全 文 ：微生物学通报 APR 20, 2012, 39(4): 486494
Microbiology China © 2012 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn
*通讯作者：Tel: 86-10-68984481; : wangp@btbu.th.edu.cn
收稿日期：2011-10-02; 接受日期：2011-12-12
研究报告
小球藻高密度培养及油脂提取条件的优化
李金穗 汪苹* 董黎明
(北京工商大学 食品学院 北京 100048)
摘 要: 【目的】高密度培养小球藻及优化油脂提取条件。【方法】通过进行单因素实验
研究不同培养基组成及环境因子对其细胞生长影响, 并采用超声波提取法进行正交实验
对藻粉油脂提取条件进行研究。【结果】对椭圆小球藻 Y4 进行异养培养, 最适培养条件
为: 葡萄糖 50 g/L, 硝酸钾 2 g/L, 适宜的培养温度、摇床转速和接种量分别为 29 °C、
180 r/min和 20%。在此基础上, 进行了 1 L发酵罐培养实验, 获得了干重 18.25 g/L的生
物量。通过对油脂提取条件进行优化, Y4 的油脂提取率由优化前的 25.0%提高到 60.2%,
提高了 35.2%。【结论】优化了小球藻的培养条件及油脂提取条件, 促进了小球藻的开发
和利用。
关键词: 椭圆小球藻, 高密度培养, 油脂提取
Chlorella high density training and lipid extraction
condition optimizing
LI Jin-Sui WANG Ping * DONG Li-Ming
(College of Food Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)
Abstract: [Objective] Chlorella high density training and lipid extraction condition optimiz-
ing. [Methods] Single factor experiments were used to research different mediums and envi-
ronmental factors on Chlorella cell growth effects, and the ultrasonic extraction method was
employed by orthogonal experiment for algae powder oil extraction conditions. [Results] The
optimal condition of Chlorella ellipsoidea Y4 under heterotrophic culture to get high biomass
were: BG11 medium with 50 g/L of glucose as the carbon source and 2 g/L KNO3 as the ni-
trogen source. The optimum culture temperature, shaking rate and the inoculums size were
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2012.04.016
李金穗等: 小球藻高密度培养及油脂提取条件的优化 487
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29 °C, 180 r/min and 20%. By inoculating the preculture to a fermentation tank of 1 L capac-
ity, we got dry cell weight 18.25 g/L. Based on the oil extraction condition optimization, Y4
lipid extraction yield increased from 25% to 60.2%, with lipid extraction yield raised by
35.2%. [Conclusion] Optimization of chlorella culture conditions and lipid extraction condi-
tions were studied, and the result promoted the exploitation and utilization of chlorella re-
sources.
Keywords: Chlorella ellipsoidea, High density training , Lipid extraction
小球藻(Chlorella)为绿藻门、小球藻属的单细
胞绿藻。小球藻富含蛋白质、多种色素、B族维
生素、必需氨基酸、微量元素和一些生物活性代
谢产物[1], 而且同时具有抗癌、抗辐射、抗感染、
抗氧化、防治高血脂症、防治便秘以及骨髓抑制
等一系列生理保健功能, 是目前保健食品开发应
用最理想和研究最多的微藻之一[2]。美国、前苏
联自 20世纪 50年代就开发小球藻作为单细胞蛋
白用于饲料添加剂, 日本在 20 世纪 70 年代率先
开发小球藻作为人类的健康食品, 80年代又先后
开发出小球藻健康和美容系列产品, 包括小球藻
食品、小球藻饮品、小球藻绿酒、小球藻化妆品
等[3−4]。在工业上, 小球藻用于制取叶绿素、脯氨
酸、油脂 [3−7], 在医药领域, 小球藻被用于提取
有效活性成分制成各种医药制剂[3−4]。我国曾在
20 世纪 60 年代初开展了小球藻的培养与开发
研究[6]。
传统上小球藻的生产采用光自养培养方式,
离不开光照, 产量很低, 限制了小球藻的开发利
用。在异养生长条件下无须光照, 同时使细胞浓
度达到较高水平, 大大降低分离成本, 为工业化
大规模高密度培养微藻奠定了基础[8]。小球藻的
异养培养受到碳源、氮源、培养温度、pH、摇床
转速和接种量等因素的影响。因此, 研究这些因
素对小球藻异养培养的影响也成为人们研究的
重点。小球藻的生长周期短, 资源丰富, 且多不
饱和脂肪酸组成简单, 产油脂高的小球藻具有更
高的利用价值。本实验通过对葡萄糖、KNO3、
接种量、温度、摇床转速设置不同梯度单因素实
验, 得到异养小球藻的最佳培养条件, 并对油脂
的提取条件进行优化, 确定其最佳提取条件。
1 材料与方法
1.1 藻种
小球藻 Chlorella ellipsoidea No.962 (实验统
一编号为 Y4), 购自中国科学院武汉水生生物研
究所。
1.2 仪器与设备
HH2SH24 型电热恒温水浴锅, 北京长安科
学仪器厂; TGL-16G 型高速离心机, 上海安亭科
学仪器厂; 组合式恒温振荡培养箱, 太仓市实验
设备厂; 高压灭菌锅, 日本HIRAYAMA; 电子分
析天平 AY22, 日本岛津; 低温超速离心机 Sigma
3K15, 德国 Sigma 公司; Multifors 发酵罐(1 L),
德国 Infors公司。
1.3 培养基和培养条件
1.3.1 培养基: (1) BG11液体培养基(1 L)。其配
制方法为:
Stock1: 取柠檬酸 0.30 g, 柠檬酸铁铵 0.30 g,
Na2-EDTA 0.05 g, 定容至 100 mL;
Stock2 (g/L): 取KH2PO4 1.50, MgSO4·7H2O 3.75;
Stock3 (g/L): 取 CaCl2·2H2O 1.8;
Stock4 (g/L): H3BO3 2.860, MnCl2·4H2O
1.810, ZnSO4·7H2O 0.222, NaMoO4·5H2O 0.390,
CuSO4·5H2O 0.079, Co(NO3)2·6H2O 0.049。
配制 1 L BG11液体培养基需 Stock1 2 mL、
stock2 20 mL、Stock3 2 mL、Stock4 1 mL, 初始
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培养基 KNO3 1.5 g/L, 葡萄糖 40 g/L。
1.3.2 初始培养条件: 实验在装液量为 100 mL
的 250 mL的三角烧瓶中进行。接种量为 10％, 培
养温度为 25 °C, 起始 pH 为 7.0, 摇床转速为
120 r/min, 发酵培养周期为 7 d。
1.4 方法与实验设计
1.4.1 生物量测定: 细胞干重测定: 用移液枪取
均匀小球藻液 4 mL, 放入 5 mL离心管中进行离
心, 8 000 r/min下离心 10min, 除去上清液, 用蒸
馏水洗涤藻细胞, 重复离心、洗涤 3次后, 55 °C
烘干至恒重。
1.4.2 单因素条件下藻株 Y4 生长特性研究: 藻
株Y4采用异养培养方式, 采用BG11初始培养基,
对碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钾)、接种量、温度、
摇床转速 5 个单因素设置不同梯度, 测定藻株每
天的细胞干重, 每个实验重复 3 次, 取平均值。
其中碳源的浓度梯度设置为 30、40、50、60、
70 g/L; 氮源的浓度梯度设置为 1.5、2.0、2.5、3.0、
3.5 g/L; 接种量浓度梯度设置为 5%、10%、15%、
20%、25%; 温度梯度设置为 20 °C、23 °C、26 °C、
29 °C、32 °C; 摇床转速梯度设置为 90、120、150、
180、210 r/min。
1.4.3 油脂提取条件设计: 实验采用超声波提取
法: 称取 0.1 g藻粉置于离心管中, 加入体积比为
1:1 的正己烷:异丙醇溶液, 摇匀后放入超声仪中
超声萃取, 萃取后于 10 000 r/min离心 10 min, 移
取上层清液于离心管中, 105 °C烘箱加热蒸发 2 h,
油脂提取率按下式计算。
%= 100%质 (g)样 质 (g)
提取物 量油脂 品 量
实验选取提取剂体积、超声功率、超声时间、
提取次数 4 因素设计正交实验, 对油脂提取条件
进行优化。
2 结果与讨论
2.1 不同营养物质浓度对小球藻生长影响的
研究
2.1.1 碳源(葡萄糖浓度)的影响: 选用葡萄糖作
为碳源, 研究不同碳源浓度对藻种生长量的影
响。在硝酸钾 1.5 g/L、温度 25 °C、摇床转速
120 r/min、接种量 10%、pH为 7的条件下, Y4藻
株生长量如图 1所示。
图 1 碳源对小球藻生长量的影响
Fig. 1 Effect of carbon source on cell growth of Y4
李金穗等: 小球藻高密度培养及油脂提取条件的优化 489
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从图 1 的生长曲线中可以看出, 小球藻的生
长趋势大致为对数形, 即在初期生长比较缓慢,
中间经历一段比较快的增长后又趋于平缓。其原
因可能是, 接种初期, 小球藻需要一段适应时期,
然后才开始大量繁殖增长, 呈现出一个比较迅速
的上升趋势, 由于藻类的迅速增多和营养物质的
减少, 曲线的后期又逐渐平缓, 并有下降趋势。
此外, 在葡萄糖浓度为 50 g/L时小球藻的生
长量较高。分析其原因认为, 当葡萄糖浓度过低
时, 营养物质不足以满足小球藻的需求, 生长受
到了抑制; 而当浓度过大时, 高浓度的培养基对
小球藻的吸收和渗透产生了抑制作用, 使其生长
受到阻碍, 甚至会出现死亡。因此, 葡萄糖浓度
为 40−60 g/L 时为小球藻的最佳生长条件, 故本
研究中接下来的实验选取葡萄糖浓度为 50 g/L进
行。Sasaki 等在小球藻与细菌混合培养的污水处
理体系中研究了葡萄糖浓度对小球藻生长规律
的影响, 发现当葡萄糖浓度较低时, 藻细胞浓度
也低, 相对高的葡萄糖起始质量浓度(如 50 g/L)
可用于培养高细胞浓度的小球藻[9]。
2.1.2 氮源(硝酸钾浓度)的影响: 选用硝酸钾作
为氮源, 研究不同氮源浓度对小球藻生长量的
影响, 在葡萄糖 50 g/L、温度 25 °C、摇床转速
120 r/min、接种量 10%、pH 7的条件下，Y4藻
株生长情况如图 2所示。
对小球藻来说, 硝酸盐氮是最常用的氮源[10],
从图 2可以看出, 当硝酸钾浓度低于 2 g/L时, 小
球藻生长量随着硝酸钾浓度的升高而升高; 当硝
酸钾浓度超过 2 g/L 时, 生长量随着浓度的升高
而降低, 说明硝酸钾浓度在 2 g/L 左右较适宜小
球藻的生长; 当硝酸钾浓度过低时, 营养物质不
足以满足小球藻的需求, 使生长受到了抑制; 而
当浓度过大时, 高浓度的氮源对小球藻的生长产
生了抑制作用, 使其生长受到阻碍, 甚至会出现
死亡。故本实验接下来选取硝酸钾浓度为 2 g/L
进行培养。
通过 2.1.1 和 2.1.2 的结果可知, 当葡萄糖浓
度与硝酸钾浓度之比为 25:1 时, 小球藻 Y4 生长
量为最大。
图 2 氮源对Y4细胞生长的影响
Fig. 2 Effect of nitrogen source on cell growth of Y4
490 微生物学通报 2012, Vol.39, No.4
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2.2 不同环境因子变化对小球藻生长影响的
研究
2.2.1 接种量对小球藻生长影响的研究: 通过设
置不同接种量梯度, 选择适宜小球藻生长的接种
量范围。选用初始培养基葡萄糖 50 g/L、硝酸钾
2.0 g/L、温度 25 °C、摇床转速 120 r/min、pH 7
的条件下, Y4藻株生长情况如图 3所示。
从图 3可以看出, 在接种量为 20%时小球藻
的生长量较高。可能是因为当接种量过低的时
候, 小球藻初始细胞数过低, 致使小球藻的生长
量偏低, 培养液营养物质无法得到充分利用; 较
大的接种量可以缩小球藻的生长停滞期, 延长
对数生长期, 提高生物量 [11]; 而当接种量过大
时, 培养基中的营养物质不足以满足小球藻的
需求, 生长受到了抑制, 同样无法达到最佳。因
此, 接种量为 15%−25%时为小球藻的最佳生长
条件, 故本研究中接下来的实验选取接种量为
20%进行。
2.2.2 温度的影响: 通过设置不同温度梯度, 选
择适宜小球藻生长的温度范围。在葡萄糖 50 g/L、
硝酸钾 2.0 g/L、摇床转速 120 r/min、接种量 20%、
pH 7的条件下, Y4藻株生长情况如图 4所示。
图 3 接种量对Y4细胞生长的影响
Fig. 3 Effect of inoculation amount on cell growth of Y4
图 4 温度对Y4细胞生长的影响
Fig. 4 Effect of temperature on cell growth of Y4
李金穗等: 小球藻高密度培养及油脂提取条件的优化 491
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从图 4 的生长曲线中可以看出, 小球藻在温
度 29 °C时的生长量较高。这可能是因为当温度
较低时, 微藻生长和代谢缓慢, 所以生物量较低;
随着温度升高, 藻体细胞生长代谢旺盛, 细胞生
长相关的酶被激活, 从而促进小球藻的生长[12];
而当温度过高时, 小球藻不耐受高温, 其对营养
的吸收和运动受到阻碍, 生长迟滞, 甚至会出现
死亡。因此, 温度为 26 °C−32 °C时为小球藻的最
佳生长条件, 故本研究中接下来的实验选取温度
为 29 °C 进行。根据文献, 小球藻适宜生长在
25 °C−34 °C, 一般最适温度为 28 °C [13−14]与本实
验结论基本一致。
2.2.3 摇床转速的影响: 通过设置不同摇床转速,
选择适宜小球藻生长的范围。在葡萄糖 50 g/L、
硝酸钾 2.0 g/L、温度 29 °C、接种量 20%、pH 7
的条件下，Y4藻株生长情况如图 5所示。
从图 5 可以看出 , 小球藻在摇床转速为
180 r/min时比其他转速下的生长量高。分析其原
因认为摇床转速主要影响的是培养基中氧含量
的多少, 当转速过低时, 培养基中的氧含量低,
无法满足小球藻对氧的需求, 对营养物质的需求
量也小, 导致运动和繁殖能力降低或变慢, 同时
实验中观察到藻细胞在转速较低时会集结成团,
因此过低的转速不利于细胞和营养物质的分散;
随着摇床转速增加, 培养液中溶氧系数升高, 溶
氧量增大, 小球藻可更好的进行生长; 而当转速
过高时 , 则使剪切力增大, 导致细胞损伤, 在
显微镜下观察细胞时可发现, 当摇床转速超过
210 r/min时, 有大量细胞碎片出现。因此, 摇床
转速为 150−210 r/min时为小球藻的最佳生长条件,
故本研究中接下来的实验摇床转速为 180 r/min
进行。
2.2.4 小球藻培养条件优化结果: 为了验证优化
后培养条件是否适宜小球藻生长, 采用上述实验
优化后的异养培养条件进行验证培养，结果见
图 6。从图 6可知, 小球藻 Y4生长量在未优化为
2.33 g/L, 经过优化后生长量达到 4.03 g/L, 生长
量提高 173%。说明经过优化后的培养条件适宜
小球藻 Y4的生长。
2.3 发酵罐培养实验
为了获得更高的生长量, 采用上述实验优化
后的异养培养条件进行发酵罐实验。将处于对数
生长末期的种子培养物转接至发酵罐中进行高
密度异养培养, 发酵过程中, 按照以下方式补料:
自接种开始, 第 24 h补料 60 mL, 第 48 h补料
100 mL, 第 72 h补料 50 mL, 以后每隔 24 h补料
50 mL, 至不再增长, 补料培养基为优化后的培
养基。发酵罐中的细胞生长量变化如图 7所示。
图 5 摇床转速对Y4细胞生长的影响
Fig. 5 Effect of shaking rate on cell growth of Y4
492 微生物学通报 2012, Vol.39, No.4
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由图 7 可以看出, 小球藻的比生长速率在
3−5 d之间达到最大, 第 6 天之后生长速率降低,
生长量趋于平稳, 第 9天生长量基本维持不变,
发酵结束后收集藻体 , 烘干称重 , 产量为
18.25 g/L。
2.4 油脂提取正交实验
为了提高藻粉油脂的提取率, 采用超声波提
取法进行了优化实验。超声波法是利用超声波的
空化作用和机械作用, 使溶剂分子渗透到组织细
胞中去, 使可溶性成分更好更快地释放出来[15]。
超声波法提取油脂主要受固液比、超声功率、超
声提取时间和提取次数 4 个因子的影响[16], 由此
作 4 因素 3 水平进行正交实验, 确定实验最佳提
取工艺条件。实验安排如表 1。
向研磨好的 Y4 藻粉中加入正己烷和异丙醇
体积比为 1:1 的溶液经过超声萃取和离心分离,
取上清液置于离心管中, 放入 105 °C烘箱烘干
2 h , 取出称重得油脂百分含量见表 2。
图 6 Y4培养条件优化的验证试验
Fig. 6 Validation test of Y4 culture conditions for the optimization
图 7 发酵罐异养培养小球藻Y4的生长曲线
Fig. 7 The heterotrophic growth for Chlorella Y4 in fermentation tank
表 1 影响超声波提取油脂的因素及水平
Table 1 Influence of factors and levels on extraction rate of oil by ultrasonic treatment
序号
Number
超声功率
Ultrasonic power (W)
超声时间
Ultrasonic time (min)
固液比
Solid-to-liquid ratio
提取次数
Extraction times
1 100 5 1:10 1
2 60 15 1:20 2
3 20 25 1:30 3
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表 2 各因素对藻粉油脂提取率的影响
Table 2 Influence of factors on extraction rate of chlorella powder oil
因素
Factors
超声功率
Ultrasonic power
(W)
超声时间
Ultrasonic time
(min)
固液比
Solid-to-liquid ratio
(g/mL)
提取次数
Extraction times
藻粉油脂得率
Extraction rate of
Chlorella powder
oil (%)
1 1(100) 1(5) 1(1:10) 1(1) 35.0
2 1 2(15) 2(1:20) 2(2) 53.8
3 1 3(25) 3(1:30) 3(3) 60.2
4 2(60) 1 2 3 47.2
5 2 2 3 1 38.4
6 2 3 1 2 39.6
7 3(20) 1 3 2 32.3
8 3 2 1 3 31.2
9 3 3 2 1 28.2
均值 1 (Ⅰj)
Mean value 1 (Ⅰj) 49.667 38.167 35.267 33.867
均值 2 (Ⅱj)
Mean value 2 (Ⅱj) 41.733 41.133 43.067 41.900
均值 3 (Ⅲ j)
Mean value 3 (Ⅲ j) 30.567 42.667 43.633 46.200
极差(Rj)
Range (Rj)
19.100 4.500 8.366 12.333
根据表中油脂得率可以看出, 超声波处理因
素对藻粉油脂提取率有明显的影响。根据极差分
析, A＞D＞C＞B, 即超声功率＞提取次数＞固
液比＞超声时间。由上表可见:表观最优条件为实
验 3(A1B3C3D3), 即提取条件为 : 超声功率为
100 W, 超声时间为 25 min, 固液比为 1:30, 提取
次数为 3。表观最优条件与计算最优条件相同, 故
不做验证实验。
根据实验结果, 超声功率为 100 W的时候均
值最大, 为49.7%, 功率降低均值随之降低, 这是
由于超声强度越大, 空化现象越剧烈, 扩散越快,
油脂渗透速度越大[17]。超声时间越长藻粉油脂提
取率越高, 原因是处理时间越长, 油脂浸出越充
分。固液比及提取次数越多, 提取率越高, 主要
是由于溶剂量越大, 体系渗透压越大, 油脂越易
渗透出来; 多次提取率要比一次的高, 是因为每
次重新提取就又建立了一个高渗透压条件, 使得
油脂可以被充分浸提出来。在最优条件下提取藻
粉油脂得率为 60.2%。
3 结论
(1) 通过对小球藻 Y4培养条件进行优化, 设
计单因素实验, 得到最适合小球藻 Y4 的培养条
件为: 葡萄糖 50 g/L, 硝酸钾 2 g/L, 适宜的培养
温度、pH、摇床转速和接种量分别为 29 °C、7.0、
180 r/min 和 20%。在此基础上, 进行了 2 L 发酵
罐培养实验，获得了干重 18.25 g/L的生物量。
(2) 将培养后的小球藻收取藻粉, 对藻粉油
脂提取条件进行优化, 得到最优提取条件: 超声
功率为 100 W, 超声时间为 25 min, 固液比为
1:30, 提取次数为 3, 在此条件下藻粉提取率达到
60.2%。
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研究结果表明, 藻株 Y4 是一株性能优良的
异养小球藻, 适合进行产业化培养利用, 且具有
较高的油脂含量, 本研究并通过优化培养条件及
油脂提取条件, 促进了小球藻的开发和利用, 为
最终实现该藻的工业化提供了科学依据。
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葵花籽油研究[J]. 粮食与油脂, 2004, (9): 24−25.
稿件书写规范
论文中阿拉伯数字的使用
凡是可以使用阿拉伯数字且很得体的地方均应使用阿拉伯数字。世纪、年代、年、月、日、时刻
必须使用阿拉伯数字, 年份必须用全称。对科技期刊来说, 凡处在计量单位和计数单位前面的数字, 包
括9以下的各位数字, 除个别特例外, 均应使用阿拉伯数字。不是表示科学计量和有统计意义数字的一
位数可以用汉字, 例如: 一本教材、两种商品等。