全 文 ：的制备及表征 ［J］． 中成药，2013，35(8) :1805-1808．
［11］ 何 兵，田 吉，刘 艳，等． HPLC测定 11 种中药挥发
油中桉油精的含量 ［J］． 药物分析杂志，2012，32(5) :
769-771．
基于 HepG2 体外细胞培养的旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺
黄一凡1， 王 帅1，2，3， 孟宪生1，2，3* ， 包永睿1，2，3
(1． 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600;2． 辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连
116600;3． 辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)
收稿日期:2014-12-19
基金项目:“十二五”“重大新药创制”科技重大专项 (2013ZX09507005)
作者简介:黄一凡 (1990—) ，女，硕士，研究方向为药物分析。Tel: (0411)85890185，E-mail:383539919@ qq． com
* 通信作者:孟宪生 (1964—) ，男，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析。Tel: (0411)
85890185，E-mail:mxsvvv@ 126． com
摘要:目的 优选旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺。方法 采用正交实验设计，对影响提取工艺的 3 个因素 (提取
时间、提取次数、乙醇用量)进行考察，以肿瘤抑制率为考察指标来优选最佳提取工艺。同时结合层次分析法，优选
以总黄酮含有量和出膏率为综合评价指标的权重系数及其范围，并采用 Pearson相关性分析对其进行验证。结果 最
佳工艺条件为 20 倍量 55%乙醇，回流提取 3 次，每次 1 h。以总黄酮含有量和出膏率为指标的综合权重系数范围为
0. 75 ～ 0. 90、0. 10 ～ 0. 25。结论 该优化工艺在保证药效的前提下，简化了考察指标，避免了复杂的操作，可为其他
中药材有效组分提取工艺的优选提供了思路和方法。
关键词:旋覆花;抗肿瘤;正交设计;层次分析;抑制率;权重系数
中图分类号:R284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2016)02-0450-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 02. 050
旋覆花为菊科植物旋覆花 Inula japonica Thunb． 或欧亚
旋覆花 Inula britannica L． 的干燥头状花序［1］，其化学成分
主要有黄酮类、倍半萜内酯类、三萜、甾体和挥发油成
分［2］，具有抗炎、保肝、抗肿瘤等多种生物活性。已有文
献报道，旋覆花的抗氧化活性与其含有的黄酮有关［3］，但
未见其抗肿瘤方面的相关报道。本实验基于 HepG2 细胞体
外药效实验，通过正交实验设计，以肿瘤细胞抑制率为指
标，对旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺进行筛选，并结
合层次分析法，优选可代替药效指标综合评分的权重系数，
为该植物的合理开发和利用奠定基础。
1 仪器和材料
UV-1750 紫外可见分光光度计 (岛津仪器苏州有限公
司) ;Sunrise 型酶标仪 (奥地利 Tecan 公司) ;UAIRETM
US Autoflow型 CO2 培养箱 (美国 Nuaire公司)。
旋覆花药材购自大连民大中药饮片有限公司，经辽宁
中医药大学翟延君教授鉴定为欧亚旋覆花 Inula britannica
L． 的干燥头状花序。芦丁 (含有量测定用，中国药品生
物制品检定所，批号 100080200707)。DMEM 培养粉、胰
蛋白酶、四甲基偶氮唑盐 (MTT)、胎牛血清 (美国 Gibco
公司) ;二甲基亚砜 (北京索莱宝科技有限公司) ;人肝癌
细胞株 HepG2 (大连医科大学)。所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 旋覆花总黄酮含有量的测定
2. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，加
甲醇制成每 1 mL含 0. 20 mg的溶液，即得。
2. 1. 2 检测波长的选择 取对照品溶液和正交试验中的 1
号样品溶液 (15 倍 55%乙醇提取 1 h 一次，总黄酮含有量
为 7. 246%)各 2 mL，置于 25 mL量瓶中，加入 5%亚硝酸
钠 (现配)1 mL，放置 6 min，再加入 10%硝酸铝溶液 1
mL，摇匀，放置 6 min，再加入 4%氢氧化钠 10 mL，加水至
刻度，摇匀，放置 15 min，以不加芦丁的试液为空白对照，
于 400 ～800 nm 处扫描。结果，对照品溶液和样品溶液均在
510 nm处有最大吸收，故确定 510 nm作为检测波长［4-5］。
2. 1. 3 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液 0、
1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0 mL，置于 25 mL 量
瓶中，按“2. 1. 2”项下方法操作，以芦丁的质量浓度为
横坐标 (X) ，吸光度为纵坐标 (Y)绘制标准曲线，回归
方程为 Y = 12. 41X + 0. 004 6，r = 0. 999 5，表明芦丁在
0. 012 ～ 0. 048 mg /mL范围内线性关系良好。
2. 2 HepG2 细胞培养与药效学检测
2. 2. 1 细胞培养 细胞株培养于含 10% 胎牛血清的
DMEM培养液中 (含青链霉素 100 U /mL) ，于 37 ℃、5%
CO2 培养箱内连续培养。细胞长满后，用 0. 25%胰蛋白酶
消化，传代培养。
054
2016 年 2 月
第 38 卷 第 2 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
February 2016
Vol． 38 No． 2
2. 2. 2 MTT法细胞抑制率检测 取处于对数生长期、生长
状态良好的 HepG2 细胞，用胰酶制成细胞悬液并计数，调
整细胞密度为 5 × 104 /mL，加入 96 孔培养板中，每孔 100
μL，于 37 ℃，5%CO2 饱和湿度下培养 24 h后，实验组加
入样品溶液 100 μL (每组设 5 个复孔) ，空白对照组加入
等体积的培养液。继续培养 24 h后，避光下每孔加入 MTT
溶液 (5 mg /mL)20 μL，继续孵育 4 h，弃除上清液，每
孔加入 DMSO150 μL，摇床上振摇 10 min后，于酶标仪 492
nm处测定吸光度 (A值) ，计算药物对细胞的增殖抑制率。
抑制率 = (1-试验组 A值 /对照组 A值) × 100%。
2. 3 提取工艺的考察
2. 3. 1 醇浓度单因素考察 对 0%、35%、55%、75%、
95%乙醇进行考察，其总黄酮含有量分别为 4. 71%、
6. 61%、7. 10%、6. 17%、2. 15%。结果表明，55% 乙醇
对旋覆花中总黄酮类成分的提取率最高，因此选用 55%乙
醇作为最佳提取溶剂。
2. 3. 2 提取工艺的正交实验设计 精密称取旋覆花粉末
10 g，以 55%乙醇为提取溶剂进行提取。选择提取时间、提
取次数、乙醇用量作为考察因素［6］，各因素取 3 个水平，以
细胞抑制率为指标，进行 L9(3
4)正交试验考察。称取 9 组
正交设计的提取物粉末 (相当于 0. 1 g 生药材)溶解，2‰
DMSO助溶，0. 22 μm 微孔滤膜滤过，作用于 HepG2 细胞，
以细胞抑制率为指标，优选提取工艺，结果见表 1和表 2。
表 1 正交试验设计及直观分析结果
编号
A
提取时间 /h
B
提取次数 /次
C
乙醇用量 /倍
D
空白
细胞抑制
率 /%
1 1 1 15 1 35. 19
2 1 2 20 2 65. 30
3 1 3 25 3 63. 14
4 2 1 20 3 34. 64
5 2 2 25 1 53. 33
6 2 3 15 2 38. 51
7 3 1 25 2 46. 24
8 3 2 15 3 43. 83
9 3 3 20 1 62. 88
K1 54. 543 38. 690 39. 177 50. 467
K2 42. 160 54. 153 54. 273 50. 017
K3 50. 983 54. 843 54. 237 47. 203
R 12. 383 16. 153 15. 096 3. 264
表 2 正交试验方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
提取时间 243. 872 2 12. 995 19. 000 —
提取次数 500. 521 2 26. 670 19. 000 *
乙醇用量 454. 714 2 24. 229 19. 000 *
误差 18. 77 2 — — —
注:F0 . 05 (2，2) = 19. 00;* P ＜ 0. 05
以细胞抑制率为指标，直观分析及方差分析影响提取
工艺的因素顺序为 B ＞ C ＞ A，其中提取次数 (B)、乙醇用
量 (C)对细胞抑制率影响较大，而且有显著性差异 (P ＜
0. 05)。另外，提取次数为 3 次时，已达到工厂日工作量，
因此不再增加提取次数，确定最佳提取次数为 3 次。由于
乙醇用量 (C)也是影响提取工艺的主要因素，故为验证
优选乙醇用量的准确性，在其他提取条件均为最优时，对
其进行单因素考察。
分别对 17. 5、20、22. 5 倍乙醇用量进行单因素考察，
发现细胞抑制率分别为 62. 79%、65. 17%、65. 19%，即乙
醇用量为 20 倍时，细胞抑制率明显高于 17. 5 倍，而与
22. 5 倍的抑制率相差不大。因此，从节约溶剂的角度考
虑，确定溶剂用量为 20 倍。
综上所述，筛选出的最佳提取条件为 A1B3C2，即 20
倍量 55%乙醇，回流提取 3 次，每次 1 h。
2. 4 层次分析法对总黄酮含量和出膏率权重系数的确定
以总黄酮含有量和出膏率为指标，评价旋覆花抗肿瘤有效
组分的提取工艺，建立评价目标树图，结果见图 1。
图 1 旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的评价目标树
通过比较同一层次目标 (即总黄酮含有量和出膏率)
的相对重要程度，构成一系列两两比较矩阵。通过 AHP软
件，计算权重系数随机一致性比率 CR (CR = CI /RI) ，其
可作为衡量所得权重系数是否合理的指标。通过软件，得
到 9 组 CR = 0. 000 0 ＜ 0. 1，即认为矩阵具有满意的一致性，
表明 9 组权重系数合理有效，可用于提取工艺优选的综合
评分中，见表 3。
表 3 两种指标在不同重要程度下的权重系数
程度评价
比较重要
同样重要
稍微重要
十分重要
绝对重要
总黄酮的权重系数 出膏率的权重系数
0. 833 3 0. 166 7
0. 166 7 0. 833 3
0. 500 0 0. 500 0
0. 750 0 0. 250 0
0. 250 0 0. 750 0
0. 875 0 0. 125 0
0. 125 0 0. 875 0
0. 900 0 0. 100 0
0. 100 0 0. 900 0
按照各指标不同的权重系数来计算综合评分，作为提
取工艺的评价指标，以“比较重要”为例 (总黄酮含有量
和出膏率的权重系数分别为 0. 833 3、0. 166 7、0. 166 7、
0. 833 3) ，实验设计和结果见表 4 和表 5［综合评分 1 = (总
黄酮含有量 /最大总黄酮含有量)× 0. 833 3 +(出膏率 /最大
出膏率)×0. 166 7;综合评分 2 =(总黄酮含有量 /最大总黄
酮含有量)×0. 166 7 +(出膏率 /最大出膏率)×0. 833 3) ］。
154
2016 年 2 月
第 38 卷 第 2 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
February 2016
Vol． 38 No． 2
表 4 正交试验设计及直观分析结果
编号
A B C D
提取时间 /h 提取次数 /次 乙醇用量 /倍 空白
总黄酮 /% 出膏率 /% 综合评分 1 综合评分 2
1 1 1 15 1 7. 246 17. 76 0. 803 6 0. 789 4
2 1 2 20 2 8. 314 20. 75 0. 924 8 0. 919 5
3 1 3 25 3 8. 977 20. 88 0. 987 3 0. 936 6
4 2 1 20 3 7. 675 19. 38 0. 855 4 0. 857 1
5 2 2 25 1 8. 265 22. 24 0. 931 3 0. 973 5
6 2 3 15 2 7. 935 20. 98 0. 891 3 0. 920 9
7 3 1 25 2 7. 765 21. 58 0. 880 0 0. 939 9
8 3 2 15 3 8. 160 21. 24 0. 914 1 0. 934 7
9 3 3 20 1 8. 958 22. 60 0. 998 2 0. 999 6
K1 0. 905 0. 846 0. 870 0. 911
K2 0. 893 0. 923 0. 926 0. 899
K3 0. 931 0. 959 0. 933 0. 919
R1 0. 038 0. 113 0. 063 0. 020
k1 0. 882 0. 862 0. 882 0. 921
k2 0. 917 0. 943 0. 925 0. 927
k3 0. 958 0. 952 0. 950 0. 909
R2 0. 076 0. 090 0. 068 0. 018
表 5 正交试验方差分析
因素
综合评分 1 综合评分 2
偏差平方和 F比 显著性 偏差平方和 F比 显著性
提取时间 0. 002 2. 000 — 0. 009 0. 001 —
提取次数 0. 020 20. 000 * 0. 015 0. 002 —
乙醇用量 0. 007 7. 000 — 0. 007 0. 001 —
误差 0. 00 — — 8. 27 — —
注:F0 . 05 (2，2) = 19. 00;* P ＜ 0. 05
以综合评分 1 为指标，直观分析及方差分析影响提取
工艺的因素顺序为 B ＞ C ＞ A，其中提取次数 (B)影响最
大，而且有显著性差异 (P ＜ 0. 05)。另外，提取次数为 3
次时已达到工厂日工作量，因此不再增加提取次数，确定
最佳提取次数为 3 次。另外，乙醇用量和提取时间无显著
性差异 (P ＞ 0. 05) ，而且 20 倍和 25 倍乙醇用量相差不大，
从节约溶剂角度考虑，确定乙醇用量为 20 倍;提取时间也
相差不大，因此为提高生产效率、节约成本，确定提取时
间为 1 h。综上所述，最佳提取条件为 A1B3C2，即 20 倍量
55%乙醇，回流提取 3 次，每次 1 h。
以综合评分 2 为指标，直观分析及方差分析影响提取
工艺的因素顺序为 B ＞ A ＞ C，各因素均无显著性差异
(P ＞ 0. 05)。从提高生产效率和节约溶剂角度考虑，优选
出的工艺条件为 A3B2C2，即 20 倍量 55%乙醇，回流提取 2
次，每次 3 h。
当总黄酮含有量和出膏率的权重系数分别为 0. 833 3、
0. 166 7 时，以综合评分与细胞抑制率为指标优选的最佳提
取条件一致，说明在此权重系数下，两者的综合评分可代
替抑制率，作为旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的考察指
标。当权重系数为 0. 166 7、0. 833 3 时，与以药效为指标
优选出的提取工艺不一致。
同时，对其它 7 组权重系数计算综合评分，进行正交
试验直观分析和方差分析，得到总黄酮和出膏率最佳的权
重系数范围分别为 0. 75 ～ 0. 90、0. 10 ～ 0. 25。在此权重系
数范围内，其综合评分可代替抑制率，作为提取工艺的考
察指标。
2. 5 验证试验 平行称取 3 份等量药材，按照优选出的最
佳提取工艺进行提取，按“2. 1”、“2. 2”项下方法验证提
取工艺的稳定性。结果，总黄酮含有量为 8. 952%、
8. 810%、 8. 783%， 出 膏 率 为 20. 87%、 21. 16%、
20. 17%，细胞抑制率为 63. 13%、65. 76%、66. 48%，3
项指标的 RSD分别为 1. 03%、2. 45%、2. 71%，说明优选
的提取工艺稳定可行，而且药效学结果稳定。
选取 2 个权重系数范围内外的数值，对其综合评分分
别与细胞抑制率进行 Pearson相关性分析［7-10］，确定权重系
数范围的准确性和合理性，结果见表 6。
表 6 权重系数范围验证结果
总黄酮含有量权重系数 出膏率权重系数
综合评分与细胞抑
制率的相关系数
0. 800 0 0. 200 0 0. 850 7
0. 200 0 0. 800 0 0. 684 9
由表可知，在确定的权重系数范围内，综合评分与细
胞抑制率的相关系数较大;在权重系数范围外，相关系数
较小，说明总黄酮含有量和出膏率的权重系数范围是合
理的。
3 讨论
旋覆花为常用的止咳化痰、降逆止呕中药，临床疗效
显著，同时具有抗炎、抗肝炎、抗肝损伤、抗肿瘤等多种
生物活性。由于文献并没有其在抗肿瘤有效组分提取工艺
方面的报道，因此本实验对其进行研究，为开发以旋覆花
为原料的，具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗癌
新药提供理论和实验依据。
中药化学成分复杂，每味中药相当于一个复方，包含
254
2016 年 2 月
第 38 卷 第 2 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
February 2016
Vol． 38 No． 2
各种化学物质组，其之间相互影响，同时各有效物质组内
单体成分之间也有相互影响，因此有效组分的含有量与药
效之间并不呈完全线性相关。若只单纯以有效组分或指标
性成分的含有量为提取工艺的考察指标，不能保证优选的
提取工艺所提组分的药效能够达到最佳，存在片面性;若
以细胞抑制率为评价指标，虽能保证提取工艺的药理药效，
但操作复杂、耗时。因此，本实验针对中药多组分、复杂
性的特点，运用多指标综合评价方法［11-14］中常用的层次分
析法，将旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的评价目标构成
单层次、两指标体系，在主观判断的基础上作进一步数学
处理，使其在权重系数的赋予上更加科学、合理，同时建
立总黄酮含有量、出膏率与药效的关联，即以抑制率为指
标的正交试验结果，优选代替抑制率的总黄酮含有量和出
膏率综合指标的权重系数及其范围。本实验筛选出影响评
价目标 (提取工艺)的主要和次要相关指标，避免了工业
生产中赋予权重系数的偶然性，不仅能确保提取工艺的药
理药效，还简化了考察指标，避免操作的复杂性，使优选
的工艺更加合理可行，为旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺
的优选提供方便。
通过 Pearson相关性分析，当总黄酮含有量和出膏率的
权重系数为 0. 80、0. 20 时，其与抑制率的相关系数为
0. 850 7;当两者为 0. 20、0. 80 时，相关系数为 0. 684 9。
由此可知，在确定的权重系数范围内，综合评分与细胞抑
制率的相关系数较大;在权重系数范围外，相关系数较小，
验证了综合评分权重系数范围的合理性，同时证明了总黄
酮含有量的相对出膏率更为重要，在合理的权重系数范围
内，其综合评分可代替药效指标，作为其抗肿瘤有效组分
提取工艺的评价指标。总黄酮含有量和细胞抑制率的相关
系数为 0. 862 5，两者呈一定的相关性，即量效关系，说明
总黄酮类成分为其抗肿瘤的有效组分。但量效关系并不为
函数关系 (完全相关) ，其影响因素很多，一方面可能由
于旋覆花中抗肿瘤有效组分种类复杂，黄酮类成分只是其
中一部分，同时药材中也存在抑制其发挥药效的成分;另
一方面，黄酮类成分是一类有效组分，不同单体对药效贡
献的大小不尽相同。当干膏中总黄酮的含有量升高时，发
挥药效与不起作用的单体成分含有量的变化不一致，因此
总黄酮的含有量与药效的量效关系并不呈完全相关。
以药效指标为导向的药材提取工艺研究虽能从根本上
保证其药理药效，但本实验以综合评价指标代替药效，使
得相关研究有了新的思路。对旋覆花抗肿瘤有效组分的提
取工艺进行研究可为该植物的开发和利用奠定物质基础，
为临床抗肿瘤新药的研制提供理论依据，同时也为工业生
产和中药及其复方提取工艺的合理优选提供参考和借鉴。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典:2010 年版一部
［S］． 北京:中国医药科技出版社，2010:305．
［2］ 万 祺，龙凌云，裴月湖，等． 旋覆花中鞣质的含量测定
［J］． 时珍国医国药，2007，18(11) :2758-2759．
［3］ 耿红梅，王云志，张嫡群． 治疗阿尔茨海默症的天然药物
［J］． 中国药房，2006，17(13) :1019-1021．
［4］ 耿红梅，张嫡群，王云志，等． 欧亚旋覆花中总黄酮的测
定 ［J］． 中草药，2006，37(3) :450-451．
［5］ 何国云，李 钢，耿红梅，等． 日本旋覆花总黄酮的微波
提取与含量测定 ［J］． 现代生物医学进展，2012，12
(35) :6957-6959．
［6］ 耿红梅，张嫡群，王云志，等． 欧亚旋覆花总黄酮提取与
富集工艺研究 ［J］． 天然产物研究与开发，2006，18(4) :
643-646．
［7］ 张云坤，包永睿，孟宪生，等． 藏药余甘子抗肿瘤活性成
分的提取工艺优化及含量测定 ［J］． 中国医药工业杂志，
2012，43(11) :905-908．
［8］ 蔡 琳，孟宪生，包永睿，等． 基于体外心肌细胞活力的
葛根提取工艺优选 ［J］． 中国实验方剂学杂志，2012，18
(18) :17-19．
［9］ 王思思，包永睿，孟宪生，等． 麦冬有效组分的提取工艺
及组分与药效相关性分析 ［J］． 时珍国医国药，2013，24
(3) :559-561．
［10］ 郑 莹，王 帅，孟宪生，等． 基于量效融合评价的正交
设计法优选核桃楸皮抗肝 SMMC-7721 肿瘤黄酮类成分的
提取工艺 ［J］． 中药材，2013，36(10) :1686-1689．
［11］ 任爱农，卢爱玲，田耀洲，等． 层次分析法用于中药复方
提取工艺的多指标权重研究 ［J］． 中国中药杂志，2008，
33(4) :372-374．
［12］ 靳 浩，吴 诚，梅兴国，等． 多指标综合评价法优选阿
霉素微球的制备工艺及体内的初步考察 ［J］． 中国药学杂
志，2006，41(22) :1723-1725．
［13］ 唐 灿，王子雯，孙嘉婧，等． 多指标综合评价巴中产栀
子的品质 ［J］． 中国实验方剂学杂志，2012，18(24) :
115-119．
［14］ 包永睿，王 帅，孟宪生，等． 气滞胃痛颗粒促胃肠动力
作用谱效关系网络模型的构建 ［J］． 中药材，2014，37
(5) :828-832．
354
2016 年 2 月
第 38 卷 第 2 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
February 2016
Vol． 38 No． 2