
这又说明长穗桑与该支的其它桑（mulberry）又有较
大差异。第一、二支靴带支持率均未超过 50%，说明
桑属种间有较近的亲缘关系，不易区分。桑属属于风
媒传播、异花受粉植物，普遍的自然杂交，使种间界
限模糊，这样的分支更接近似然。乌克兰、小官桑、
改良鼠返、剑持、龙须桑、新疆白桑、龙桑、印度 55
和广东桑大十等栽培种分在树枝的项端，是进化类型，
但要注意，其进化是一种人为干预（人为杂交选拔）
的进化，分析系统进化关系时要排出干扰。第二支分
歧时间较早，但现代类型进化程度与湖北全叶白桑、
泰国桑等相近，属较较进化类型。第一支中的利川长
穗桑、咸丰长穗桑、钦州长果桑和斯里兰卡 3 号也有
同样情况，现代类型进化程度与最进化的乌克兰、小
官桑相同。
本次试验中，钦州长果桑、四川华桑、金佛山华
桑和云南长穗桑等特殊变异材料分支的异常，属于材
料的个体变异，在陈仁芳等[24]报道中已有解释。
4 结论
桑属 trnL-F 和 rps16 序列信息位点有限，单独对
桑属进行系统学研究价值不大，与 ITS 序列合并研究，
则能提高分支图的信息位点，使分支图更具客观性，
更接近似然。基于 ITS、trnL-F、rps16 序列 MP 分支
图，可将新疆黑桑单独分为一支，为最原始类型，其
它桑种分为 2 支，乌克兰等栽培种为进化类型。

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（责任编辑 李 莉）