全 文 ：＊浙江省中医药管理局资助项目 No.2003C124
青藤碱对肾小管上皮细胞MCP-1和 ICAM-1
基因表达的影响＊
杨汝春　王永钧　林京莲　朱晓玲　鲁　盈
(浙江省杭州市中医院肾病实验室·杭州 310007)
摘　要　目的:探讨青藤碱对体外培养的肾小管上皮细胞单核细胞趋化因子 1(MCP-1)和细胞间黏附分
子 1(ICAM-1)mRNA表达的干预作用。方法:体外培养小鼠肾小管上皮细胞株(MCT), 分为正常对照组 、
模型组和干预组 。模型组和干预组细胞予以 IL-1β(10ng/ ml)刺激 , 干预组细胞同时加不同浓度的青藤
碱 , 继续培养 48h , RT-PCR检测细胞MCP-1和 ICAM-1 mRMA的表达 , Quangtity One 1-D分析软件分析
积分光密度 , 计算MCP-1 和 ICAM-1 电泳条带的积分光密度和GAPDH 积分光密度的比值 , 用 SPSS 统计
软件进行统计分析。结果:IL-1β 可显著增强肾小管上皮细胞MCP-1 和 ICAM-I mRNA的表达 , 青藤碱
各个浓度均能显著下调MCP-1和 ICAM-1 mRNA的表达 , 并呈一定的剂量依赖性。 结论:青藤碱能显著
下调肾小管上皮细胞MCP-1和 ICAM-1 的mRNA 表达 ,提示其具有防治肾小管肾间质炎症损伤作用。
主题词　肾炎 , 间质性/中医药疗法　青藤碱/治疗应用　基因表达　体外研究
　　肾小管间质炎症病变促进肾间质纤维化的进程 , 单核细
胞尤其是T 淋巴细胞和巨噬细胞的浸润引起小管的损伤 ,最
终导致小管萎缩和间质纤维化。细胞间黏附因子(ICAM-1)
和单核细胞趋化因子(MCP-1)是诱导炎性细胞向肾间质组
织浸润和聚集的主要炎症分子 ,可加剧组织的损伤和延缓组
织的修复。最近研究发现肾间质中树突状细胞(DC)的聚集
也与 ICAM-1 和 MCP-1 有密切相关性[ 1] 。在多种病理条
件下 ,肾小管上皮细胞可表达 ICAM-1 和MCP-1 , 直接参与
肾小管间质的损伤[ 2] 。
青藤碱是从中药青风藤中提取的生物碱单体 , 具有抗
炎 、免疫抑制 、镇痛降压 、抗心律失常等药理作用[ 3] , 但对肾
脏固有细胞炎症因子的影响未作深入研究。 本研究采用 IL
-1β 刺激体外培养的肾小管上皮细胞 , 诱导 ICAM-1 和MCP
-1mRNA的高表达作为模型 , 研究青藤碱对两种炎症因子基
因表达的干预作用。
1　材料和方法
1.1　试剂与药品　青藤碱购自西安天成制药有限公司 , 纯
度99%以上 ,用三蒸水配成 100μmol/L , -20℃保存;rhIL-1β
购自北京宝赛生物技术公司 , TRIZOL、RT-PCR试剂盒 、琼脂
糖 、PCR扩增引物均由上海生物工程技术公司购买和合成。
1.2　小鼠肾小管上皮细胞的培养及处理　小鼠肾小管上皮
细胞株(MCT)由法国第七大学 Gerard F教授惠赠 , 用含 10%
胎牛血清的 DMEM/F12 培养液培养;将细胞用胰酶/EDTA消
化后 ,充分打匀 , 均匀传入细胞瓶 , 当细胞铺满瓶底 80%～
90%时 ,换 1%胎牛血清培养液同步 24h , 然后分组并按以下
条件刺激:正常组:DMEM/F12 培养液;模型组:DMEM/ F12 培
养液+IL-1β(10ng/ml);治疗组:DMEM/F12 培养液+IL-1β
(10ng/ml)+青藤碱 , 浓度分别为:10μmol/L、 100μmol/ L、
500μmol/L、1000μmol/ L等4 个浓度;继续培养 48 个小时后 ,
细胞用于 RNA 提取。
1.3　细胞中 RNA的提取　将细胞去上清 , 加 1mlTRIZOL将
细胞充分裂解后 , 转移至 1.5ml离心管中 , 加 200μl氯仿 , 震
荡 15s , 13000r/ min 离心 5min , 取上层转移至另一 1.5ml离心
管 , 加等量异丙醇 ,充分震荡混匀 , 室温静置 5min , 再 13000r/
min离心 5min ,去上清 , 用 70%的乙醇将沉淀洗 2 次 , 自然晾
干 , 然后用无 RNA 酶的无菌水将沉淀溶解。 紫外分光光度
仪 260nm测 OD值 ,计算浓度。
1.4　逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)　将提取好的 RNA
稀释至0.2μg/μl , 65℃温浴 5min , 马上置于冰上;配置反应混
合液:5×缓冲液 4μl , dNTP10nmol , T18 0.5μg , 逆转录酶 1μl ,
RNA酶抑制剂 1μl ,H2O 2μl ,共 10μl , 取 10μl准备好的 RNA与
之混匀 , 37℃1h。95℃5min , 将制备好的 cDNA置于冰上或-
30℃保存备用。PCR操作步骤为 , 配置反应混合液:10×缓冲
液 2.5μl ,MgCl2(25mmol/L)1.5μl , dNTP(10mmol/L)0.5μl , 上游
引物和下游引物各1μl , cDNA 模板 1μl , Taq 酶 0.3μl , H2O18μl ,
反应条件为:95℃5min , 95℃30S , 56℃30S , 72℃30S , 30 个循环;
72℃10min;用GAPDH 作内参照。 PCR产物在 1.7%的琼脂糖
凝胶上电泳 , Bio-Rad 紫外凝胶成像分析仪对电泳条带成
像 , 并保存;Quangtity One 1-D分析软件分析积分光密度 , 计
算 ICAM-1 和MCP-1电泳条带的积分光密度和 GAPDH 积
分光密度的比值 , 用 SPSS 统计软件进行统计 , 组间比较用 t
检验 。
引物序列如下:
GAPDH(307bp)上游:5 GCA GTG GCA AAG TGG AGA TTG 3
下游:5 GCA GAA GGG GCG GAG ATG AT 3
MCP-1(452bp)上游:5 ATG CAG GTC TCT GTC ACG CT 3
下游:5 TCA CAC TAG TTC TCT GTC ATA CT 3
·372· 中国中医药科技2005年 11 月第 12 卷第 6期 Nov.2005 Vol.12 No.6
ICAM-1(729bp)上游:5 CAC CCA GCA GAA GTT GTT TTG CT 3
下游:5 TAC ACA TTC CTG GTG ACA TTC C 3
2　结果
2.1　青藤碱对肾小管上皮细胞 MCP-1 mRNA表达的影响
IL-1β 可显著上调肾小管上皮细胞MCP-1 表达 , 与正
常组相比 , P <0.05;而青藤碱各个浓度(10μmol/ L、100μmol/
L、500μmol/ L、1000μmol/ L)均能显著下调 MCP-1的 mRMA表
达 , P<0.05 , 见附表 ,图 1
附表 青藤碱对肾小管上皮细胞MCP-1 mRNA表达的影响
组别 MCP-1/GAPDH
正常组 1.21±0.20
模型组 1.92±0.29■
青藤碱 10μmol/ L 1.50±0.19★
青藤碱 100μmol/ L 1.60±0.20★
青藤碱 500μmol/ L 1.49±0.31★
青藤碱 1000μmol/ L 1.33±0.18★
　　与正常组相比■P<0.05;与模型组相比★P<0.05
图 1　青藤碱对 MCT细胞株 MCP-1mRNA表达的影响
M:DNAmarker 1:对照组 2:模型组 3:青藤碱 10μmol/ L 组 4:青藤碱
100μmol/ L组 5:青藤碱 500μmol/ L组 6:青藤碱 1000μmol/ L组
2.2　青藤碱对肾小管上皮细胞 ICAM-1mRNA表达的影响
本实验在正常肾小管上皮细胞中没有观察到 ICAM-1
的表达;IL-1β 刺激可显著上调 ICAM-1 的 mRNA 表达;经
青藤碱干预后 , ICAM-1 的 mRMA 表达明显下调 , 且随着青
藤碱浓度的提高(500μmol/L、1000μmol/ L), ICAM-1的 mRMA
表达又消失 ,见图 2。内参照GAPDH mRNA表达见图 3。
图 2　青藤碱对MCT 细胞株 ICAM-1mRNA 表达的影响
图 3　细胞株实验各组GAPDH mRNA表达　　
3　讨论
肾间质纤维化是各种原因导致肾小管间质损伤病变的
最终结果 ,但其发病机制尚未完全阐明。肾小管上皮细胞是
肾间质中的重要成分 , 是肾脏主要固有细胞之一 , 不仅是肾
小管间质损害的直接受损者 , 而且可被巨噬细胞活化 , 分泌
细胞因子 、炎症介质 , 促进细胞外基质的分泌等[ 4] , 还表达主
要组织相溶性复合体二类分子(MHCⅡ), 共刺激分子 B7 和
ICAM-1 及MCP-1等 , 参与抗原递呈 , 激活 T 细胞 ,直接参
与免疫炎症反应和间质纤维化过程[ 5 , 6] 。目前认为 , 肾间质
炎细胞尤其巨噬细胞急性浸润是肾小管间质炎症病变及早
期损伤的主要原因。后者又是导致肾间质纤维化形成过程
的病理基础 ,而单核细胞趋化因子(MCP-1)介导的趋化作用
和细胞间黏附分子(ICAM-1)介导的细胞黏附机制是炎细胞
浸润 、积聚及其小管间质损伤的分子基础 , 在各种肾脏疾病
中 ICAM-1 和MCP-1 主要在肾小管中表达增高 ,与小管间
质巨噬细胞浸注呈高度相关性。
ICAM-1 通过介导细胞与细胞之间 , 细胞与细胞外基质
之间的相互黏附 ,促进炎性细胞活化及浸润 , 参与炎症反应 、
免疫识别及细胞跨膜启动信号传递。 ICAM-1 在正常肾脏
肾小球和肾小管细胞几乎无表达 , 但在各种肾炎和 IgA 肾
病[ 7] 、肾缺血性肾病 、狼疮肾 、过敏性紫癜等肾活检组织的毛
细血管的内皮细胞 、间质细胞 、浸润的炎症细胞和肾小管上
皮细胞中 ,特别在病变的肾小管上皮细胞上表达强烈 , 并且
与肾小管间质中浸润的单核细胞和巨噬细胞的数量明显相
关。 ICAM-1在肾组织中尤其在肾小管上皮细胞中的表达
和作用 ,可能是导致肾小管免疫病理损伤和疾病发展的重要
发病机制。
MCP-1 主要功能是趋化和激活单核/巨噬细胞 ,MCP-1
诱导单核细胞在肾小管间质聚集见于各种肾脏疾病。在高
脂血症大鼠 、单侧输尿管结扎(UUO)大鼠肾组织中 ,MCP-1
表达增高主要位于肾小管[ 8] 。除了趋化单核细胞外 ,MCP-1
还可能通过诱导巨噬细胞释放溶酶体 , 产生氧自由基以及表
达一些促炎因子来进一步加重组织的炎症反应 ,最新研究显
示 ,MCP-1可体外诱导肾小管上皮细胞分化 , 作为独立因素
参与肾间质纤维化的发展[ 9] 。
青藤碱是从中药青风藤根茎中分离提取的一种单体生
物碱 , 青藤碱具有镇痛 、抗炎 、抑制免疫 、降压及抗心律失常
等药理作用 ,临床上多用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫
性疾病 , 具有确切的疗效 , 且副作用小 ,病人的耐受性好 , 适
用于患者的长期用药 , 较中药雷公藤制剂具有一定的优点。
最近研究提示 , 青藤碱抗炎机理可能是抑制了组织细胞炎症
因子或介质的表达[ 10] 。青藤碱是一种新型的免疫抑制药物 ,
在治疗肾脏疾病也有很好的疗效[ 11] 。在 C-BSA 肾炎模型
中 , 青藤碱可显著降低循环免疫复合物(CIC)的形成 , 减轻免
疫损伤;降低血 BUN、Cr与 β2-MG 含量 , 改善肾功能;明显减
少炎性细胞浸润等[ 12] 。但没有对肾小管间质病变进行研究。
本项研究显示 ,青藤碱可显著抑制 IL-1β 诱导的小鼠肾
小管上皮细胞骨架蛋白α-肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白
(Vimentin)的蛋白和基因表达 , 说明青藤碱可体外抑制炎症
因子损伤引起的肾小管上皮细胞表型转化(另篇撰述)。同
时 青 藤碱 各 个 浓 度 (10μmol/ L、 100μmol/ L、 500μmol/ L、
1000μmol/L)均可显著下调 IL-1β 诱导的肾小管上皮细胞
MCP-1 的 mRMA 表达 , P<0.05。正常肾小管上皮细胞未见
ICAM-1的 mRNA表达。而 IL-1β 刺激后 , 肾小管上皮细胞
出现 ICAM-1 mRNA的表达 , 与文献报道相符。 IL-1β 刺激
·373·中国中医药科技 2005 年 11月第 12 卷第 6 期 Nov.2005 Vol.12 No.6
可显著上调 ICAM-1 的表达;经青藤碱干预后 , ICAM-1 的
mRNA表达明显下调 , 且随着青藤碱浓度的提高(500μmol/L、
1000μmol/ L), ICAM-1 的 mRNA 表达又消失。本研究提示 ,
青藤碱可能通过干预炎症损伤条件下的肾小管上皮细胞趋
化因子和黏附分子的表达 ,抑制单核细胞向肾小管间质的迁
移和黏附 , 或通过减少 MCP-1 等细胞因子的过表达而抑制
肾小管上皮细胞表型转化 , 从而延缓肾间质纤维化。 因此 ,
青藤碱在免疫抑制治疗方面是一种具有良好开发前景的自
然药物 ,而且在改善肾脏疾病的免疫性损伤和间质纤维化方
面将有很好的应用前景。
　　参考文献
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(修回:2005-04-04)
银杏叶提取物对肾缺血再灌注损伤家兔肾组织自由基系统的影响
张晶晶　魏洪起　史小琴　靳　 　王恩军　辛海涛　(河北职工医学院·保定 071000)
1　材料和方法
1.1　动物　健康日本大耳白家兔(由河北职工医学院动物室提供)
32只 ,体重 2.5～ 3.0kg ,雌雄各半(雌者无孕),随机分为 4组 ,每组 8
只 , 1组为假手术组 ,2组为缺血再灌注模型组 , 3组为小剂量银杏叶
提取物治疗组 , 4组为大剂量银杏叶提取物治疗组。
1.2　试剂和仪器　试剂:银杏叶提取物注射液由定州市中医院药剂
科提供 ,批号 20020912。SOD、GAH -PX、MDA:南京建成生物研究所
试剂盒。 SOD采用黄嘌呤氧化酶法 , MDA 采用 TBA 法 ,其它试剂均
为国产分析纯。主要仪器设备:低温冰箱 、电热恒温水浴箱 、离心机 、
722型分光光度计。
1.3　方法　所有家兔切除右肾 ,暴露左肾及左肾蒂 , 假手术组家兔
不夹闭左肾及左肾蒂 ,直接关腹。缺血再灌注模型组 、小剂量组 、大
剂量组均夹闭肾蒂 ,阻断左肾血流 60min ,然后松夹 ,关腹。所有家兔
于再灌注 2h后处死 ,取肾保存待用 , 其中小剂量组于术前给予银杏
叶提取物 15mg/ kg ,耳缘静脉注射(相当于成人推荐剂量 20倍), 1次/
天 ,连用 7天 ,于术前 10～ 20min给予银杏叶提取物同剂量耳缘静脉
注射 1次。大剂量组用药方法同小剂量组 , 但银杏叶提取物剂量为
25mg/ kg。将所取肾组织制成 10%匀浆 ,检测MDA、NO 含量及 SOD、
GSH-PX活性。
1.4　统计学处理　所有数据均以均数加减标准差( x±s)表示 ,用方
差分析及 q检验进行统计学处理 , P <0.05为有显著性差异。
2　结果　见表 1～ 2。
3　讨论　在缺血再灌注损伤中自由基起重要作用 ,介导整个损伤过
程。氧自由基对细胞的主要损害是造成脂质过氧化 ,其分解产物之
一便是 MDA ,MDA的产生与脂质过氧化相平行 ,因而测定 MDA 含量
可代表脂质过氧化产物的水平。而 SOD 和GSH-PX 的测定则代表
了机体清除自由基 ,保护组织免受损伤的能力。
表 1 各组肾组织 SOD、MDA含量的变化( x±s)
组别 n SOD(u/ml)　　左肾 　　右肾
MDA(nmol/ml)
　左肾 　右肾
假手术组 8 108.64±25.15 105.07±31.11 2.56±0.47 2.49±0.43
模型组 8 87.46±20.86＊119.92±24.21 3.90±0.77＊ 2.64±0.58
小剂量组 8 107.45±18.63■115.07±33.96■ 2.63±1.72■ 2.42±1.02
大剂量组 8 101.83±16.64■106.61±22.13■ 2.72±0.49■ 2.52±1.80
　　与右肾比＊P<0.05;与模型组比■P<0.05
表 2 各组肾组织GSH-PX、NO含量的变化( x ±s)
组别 n GSH-PX(μmol/L)　左肾 　右肾
NO(μmol/L)
　左肾 　右肾
假手术组 8 23.48±11.15 19.12±4.36 3.03±0.50 3.01±0.33
模型组 8 12.92±3.74＊18.80±4.70 1.38±0.65＊ 3.10±1.12
小剂量组 8 16.54±3.31■18.85±6.02 2.25±0.62■ 2.70±0.69
大剂量组 8 17.35±2.24■17.78±3.82 2.12±0.59■ 2.89±0.39
　　与右肾比＊P<0.05;与模型组比■P<0.05
银杏主要有效成分银杏叶提取物是一种高效的氧自由基清除
剂 ,可有效拮抗再灌注时氧自由基对细胞的损伤。本实验中 ,假手术
组左右肾之间及各组右肾各指标之间无显著性差异 ,说明银杏叶提
取物对正常家兔肾脏自由基的产生及清除无明显影响。 模型组
SOD、GSH-PX、NO含量左肾明显低于右肾, MDA含量左肾明显高于
右肾 ,说明缺血再灌注损伤确实使肾脏自由基的产生增多。肾缺血
再灌注动物应用银杏叶提取物后 ,虽然肾脏的损伤仍持续 ,但和模型
组比较 ,肾组织 SOD 、GSH-PX活性升高MDA含量降低 , 提示银杏叶
提取物能降低肾缺血再灌注所致的过氧化脂质的增高 ,提高清除氧
自由基的的 SOD、GSH-PX活性 ,明显提高肾缺血再灌注损伤家兔的
抗氧化能力。在此需特别提出的是:NO是一种常见的自由基 ,但其
本身亦有对抗自由基的作用。 (收稿:2004-08-23)
·374· 中国中医药科技2005年 11 月第 12 卷第 6期 Nov.2005 Vol.12 No.6