全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2010, 22:45-48, 92
文章编号:1001-6880(2010)01-0045-05
　
　
　收稿日期:2009-06-23　　　接受日期:2009-09-04
　基金项目:辽宁省大学生课外学术科技作品竞赛项目;大连医科大
学大学生科技活动项目
＊通讯作者 Tel:86-411-86110296;E-mail:windwaver2000@yahoo.
com.cn
自养小球藻多糖对人肝癌细胞 SMMC-7721凋亡的诱导
徐韬钧 ,张翠丽 ,张　瑜 ,崔琳琳 ,崔美美 ,辛　毅 ,王　亮＊
大连医科大学生物技术专业 ,大连 116044
摘　要:应用超声破碎碱提法制备自养小球藻多糖。在体外培养条件下 , 用不同浓度的小球藻多糖处理肝癌细
胞 , 并通过 MTT,双苯并咪唑(Hoechst33258)染色 , 免疫细胞化学等方法检测。结果表明 , 1 g/L的小球藻多糖
作用肝癌细胞 SMMC-7721 12 h, 对其增殖有显著抑制作用 , 且能通过下调抗凋亡蛋白 Bcl-2及上调凋亡执行蛋
白 Capase-3的表达来诱导其发生凋亡。
关键词:自养小球藻;多糖;肝癌细胞;凋亡
中图分类号:Q58;R285 文献标识码:A
InductionofApoptosisofSMMC-7721Celsby
PolysaccharidefromChlorelaautotropica
XUTao-jun, ZHANGCui-li, ZHANGYu, CUILin-lin, CUIMei-mei, XINYi, WANGLiang＊
Bio-technologyDepartmentofDalianMedicalUniversity, Dalian116044 , China
Abstract:TodeterminetheefectsofpolysaccharideofChlorelaautotropica(PCA)onthegrowthandapoptosisof
SMMC-7721 cells.ThePCAwaspreparedbyultrasonicdisruptionandalkaliextraction.Humanhepatomacellculture
wastreatedwiththreeconcentrationsofPCA, andtheactivitiesofPCAweredetectedbyMTT, fluorescencedyeHoechst
33258 stainingandcelimmunohistochemistry.AftertreatedwithPCA(1g/L)for12h, theproliferationofSMMC-7721
wassignificantlydownregulated, andapoptosiswasinduced.
Keywords:Chlorellaautotrophica;polysaccharide;hepatomacells;apoptosis
　　自养小球藻 (Chlorelaautotropica)是一类普生
性单细胞绿藻 ,属于绿藻门(Chlorophyta)绿球藻目
(Chlorococcales)卵囊藻科 (Oocysteceae)小球藻属
(Chlorela),是一种广泛分布的海洋微藻。小球藻
具有丰富的药用和营养价值 ,具有抗肿瘤 、抗菌 、抗
病毒及增强免疫功能等生理活性 ,有 “药物藻类 ”之
美誉 [ 1-4] 。它与螺旋藻 、盐藻 、栅藻等微藻的开发利
用一起构成了微藻生物学(Microalgalbiology),是目
前国内外研究开发的热点 [ 5, 6] 。
多糖约占小球藻干重的 50%以上。小球藻在
其生长繁殖过程中能产生结构独特的多糖 ,是一类
潜在的药用海洋生物资源[ 7] 。研究表明 ,天然产物
中的多糖具有抗肿瘤作用 ,且毒副作用小 ,在肿瘤防
治过程中发挥着日益重要的作用 。但是 ,目前自养
小球藻多糖(PolysaccharideofChlorelaautotropica,
PCA)诱导肿瘤细胞凋亡的研究还未见报道。为了
进一步展开 PCA生物活性的研究 ,本实验以人肝癌
细胞 SMMC-7721为靶细胞 ,探讨 PCA对肿瘤细胞
增殖及凋亡的影响 ,希望能为其开发利用提供更具
体的实验依据 。
1　材料和方法
1.1　材料及试剂
自养小球藻(Chlorelaautotropica)由辽宁省海
洋水产科学研究院鉴定并惠赠;人肝癌细胞 SMMC-
7721由辽宁师范大学省分子生物学重点实验室馈
赠;Bcl-2/Caspase-3抗体(SantaCruzBiotech, USA);
Hoechst细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有
限公司);细胞免疫组化试剂盒(天津市灏洋生物制
品科技有限责任公司);96孔板 、12孔板 、6孔板
(NUNC,丹麦);胰蛋白酶 、RPMI-1640培养基 、小牛
血清等均为美国 ThermoScientificHyClone产品;四
甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美
国 Sigma公司;95%乙醇 、甲醇 、三氯乙酸(TCA)、丙
DOI :10.16333/j.1001-6880.2010.01.039
酮 、氢氧化钠 、磷酸二氢钾等化学试剂均为国产分析
纯 。
1.2　主要仪器和设备
酶标仪(Thermoelectroncorporation, USA);倒置
显微镜 (Nikon, 日本 );荧光显微镜 (Olympus, 日
本);CO2孵箱(ThermoLabsystems, USA);真空冷冻
干燥机(北京博医康);超声细胞破碎仪(宁波新芝
生物科技股份有限公司);高 、低速离心机 (科大创
新)。
1.3　实验方法
1.3.1　自养小球藻的人工培养
海水经过滤 ,煮沸消毒 ,减少的体积以蒸馏水补
齐 。按 F/2[ 8]改良配方法配制营养盐 ,将一升藻种
扩大至十升于锥形瓶中室温条件下培养。每天摇振
三次 ,光暗周期 12 h:12h,每隔 24 h以血球记数板
在显微镜下计数 ,作生长曲线[ 9] 。
1.3.2　PCA的提取
当小球藻处于对数生长末期时离心(4500 r/
min, 10 min)收集藻泥 ,在 60 ℃下恒温干燥至恒重 ,
研磨成均匀粉末状 ,称重。于 4 ℃下保存备用 。将
小球藻干粉以物料比 1:25加入 4% NaOH溶液中 。
冰水浴超声破碎三次 ,每次 10 min,超声功率 300
W,频率 20kHz,超声脉冲持续时间 10s,间隔时间 5
s。然后 80℃水浴加热 1h,立即离心(4500 r/min,
15 min)取上清液 ,沉淀回收 。上清液为多糖粗提
液 ,加 3%TCA除蛋白 ,离心加入 3倍体积的 95%乙
醇沉淀过夜 ,离心即得粗多糖[ 7, 10] 。真空干燥称重 。
上清液回收 ,旋转蒸发至原体积 1/3,按照上述方法
进行二次提取 。最后将小球藻多糖用含 10%小牛
血清 RPMI-1640配置成合适浓度 ,滤菌备用。
1.3.3　MTT法检测 PCA对体外肝癌的抑制作用
将 0.25%(质量分数)胰蛋白酶消化单层培养
的 SMMC-7721细胞用含 10%(体积分数)小牛血清
的 RPMI-1640培养液配成单细胞悬液 ,接种于 96孔
板上(1×104个 /孔),然后置于 5%CO2培养箱中于
37 ℃培养 24 h后 ,吸出培养液;再在每孔中加入培
养液和事先配置好的多糖溶液混合溶液共 200 μL,
多糖的终浓度分别为 0.5、1、10 g/L(每个浓度平行
3个孔),以完全培养液作空白组 ,培养 8、12、16、24、
48 h后各取 1板 ,每孔加入 MTT(5g/L)20μL,继续
培养。 4 h后用 200 μLDMSO溶液终止培养 ,用全
自动酶标仪于 490 nm处测定吸光值 , 计算抑制
率 [ 11] 。
1.3.4　凋亡细胞的双苯并咪唑(Hoechst33258)染
色
本实验采用 Hoechst细胞凋亡试剂盒对 PCA诱
导的 SMMC-7721人肝癌细胞凋亡进行测定。首先
将 SMMC-7721(5×105个 /孔)接种于放置在 6孔板
中的灭菌盖玻片上培养 24 h;然后加入一定浓度的
PCA进行细胞凋亡的诱导 , PBS洗三次 ,每次 5 min;
固定液中固定 5 min;4℃冷丙酮固定 ,以 DNA结合
荧光染料 Hoechst33258染色 10 min;用荧光显微镜
对细胞核形态进行观查并拍照[ 12] 。
1.3.5　细胞免疫化学检测
按照上述方法消化 SMMC-7721细胞 ,每孔以相
同密度加入 1 ml细胞悬液于 12孔板中进行细胞爬
片。培养 24h后 ,分别加适合浓度的 PCA,使每孔
中多糖终浓度为 1.0 g/L。空白对照组加等体积的
RPMI-1640培养基。继续培养 12 h后 ,将细胞爬片
取出 ,冷 PBS冲洗三次。 4 ℃冷丙酮固定。分别滴
加 Bcl-2 /Caspase-3抗体 ,按照细胞免疫组化试剂盒
说明进行操作 ,显微镜下观察拍照 [ 13, 14] 。
2　结果与讨论
2.1　自养小球藻的生长曲线
自养小球藻的人工培养受多种因素影响 ,其中
温度和光照是影响因素之一 。本实验所培养自养小
球藻最大浓度约为 5 ×107个 /mL。其生长曲线如
图 1所示 。
图 1　自养小球藻(Chlorellaautotrophica)生长曲线
Fig.1　ProductionofChlorellaautotrophica
2.2　MTT法检测 PCA对人肝癌细胞 SMMC-7721
增殖的抑制作用
与空白对照组相比 ,多糖 1.0 g/L处理组 A490
值明显降低 ,表明其对 SMMC-7721增殖抑制作用显
著(P<0.01)。其多糖的作用呈现时间依赖的趋势
(如图 2)。当作用时间为 12 h, 1.0 g/LPCA对
SMMC-7721增殖的抑制作 用最强 , 抑制 率为
18.60%。当 PCA浓度为 0.5g/L时 ,其对人肝癌细
胞 SMMC-7721的增殖基本无抑制作用 ,且有微弱的
46 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22
促增值作用 。当 PCA浓度为 10g/L时 ,其能显著的
促进人肝癌细胞 SMMC-7721的增殖(见表 1)。这
可能是由于 PCA为混合杂多糖 ,在一定浓度范围
内 ,其生物学活性表现不同 。众所周知 ,多糖的活性
还经常会受到分子量 、硫酸根含量及糖链的组成和
结构等因素的影响 ,即使是单一的某种多糖也会在
不同浓度甚至相同浓度不同环境下表现出不同的活
性 。由此可见 ,这将为我们下一步从 PCA中分离肿
瘤细胞增殖抑制有效组分研究奠定了实验基础 。
表 1　PCA对人肝癌细胞 SMMC-7721的增殖的抑制的影响
(n=3, x±s)
Table1　EfectsofPCAontheproliferationofSMMC-7721(n
=3, x±s)
组别 Group A490
空白对照组 0.344±0.019
PCA0.5g/L处理组 0.337±0.021
PCA1.0g/L处理组 0.280±0.019■
PCA10g/L处理组 0.488±0.034
　　注:小球藻多糖处理 12h,与空白对照组■P<0.01。
图 2　不同时间对人肝癌细胞 SMMC-7721的增殖的抑制作
用
Fig.2　InhibitoryefectsontheproliferationofSMMC-7721on
diferenttimetreatedwiththe1g/LPCA
注:将人肝癌细胞 SMMC-7721按照 1×104个 /孔的密度接种于 96
孔板 ,用含 10% FBS的培养基培养 24h后 ,用 1g/LPCA处理 8,
12, 16, 24, 48h。然后 MTT作用活细胞 ,用 DMSO溶解产生的结晶-
甲臜。用酶标仪在 490nm下检测吸光值。 统计学分析:竖条信号
代表标准偏差。 ＊P<0.01。 Note:Cells(1×104 cels/wel)were
seededin96-welplatewithamediumsupplementedwith10% FBS
andincubatedfor24h.Cellswerethentreatedwith1g/LPCAfor8, 12,
16, 24, 48h.AndthenviablecelsweretrainedwithMTTandresulting
formazancrystalsweredissolvedwithDMSO.Theabsorbanceat490nm
wasmeasuredwithamultiscanplatereader.Statisticaltreatment:vertical
barsrepresentSD.＊P<0.01, n=3.
2.3　细胞凋亡检测(双苯并咪唑 Hoechst33258试
剂盒染色)
DNA结合荧光染料 Hoechst33258常用于凋亡
细胞核的确定。细胞发生凋亡时 ,染色质会固缩 。
所以 ,凋亡细胞在等渗条件下进行活细胞 Hoechst
染色时 ,其吸收 Hoechst的能力增强 ,细胞核会致密
浓染 ,产生较强蓝色荧光 ,其强度要比坏死细胞和活
细胞大得多。本实验采用 Hoechst细胞凋亡试剂盒
对 PCA诱导的 SMMC-7721凋亡进行检测 。如图 3
所示 ,未用 PCA处理的细胞 Hoechst33258染色淡
且均匀 ,细胞规则分布 (图 3A);而经 1.0 g/LPCA
作用 12 h的细胞核染色质超浓缩 ,在荧光显微镜发
出耀眼的蓝光 ,并且细胞明显皱缩成团(图 3B)。实
验表明 , PCA能够诱导人肝癌细胞 SMMC-7721发生
凋亡 。
图 3　自养小球藻多糖诱导 SMMC-7721细胞发生凋亡的细胞
核形态变化
Fig.3　PCAinducednuclearmorphologicalchangesinSMMC-
7721 apoptosiscels
注:SMMC-7721细胞核与 Hoechst33258(DNA荧光燃料)结合在奥林
巴斯显微镜 400倍放大观察。凋亡细胞的细胞核将被染成明亮的蓝
色 ,正常的细胞则被染上淡蓝色。 A:正常 SMMC-7721的细胞核;B:由
自养小球藻多糖处理 12h后发生凋亡的 SMMC-7721细胞核。结果显
示自养小球藻多糖诱导了核的浓缩 、凝集和片段化。 Note:SMMC-7721
nucleiwerestainedbyDNAbindingfluorescencedyeHoechst33258 and
examinedbyOlympusfluorescencemicroscopy(400×).Apoptoticcels
wouldbestainedintobrightlyblue, whilenormalcelswerestainedinto
slightlyblue.(A)SMMC-7721normalnuclei;(B)SMMC-7721apoptosis
nucleiinducedby1 g/LofPCAfor12h.ItshowsthatPCAinducedcon-
densed, coalesced, andsegmentednuclei.
2.4　细胞免疫化学检测凋亡蛋白的表达
在细胞凋亡过程中 ,往往是由于凋亡执行蛋白
和抗凋亡蛋白的表达发生了变化 ,因此本实验选取
了细胞凋亡中起关键作用的抗凋亡蛋白 Bcl-2与凋
亡执行蛋白 Caspase-3进行研究。 DAB显色后 ,如
图所示 , 1 g/LPCA处理 SMMC-7721 12 h后 ,抗凋
亡蛋白 Bcl-2与对照组(图 4A)相比表达量显著减
少(图 4B);而凋亡执行蛋白 Caspase-3的表达则正
好相反 ,其药物处理组(图 5B)的表达量显著高于对
照组(图 5A)。结果表明 , 1 g/LPCA诱导 SMMC-
7721发生了凋亡 。这为 PCA诱导肝癌细胞凋亡的
机制研究奠定了理论基础 ,也为海藻多糖药物开发
提供了理论支持。
47Vol.22 　　　　　　徐韬钧等:自养小球藻多糖对人肝癌细胞 SMMC-7721凋亡的诱导 　
3　小结
绿藻约有 350个属 , 5000 ～ 8000种。小球藻属
于绿藻门 ,绿藻纲 ,绿球藻目 ,藻科 ,小球藻属 ,其对
温度 、盐度等变化适应强 ,繁殖快 ,适合大规模养殖 ,
是第一种人工培养的海洋微藻 。因此加强对小球藻
多糖筛选的研究 ,可能发现结构新颖有显著生物活
性的多糖类化合物 。由于绿藻多糖大部分为杂多
糖 ,化学结构较复杂 ,国内大部分研究集中在对其提
取纯化方法 、化学组成等研究上 。研究表明 ,具有抗
肿瘤活性的多糖组分均具有 β-1, 3糖苷键和支链上
的 β-1, 6糖苷键 ,且硫酸根在多糖中占有一定的比
例 。此外 ,多糖的构型与其生物学活性也有很大关
系 ,发现:有生物学活性的多糖多为 β构型的呋喃
糖 ,但其具体作用机制不详。本实验研究了 PCA对
人肝癌细胞 SMMC-7721增殖及凋亡的影响 ,并对其
作用机制进行了初步探讨。结果表明 , 1 g/L的
PCA作用肝癌细胞 SMMC-7721 12h,通过下调抗凋
亡蛋白 Bcl-2及上调凋亡执行蛋白 Capase-3的表达
来诱导其发生凋亡 ,从而表现为 SMMC-7721增殖抑
制。这可能由于 PCA激活了细胞凋亡的信号通路
或者是抑制了细胞增殖的信号转导通路。 PCA诱
导肝癌细胞凋亡的实验研究 ,为抗肝癌药物的筛选
以及肝癌的治疗奠定了理论基础 。同时也为海洋微
藻多糖的研究开发提供了新思路 。
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(下转第 92页)
48 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.22
判断为芳环 C=C骨架振动 ,与 SiehrDJ[ 8]在文中提
到的结果相一致;1274 cm-1和 2926 cm-1吸收峰表明
有 CH2的不对称伸缩振动;1074 cm-1左右为酚或羧
基的 C-0的伸缩振动吸收峰 ,另外 3436 cm-1和 1637
cm-1附近出现强吸收说明可能含有吲哚基团 。
短梗霉黑色提取物在 3436cm-1(3 μm)和 1637
cm-1(6μm)处具有黑色素特征吸收峰[ 9] ,同时也证
实了此色素属黑色素类化合物。由于在 1637 cm-1
处有吸收峰并且色素还易溶于碱液 ,说明短梗霉黑
色素具有羧基基团 ,属于是一种有机弱酸性物质 。
不同来源的黑色素虽然在主要的官能团上基本相一
致 ,但具体结构还是有所差异 ,有待于进一步研究。
3　结论
3.1　短梗霉黑色素提取的最佳条件为温度为 70
℃、NaOH浓度为 1.5 mol/L、发酵液与浸提液之比
1:1(V), HCl沉淀时最佳 pH为 2 ～ 3。每 100mL发
酵液提取黑色素量为 2.2g/L。
3.2　综合短梗霉黑色素的紫外和红外光谱图分析
表明:此黑色素的特征吸收峰在 215 nm处 ,说明黑
色素可能含有苯环结构 ,结合红外光谱图中 1637、
1543和 1458 cm-1三处波峰进一步确定有芳香环存
在 ,并且在 3436cm-1处的宽峰说明分子间缔合为多
聚体;根据红外谱图在 3和 6 μm处有黑色素特征
吸收峰 ,可初步推断短梗霉胞内黑色提取物是一种
以芳香环为结构主体的异聚体黑色素。
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