全 文 ：植物生理学报 , A吻 月妙俩两 , 勿么妙叨 s动应刀 1哭祖 , 24 (1 ) : 6 一 10
真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生长和紫草素合成
的影响
刘长军 ` , 2 侯篙生’
(
’ 中国科学院武汉植物研究所 , 武汉 4 3D 0’7 4 )
(
2 中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 2X( 刃3 2 )
摘要 : 4 种真菌诱导子诱导新疆紫草悬浮培
养细胞对细胞紫草素的合成均有促进作用 ,
其中以黑 曲霉诱导子效果最高 , 而且促进细
胞紫草素的外排 , 约 30 % 的紫草素存在于培
养液中 ; 诱导促使细胞苯丙氨酸解氨酶活性
显著提高 , 培养液中紫草素的含量 变化与苯
丙氛酸解氛酶活性变化呈正相关性
关键词 : 真菌诱导子 ,新疆紫草 , 细胞悬浮培
养 ,紫草素
学科分类号 : 详玛5
真菌诱导子是一类在植物超敏反应中
能引起植物细胞合成和积累次生产物 (植
保素 )的活性物质 。 作为一种特定的化学
信号 ,在植物与微生物的相互作用中 ,它们
可以快速 、 专一 和有选择地诱导植物代谢
过程 中特定基 因的表达 ( E i le rt 19 57 ) 。 近
年来 ,在植物细胞培养生产有用物质的研
究 中 ,利用诱导子处理植物培养细胞 以促
使细胞快速 、 大量合成有用次生物质 已成
为人们普遍重视的新方法 。
新疆紫草属 紫草科 ( oB 珑嗯卫n ac ea )植
物 ,传统中药 ,其主要成分紫草素及其衍生
物具有显著的抗菌 、 消炎等特性 ,又可作为
染料和添加剂广泛用于食品 、 化妆品工业 。
但由于其天然 资源 缺乏 , 人工驯化栽 培困
难 , 因而细胞大量培养生产紫草素的研究
工作就尤显重要 。 自李国风等 ( 19 8 8) 诱导
出新疆紫草愈伤组织并鉴定出培养物 的色
素成分 以来 , 有关新疆紫草细胞 培养 的研
究 已有较多工作 。 虽然 , 叶和春等 l( 如 1 ) ,
方德秋等 ( 19 4 )分别研究 了不 同理化 因
子 、 激素对 紫 草 素 合 成 的影 响 , 宁 文等
( 19 4 )就真菌诱导物对滇紫草悬浮培养细
胞紫草色素合成 的影响相继有 了报告 , 但
有关真菌诱导子对新疆紫草细胞生长和紫
草素合成的影响尚未见研究 。 为进一步提
高新疆紫草培养细胞 中紫草素的含量 ,本
实 验 用 刺 盘 抱 菌 ( oC le ot t流hum ~
-
t记~ )
、尖抱镰刀菌汀场iar ujn “ 砂’sI 刃~ )
、
黑 曲霉 ( A钾嘟 11。 几华羚r ) 、 米 曲 霉 (击 -
娜娜Uus 。。 忆权姆 ) 4 种真菌诱导子处理悬浮培
养的新疆紫草细胞 , 系统地研究 了诱导作
用对其细胞生长和紫草素合成 的影响 , 以
及对次生代谢调节的作用机理 。
材 料 与 方 法
1
.
1 实验材料 新 疆 紫草 【月m 忍石她 e以大用砌
( R
o y l
e
) oJ hsn t] 愈伤组织 由中国科学院植物研究
所叶和春先生提供 , 在 映 生长培养基中继代保
存 。
1
.
2 细胞悬浮培养 选生长旺盛 、 色泽鲜艳的紫
草愈伤组织 ,首先转至液体生长培养基 映 (叶和
春等 19 1) 中 , 于 1 0 一 12D r/ 而 n 摇 床上 , 2 -
25 ℃ 黑暗 、 悬浮培养 ,每 12 d 继代一次 ; 生产阶
段以 5 岁而接种量转至 蝎 生产培养液中悬浮培
养 ,条件同上 。
1
.
3 真菌培养 刺盘抱菌 、 尖抱镰刀菌接种于马
铃薯 一葡萄糖培养液中 , 黑曲霉 、 米曲霉接种在查
氏培养液 中 (范 秀蓉 19 86 ) , 24 士 2℃ , 如 一 10
r/ 而 n普通摇床上 ,液体培养 6 一 7 d , 待菌丝体充
分生长后收获 。
19天i扔`肠 收到 , 1男 7 ( ” ~ 14 接受 。
八五攻关课题内容之一 。
1 期 刘长军等 :真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生长和紫草素合成的影响
1
.
4 诱导子的制备和粗提物中寡糖含t 测定
诱导子的制备参考前文 (刘长军等 1燮笼i) 方法 , 收
获的菌丝体 , 用缓冲液 、 有机溶剂分别冲洗 、 冰冻
干燥 、 高温煮提 、 离心和透析 ,得到的粗提物用葱
酮比色法 (张惟杰 19 87) 测定糖含量 ,代表诱导子
的浓度 。
1
.
5 细胞生长测定 以细胞干重为指标 , 将收
集的紫草细胞抽滤 ,印℃烘干至恒重 , 作为细胞干
重 。
1
.
6 紫草素含 l 测定 参考叶和春等 ( 1卯 l) 方
法 ,分别用石油醚冷浸和萃取法提取干细胞和培
养液中的紫草素成分 , 比色法测定色素含量 。
1
.
7 苯丙氮酸解氮酶活性测定 参照王 敬文和
薛应龙 ( 19 82) 方法 , 以 A斓值变化 0 . 01 为一个活
力单位 ,并以 u g 一 ’wr h 一 l表示酶活性 , 3 次重复 。
2 结 果
2
.
1 不同种类诱导子对新疆紫草细胞生
长和紫草素合成的影响
经 3 次继代培养的新疆紫草细胞 , 在
生长培养基中悬浮培养 or d 后转接到 呱
生产培养基中继续培养 12 d , 以 so 鸿 诱导
物 / d 培 养体积 的浓度分别加 人刺盘抱
菌 、黑 曲霉 、 米曲霉和尖抱镰刀菌诱导子 ,
诱导处理 6 d 后 收获 , 测定细胞生长状况
和紫草素含量 (表 1 ) 。
表 1 不同诱导子对悬浮培养的新疆紫草细胞生长和紫草素合成的影响
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由表 1 可见 , 4 种真菌诱导 子对细胞
生长和紫草素的合成均有 一定促进作用 ,
其中以黑曲霉和尖抱镰刀菌诱导子对新疆
紫草细胞 的作用效果最好 。
2
.
2 不同浓度的黑 曲霉诱导子 对新弧紫
草细胞生长和紫草素合成的影响
继代培养 n 代的新疆紫草悬 浮细胞
转至 蝎 生产培 养基 中培养至 12 d 时 , 加
入不同浓度的黑曲霉诱导子 , 培养 18 d 后
测定其细胞生长状况和紫草素含量 。 图 1
显示 ,新疆紫草细胞对黑曲霉诱 导处理的
反应要求 一最 适 的浓度 范 围 , 10 11酬耐
的诱导物浓度对紫草素的合成有最好 的促
进效果且不影响培养细胞 的生 长 , 过量浓
度对细胞生 长和紫草 素合成 均有不利影
响 ; 诱导 亦促 进 细 胞 紫 草 素 的外 排 , 约
30 % 的紫草色素排放在培养液中 。
二
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E一c i t o r c o n c e n t r a t沁 n (卜 g / m l )
图 1 不同浓度黑曲霉诱导子对新疆紫草细胞生
长和紫草素合成的影响
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植 物 生 理 学 报 抖卷
2
.
3 不同细胞培养时期加入诱导子对新
疆紫草细胞生长和紫草素合成的影响
新疆紫草细胞悬 浮培养于 呱 生产培
养基中 4 d 后 , 进人 指数生 长期 , 至第 or
天生长变慢而进人静止期 (图 2 ) 。 分别在
悬浮培养第 4 、 or 、 12 天及第 16 天时 向细
胞培养物中加人黑 曲霉诱导子 , 发现在指
数生长初期加人诱导子 , 细胞生长受到明
显抑制 ,但在指数生长期末加人诱导子却
能促进细胞干重 的进一步积累 。
量也随之增加 , 48 h 后达到 84 , s m岁L 的
最高含量 。
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二1。 图 3 不同生长时期加人诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞紫草素合成的影响
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.
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图 2 不同培养时期加人诱导子对新疆紫草悬浮
培养细胞生长的影响
珑 . 2 E日政〕st Of ad id it o n of iel e i t o r i n 山 fe er n t 。 ul t。
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在指数生长期末 、静止期初期加人黑
曲霉诱导子对紫草素合成的诱导效果最明
显 (图 3) ,紫草素总产率可达到 868 In g/ L ,
比同期对照提高 30 % 还多 。
2
.
4 诱导处理对悬浮培养的新疆紫草细
胞苯丙氨酸解氨酶 ( P AL )活性的影响
诱导处理引起 细胞 PA L 酶活性 和培
养液中紫草素含量发 生显著变化 (图 4 ) 。
加人黑曲霉诱导子 6 h 后 , P A L 酶活性 明
显增高 , 至 24 h 处理细胞酶活性 比对照提
高约 1倍 ;同时培养液外排物中紫草素含
O 心
二
图 4 黑曲霉诱导子对悬浮培养的新疆紫草细胞
P AL 酶活性的影响
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.
4 Efl 七(: st of A . in ge r e il ic tor ot 纽 it n e nt o n ht e P IA 副
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.
e u `知叨mtz e e l s in s us ep sn io n e 砚il t眠
3 讨 论
真菌诱导子对次生代谢的调节作用是
在酶和基因水平上进行的 。 特定的诱导信
号被植物细胞识别 、接受 ,通过细胞内吞或
l 期 刘长军等 : 真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生长和紫草素合成的影响
多种第二信使方式在胞 内传递 , 提高代谢
途径 中酶活性或增加酶量 , 从而影响次生
产物的含量 ( iE le rt 19 87 ) 。 苯丙 氨酸解氨
酶是紫草细胞中蔡醒类物质合成的关键酶
之一 ( Y az ak i 等 19 8 6 ) 。 本实验结果表明 ,
黑 曲霉诱导子处理新疆 紫草细胞后 , P AL
酶活性明显增加 , 而且同紫草素的积 累表
现出一定 的正相关性 。
诱导处理刺激培养细胞合成次生产物
的作用受诱导子种类和浓度以及培养细胞
的生理状况等许多因素的影响 。 不同种类
诱导子所具有的诱导信息类型 、 强度不同 ,
诱导反应发生的类 型 、速 度和强度也不 同
(王钧 19 2) 。 4 种真菌诱导子处理新疆紫
草细胞均有利于紫草素产率的提高 , 其中
以黑 曲霉诱导子 的作用效果最高 , l团 拼岁
而 的诱导子浓度能有效促进产物的积累 。
诱导作用 的效果依赖于培养细胞的生理状
态 ,只有处于一定生长时期 的细胞才能有
效地接受诱导信号 , 此时诱导子表现为最
高活性 。 当诱导处理处于指数生长期末 、
静止期初 的新疆紫草 细胞时 , 紫草素产率
可达到 868 m岁而 , 比对照提高 30 % 多 , 这
与 F u n k 等 ( 19 87 )报 告的唐松草悬浮培养
细胞对诱导处理的反应结果 。 一致诱导处
理在一定程度上改变了紫草素的运输方向
和储存部位 , 促进 了产物的外排 ,这对新疆
紫草细胞大规模发酵培养中实现产物的连
续 回收 , 简化生产工艺 ,降低生产成本具有
重要意义 。
致谢 : 中国科学院上海植物生理研究所陈晓亚先
生对本文的发表给予支持和帮助 。
参 考 文 献
王 钧 ( 1卯 2 ) . 植物与病原体相互关系的分子基
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击砚 6必 曰犯知勺艘王 . A c友忿 及〕 t iS n , 3 : 927 一 93 1
A血 月州印勺 ,勿叭妙恤 S认 ica 】臾招 , 24 ( 1) : 6 一 10
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A h 由旧c t : hT e s ih k o in n b i o s扣ht e s i s i n
A服b记 e cu h or am e e l s in s u s pe ns i o n
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乃m巴 b她 曰双 )从 )anI , ce U
19 7 年 (植物生理学报》审稿人名单
我刊 19 7 年来稿由以下专家审查 。 公布本名单 (按姓氏拼音为序 )以表示衷心的感谢 。
白永延 蔡 可 陈建文 陈培元 陈受宜 陈维伦 杜林芳 费雪南 傅家瑞
高煌珠 龚蔡蔡 黄维南 荆玉祥 李春俭 李久蒂 李立人 李明启 李文安
李振国 梁厚果 粱 峥 林惠民 刘鸿先 刘友 良 刘芷宇 罗广华 倪晋山
潘瑞炽 彭克勤 邱泽生 沈 询 宋鸿遇 孙崇荣 孙大业 谭克辉 汤 日圣
汤章城 唐锡华 童 哲 汪训 明 王爱 国 王天铎 王以柔 王宗阳 文江祁
吴相钮 夏 凯 夏镇澳 肖诩华 徐春和 徐如涓 许大全 许 良树 颜 昌敬
杨金水 叶济宇 余叔文 曾以 申 张巫方 张承烈 张福锁 张景六 张伟成
赵国屏 赵可夫 赵毓橘 郑光华 种 康 周 燮 朱 微 朱治平 左宝玉
《植物生理学报》编委会 、编辑部