全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
表达重组咖啡豆α2半乳糖苷酶的
酵母工程菌的高密度发酵
高红伟 贾延军 鲍国强 季守平 檀英霞 李素波 章扬培 宫锋
(军事医学科学院野战输血研究所 ,北京 100850)
　　摘 　要 : 　用 5 L发酵罐优化了重组咖啡豆α2半乳糖苷酶酵母工程菌 pP IC9K2Gal/GS115 (本室构建 )的高密度发酵工艺。
通过对发酵条件的优化 ,包括甘油补充量及补充时机、甲醇诱导量及诱导时机、溶氧控制、诱导时间等 ,重组咖啡豆α2半乳糖
苷酶在毕赤酵母中得到了高效表达。利用所确定的最适条件进行发酵 ,菌体密度最终达到 368 g/L以上 ,每批发酵液离心后
可获得 3. 5 L的发酵上清 ,上清中的蛋白含量达到 3 g/L以上 ,目的蛋白占上清总蛋白的 50%以上 ,含量约为 1. 5 g/L,上清中
α2半乳糖苷酶的活性维持在 80 U /m l左右。确立工艺后又进行了 3次发酵试验 ,证明了工艺的可行性和稳定性。为重组咖啡
豆α2半乳糖苷酶在 B→O血型改造和酶解大豆低聚糖方面的应用奠定了基础。
关键词 : 　α2半乳糖苷酶 毕赤酵母 高密度培养
High Cell2Density Fermentation of P ich ia pastoris
Producing Recombinant Coffee Beanα2Galactosidase
Gao Hongwei J ia Yanjun Bao Guoqiang J i Shoup ing　Tan Yingxia
L i Subo Zhang Yangpei Gong Feng
( Institu te of Transfusion M edicine, the Academ y of M ilitary M edical Sciences, B eijing 100850)
　　Abs trac t: 　 Based on the p revious study of construction of Pich ia pastoris engineering Strain (pP IC9K2Gal/GS115) exp ressing re2
combinant ( 2galactosidase, this report described the op timal fermentation conditions of Pich ia pastoris in a 52liter2working2volume fer2
mentor. 3 experimentswere performed with various fermentation parameters, including the volume of inoculum seed, the volume and time
of glycerol fed2batch, the volume and time of methanol fed2batch, dissolved oxygen, pH, agitation, temperature of glycerol batch phase
and methanol fed2batch phase. For each experiment, 0. 4 liter pP IC9K2Gal/GS115 cells were inoculated into 4. 5 liter basal salts medi2
um. Then 3. 5 liters of supernatant were harvested at the end of the fermentation. The results showed that the p rotein concentration in
fermentation supernatant was 3～4. 5 mg/m l, the activity ofα2galactosidase was 80 U /m l, and the enzyme activity ratio was 24～30 U /
mg. Based on the above experiments, 3 fermentations were carried out and confirmed the feasibility and stability of the technology.
Therefore, this fermentation research laid a foundation for recombinantα2galactosidase purification to obtain sufficient amounts and high2
ly purity ofα2galactosidase.
Key wo rds: 　α2galactosidase　Pich ia pastoris　H igh cell2density fermentation
收稿日期 : 2009207227
基金项目 :国家“973”项目 (2002CB713804)
作者简介 :高红伟 (19762) ,女 ,山东省茌平县人 ,硕士 ,助理研究员 ,研究方向 :血型改造方面的研究 ; E2mail: gaohongwei1976@126. com
通讯作者 :宫锋 , E2mail: gongfeng@nic. bm i. ac. cn;章扬培 , zhangyp@ nic. bm i. ac. cn　　α2半乳糖苷酶 ( EC3. 2. 1. 22)属外切糖苷酶类 ,特异性水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α2半乳糖苷键 [ 1 ]。在人、动物、植物及微生物体内均可发现α2半乳糖苷酶 ,它被广泛应用于农产品加工、人 B→O血型改造、清除异种抗原以及治疗遗传性疾病法 布莱氏病等 [ 2～5 ] 。毕赤酵母作为一种新型外源基因表达系统 ,具有一套与真核生物极其相似的分泌途径 ,能对外源蛋白进行加工、折叠和翻译后修饰 ,并将其分泌到培养基中 ,是一种较为理想的真核蛋白表达系统。该表达系统具有受甲醇调控的
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
AOX1基因强启动子 ,能通过诱导稳定高效表达外
源蛋白。现已有多种蛋白质在毕赤酵母中得到高
效表达 ,且其产生的自身分泌蛋白很少 ,从而使分
离纯化较为简便 [ 6, 7 ] 。
本实验室已将中国海南兴隆 Catimor咖啡豆α2
半乳糖苷酶 cDNA克隆到毕赤酵母中进行表达 [ 8, 9 ] ,
并将该酶应用于 B→O血型改造和酶解大豆低聚糖
的研究 [ 10 ]。在摇瓶培养的基础上 ,用 5 L发酵罐进
行了 3次发酵试验 ,探讨了发酵过程中一些重要参
数的控制及其对发酵产物的影响。在高密度条件下
高效表达了具有生物活性的重组咖啡豆α2半乳糖
苷酶 ,且证明了工艺的可行性和稳定性。
1 材料与方法
111　材料
1. 1. 1 菌株 基因重组咖啡豆α2半乳糖苷酶工程
菌 pP IC9K2Gal/GS115为本研究室构建并保存。
1. 1. 2 培养基 　MD平板 , YPD平板 ,摇瓶培养基
BMGY, BMMY,发酵所用 PTM1 trace salts,基础无机
盐培养基的配制参见 Invitrogen公司的 Pichia Fer2
mentation Process Guidelines。
1. 1. 3 设备和试剂 B IOSTAT CT25, 5 L发酵罐为
德国贝朗公司产品。对硝基 2苯基 2α2D2吡喃半乳糖
苷购自 Sigma公司 ,酵母提取物和蛋白胨为 Oxiod
公司产品 ,消泡剂购自 Sigma公司 , BCA蛋白浓度测
定试剂盒购自 Pierce公司。无机盐培养基等均为国
产分析纯试剂。
1. 2 方法
1. 2. 1　毕赤酵母工程菌高表达转化子的筛选 取
- 70℃保存的菌种 ,涂 YPD平板 ,再将长出的克隆子
点于含 G418 (3 g/L) 的 YPD平板上 ,筛选高拷贝整
合转化子 ,然后接种单菌落于 50 m l BMGY培养基
中 , 30℃, 250 r/m in培养过夜。待 OD600值达到 2～6
时 ,离心收集细胞 ,用 50 m l BMMY培养基悬浮 ,继续
培养 ,每 24 h补甲醇至终浓度为 1 % ,同时取样 ,进
行 SDS2PAGE分析筛选表达量高的转化子。
1. 2. 2 5 L发酵罐高密度发酵 　接种单菌落于 5
m lBMGY中 , 30℃、> 250 r/m in培养过夜 ;第 2天镜
检观察酵母的生长状态和有无污染 ,从检测合格的
培养物中取 4. 5 m l接种于含 450 m l BMGY的培养
瓶中 , 30℃、> 250 r/m in培养 10 h使其 OD600达到 2
～6,作为种子液。按 10%接种量将种子液接种于
4. 5 L基础无机盐培养基 (含 PTM1 4. 2 m l/L微量
元素 ) ,开始发酵。
采用溶氧反馈 2分批补料方法高密度发酵 ,发酵
控制方法 : pH5. 0 (通过氨水自动流加控制 )、搅拌速
度 500 r/m in、溶氧值 ( dissolved oxygen, DO) 20%、空
气流速为 0. 5 vvm,温度 30℃; 开始时 DO 接近
100% ,随着酵母的生长扩增 , DO值会逐渐下降 ,通
过调节转速和通气量使其维持在 20%以上 ,当 DO
升高并维持不变时表示预先加在培养基内的甘油在
18～24 h被消耗完毕 (该时间根据接种量的不同而
有变化 )。开始补加 50%甘油 (含 12 m l/L PTM1微
量元素 ) ,设定补加速度为 18. 15 m l/h·L。4 h后 ,
终止加甘油 ,开始甲醇诱导 (含 12 m l/L PTM1微量
元素 ) ,设定甲醇的速率为 3. 6 m l/h·L。当酵母完
全适应甲醇以后 (2～4 h) ,出现 DO维持稳定 ,间或
出现 DO突然升高 (大约维持 1 m in以内 ) ,然后将
甲醇供给速率调整为 7. 3 m l/h·L,维持 2 h后提
高到 10. 9 m l/h·L ,此速率维持剩下的发酵过程。
整个甲醇诱导过程大约需要 70 h,在发酵试验过
程中 ,每 4 h取样 1次 ,测定 OD600和湿菌重。甲醇
诱导结束后将所有的参数设置为停止 ,打开阀门 ,
收料。通过离心回收上清液 ( 4℃、10 000 r /m in、
15 m in)。
1. 2. 3　检测和分析方法 ( 1)菌体浓度测定 :发酵
液取样在分光光度计上测定 OD600 ;同时取样 1 m l,
10 000 r /m in离心 5 m in后称量菌体湿重。 (2)α2
半乳糖苷酶活性测定 :按参考文献 [ 11 ]方法 ,测定
α2半乳糖苷酶的活性。1 U定义 : 26℃, pH6. 5时 ,
1 m in内生成 1μmol底物所需的酶量为一个酶活性
单位。 (3)蛋白浓度测定 : BCA法测定蛋白浓度 ,按
Piece Kit说明书操作。
2 结果
2. 1 基因重组α2半乳糖苷酶工程菌的高密度发酵
工艺的确立
通过 3次发酵 ,对发酵条件的参数进行了优化 ,
初步确立了发酵工艺。定时取样镜检 ,同时测定
OD600及湿重以确认菌体状态。根据 OD600和湿菌重
可得到菌体的生长曲线 (图 1) ,在接种后 0～28 h
内 ,酵母处于对数生长期 ,菌体 OD600值接近 234. 4,
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2009年第 11期 高红伟等 :表达重组咖啡豆α2半乳糖苷酶的酵母工程菌的高密度发酵
湿重可达 205 mg/m l,初步实现了高密度培养。而
在接种后 28 h至发酵结束 ,是甲醇诱导阶段 ,酵母
生长处于平台期 ,生长速度缓慢 ,诱导结束时 ,菌体
图 1 工程菌的生长曲线
OD600值接近 551,湿重可达 368 mg/m l以上。
诱导进程中 ,于不同时间点取样进行蛋白浓度
测定和酶活性分析。如图 2所示 ,随着诱导时间的
增加 ,发酵液中α2半乳糖苷酶活性也逐渐升高 ;在
接种后 90～108 h内 ,蛋白浓度和酶活性的增加速
度最快 ,此后蛋白浓度虽有所增加 ,但酶活性保持稳
定 (图 22A, B ) ,说明酵母开始分泌杂蛋白。同时酶
比活性曲线也显示在 108 h时酶的比活性最高 ,达
到 28. 46 U /mg,然后比活性出现下降。这一结果说
明 ,发酵时间以 110 h左右为宜 ,时间过长易产生过
多的杂蛋白 ,影响下一步的纯化。
A. 蛋白浓度曲线 ; B. 酶活性曲线 ; C. 比活性曲线
图 2 发酵过程中 2半乳糖苷酶的表达
2. 2　发酵罐与摇瓶发酵液中α2半乳糖苷酶的表达
水平的比较
本研究室在构建了咖啡豆α2半乳糖苷酶酵母
工程菌株后首先进行了摇瓶的发酵扩增 ,将发酵
罐发酵所得到的数据与摇瓶发酵所得到的数据进
行了比较 ,结果如表 1所示。从表 1中可以看出 ,
发酵罐发酵上清液总蛋白浓度达 3. 0 mg /m l,小量
摇瓶扩增仅为 1. 2 mg/m l,发酵使总蛋白提高了
2. 5倍 ;发酵上清液中 α2半乳糖苷酶总酶活性达
84. 2 U /m l,摇瓶扩增仅为 18. 0 U /m l,酶活提高了
4. 68 倍 ; 发酵上清液 α2半乳糖苷酶比活性达
28. 5 U /mg,摇瓶扩增仅 15. 0 U /mg,比活性提高
了 1. 9倍。图 3是通过 SDS2PAGE对发酵罐与摇
瓶中发酵液 α2半乳糖苷酶的表达量进行了比较 ,
从图中可以清楚地看到使用发酵罐明显提高了α2
半乳糖苷酶的表达量 (图 3 )。说明用发酵罐发酵
可以大大提高酵母的生长密度 ,获得高浓度和高
活性的α2半乳糖苷酶。 表 1　发酵罐与摇瓶发酵液中α2半乳糖苷酶的表达水平的比较活性(U /m l) 蛋白浓度(mg/m l) 比活(U /mg)发酵罐发酵液 84. 2 3. 0 28. 5摇瓶发酵液　 18. 0 1. 2 15. 0A. 发酵罐培养的发酵液上清 ; B. 摇瓶培养的发酵液上清图 3　发酵罐与摇瓶发酵液中表达α2半乳糖苷酶的 SD S2PAGE
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2. 3 甘油浓度及甲醇浓度对发酵结果的影响
图 4所显示的是 1次发酵的试验结果 ,在此次
试验中 ,由于在甘油培养相期间预先加入的甘油未
完全消耗完毕就补充了甘油 ,致使发酵罐内甘油浓
度过高 ,导致酵母生长缓慢。从图中可以看出 ,甘
油培养相结束时的菌体湿重只有 152 mg/m l。同
样也是在此次试验中 ,由于在甲醇诱导开始时菌
体浓度较低 ,但是甲醇的添加速度并没有降低 ,导
致发酵罐内甲醇积聚 ,对酵母产生了毒性效应 ,酵
母生长状态很差 ,发酵液颜色黯淡 ,发酵结束后菌
体湿菌重虽然达到了 377 mg/m l,但上清液中的α2
半乳糖苷酶活性只有 38. 8 U /m l,而蛋白浓度却达
到 2. 95 mg/m l,致使α2半乳糖苷酶比活性很低 ,只
有 13. 14 U /mg。
A. 菌体生长曲线 ; B. 蛋白浓度曲线 ; C. 酶活性曲线 ; D. 比活性曲线
图 4　甘油浓度及甲醇浓度对发酵结果的影响
2. 4 发酵工艺的验证
确立工艺后又进行了 3次发酵试验以证明工艺
的可行性和稳定性。表 2中所显示的是 3次发酵试
验的结果 ,从表中可以看出 ,每次发酵所得到的结果
基本一致 ,发酵上清中 α2半乳糖苷酶活性均高于
80 U /m l,α2半乳糖苷酶蛋白浓度为 2. 9～3. 6 mg/
m l,比活性约为 24～30 U /mg。这说明我们的发酵
工艺比较稳定。
表 2　3次发酵试验结果比较
活性
(U /m l)
蛋白浓度
(mg/m l)
比活
(U /mg)
第 1次 85. 2 3. 5 24. 3
第 2次 86. 3 2. 9 29. 8
第 3次 92. 1 3. 6 25. 6
3 讨论
根据文献报导 , pH5. 0条件下毕赤酵母生长最
好 [ 12 ] ,而α2半乳糖苷酶在此条件下非常稳定 ,所以
始终将 pH值控制在 5. 0左右。这样既可使细胞处
于较好的生长状态 ,又保证了外源基因的高表达 ,
pH偏酸也减少了细菌污染的可能性。发酵过程中
最关键的参数是 DO,充足的氧气是维持酵母正常
生长的必要条件 ,同时也是酵母生命活动状态的表
征参数。在其它参数保持不变的情况下 , DO 降低
时 ,代表氧气需求量增加 ,意味着菌体处于较活跃状
态 ;若 DO高于 60% ,则表明氧气需求量减少 ,菌体
生长和分裂相对缓慢。在生长期 ,使 DO 维持在
20%以上 ,以利于菌体的快速生长。发酵进行约
18～24 h后 ,由于碳源供应不足 , DO 会突然上升 ,
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此时可进 50%的甘油补料以获得更高的菌密度 ;停
止补料后 , DO将再度上升 ,待碳源消耗殆尽时再开
始流加甲醇进行目的蛋白的诱导。
结果说明了在甘油培养相和甲醇诱导相中 ,补
充甘油的时机以及发酵液中甘油浓度对发酵的影
响 ,虽然对于毕赤酵母来说甘油是很好的碳源 ,但高
浓度的甘油反而会对酵母的生长产生抑制作用 [ 7 ]。
而甲醇相对于甘油来说不是最佳的碳源 ,因此开始
甲醇诱导时酵母有一个适应的过程 ,在诱导开始时
酵母消耗的甲醇很少 ,如果甲醇添加速度过快 ,就会
造成甲醇的积聚 ,对酵母的生长造成损害并影响α2
半乳糖苷酶的分泌 ,致使酵母生长速度降低 ,出现大
量死亡 ,结果造成杂蛋白增多 ,α2半乳糖苷酶的产量
降低 [ 13 ]。因此甘油和甲醇的添加时机以及速度是
发酵工艺中至关重要的参数。
借助基因工程技术 ,构建可分泌表达α2半乳糖
苷酶的工程菌株 ,为解决该酶在多领域应用中的大
量需求问题提供了有效途径。本研究在这一基础
上 ,确立了α2半乳糖苷酶工程菌株的发酵工艺。通
过试验对发酵条件进行了优化 ,确定了温度、pH值、
通气量、搅拌速度、DO和进料等具体参数。为重组
咖啡豆α2半乳糖苷酶在 B→O血型改造和酶解大豆
低聚糖方面的应用奠定了基础。
参 考 文 献
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2　 Som iari R I, Balogh E. Enzyme M icrob Technol, 1995, 17: 311～316.
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