全 文 ：淫羊藿甙对辐照小鼠的抗凋亡作用与半胱天冬酶活性的相关性研究
王玲巧1 , 2 ,吕秋军1＊ ,温利青1 ,曲艳燕1 ,陈媛媛1 ,张　敏1 ,郭绍明1 ,王继峰2 ,牛建昭2
(1.军事医学科学院放射医学研究所 ,北京　100850;2.北京中医药大学细胞与生化研究室 ,北京　
100029)
[ 摘要] 　目的:观察淫羊藿甙抗辐射损伤作用 ,并探讨其抗辐射损伤机制。方法:KM 种小鼠于60Co γ射线照射前
48 , 24 h 及照后即刻灌胃淫羊藿甙 , 剂量分别为 1 , 10 , 100 mg/ kg ,照射剂量8.0 Gy , 观察受照射小鼠 30 d 存活率和死
亡动物平均存活时间。另外观察淫羊藿甙对 KM种小鼠受 5.5 Gy 60Co γ射线照射后小鼠胸腺 、脾脏和骨髓细胞凋
亡率 、半胱天冬酶_3(caspase_3)和半胱天冬酶_8(caspase_8))活性的影响。结果:中剂量淫羊藿甙组 30 d存活率较照
射对照组提高50%,死亡动物平均存活时间延长2.5 d。照射对照组胸腺 、脾脏和骨髓细胞在照射后 6 , 12和 24 h 均
有凋亡。胸腺和脾脏于照射后12 h 凋亡率最高 ,骨髓于照后 6 h 凋亡率最高。 照射 24 h后 , 3 种组织的凋亡率均明
显降低。中剂量淫羊藿甙可降低照射后 6 , 12 h 胸腺 、脾脏 、骨髓细胞凋亡率和照射后 24 h 脾脏 、骨髓细胞凋亡率 ,
抑制照射后 6 h caspase_3 活性 ,对半胱天冬酶_8 活性无影响。结论:淫羊藿甙具有抗辐射损伤作用 , 其机制之一可
能是通过抑制 caspase_3活性降低细胞凋亡率。
[ 关键词] 　淫羊藿甙;抗辐射;细胞凋亡;半胱天冬酶
[ 中图分类号] 　R979.6　　　　[ 文献标识码] A
[ 中图分类号] 　1000_5501(2003)03_0169_03
Effect of icariine on cell apoptosis in irradiated mice and its relationship with activity of
caspases
WANG Ling_Qiao1 , 2 , L Qiu_Jun1 , WEN Li_Qing1 , QU Yan_Yan1 , CHEN Yuan_Yuan1 , ZHANG Min1
GUO Shao_Ming , WANG Jing_Feng2 , NIU Jian_Zhao2
(1.Institute of Radiation Medicine , Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850 , China;Beijing University of Tradition-
al Chinese Medicine , Beijing 100029 , China)
[ Abstract] 　Objective:To investigate antiradiation effect of icariine and its mechanism.Methods:Kunming mice were exposed
to whole body irradiation at dose of 8 Gy , and administered intragastrically with icariine 48 and 24 hours before and immediately af-
ter irradiation at the dosages of 1 mg/kg , 10 mg/ kg , 100 mg/kg , respectively.Thirty_day survival and the average life_span of dead
mice after irradiation were recorded.In addition , the effect of icariine on apoptosis rates and activities of caspase_3 and caspase_
8 in mice exposed to 60Co gamma irradiation at a dose of 5.5 Gy were observed.Results:The 30_day survival rate in medium dose
of icariine group increased by 50% compared with irradiated control group , while the average life span of the dead mice prolonged
by 2.5 days.The apoptosis rates of thymus , spleen and marrow cells all increased 6 , 12 and 24 hours after irradiation , but the
apoptosis rates were lower significantly 24 hours after irradiation than those 6 and 12 hours after irradiation.Medium dose of icariine
diminished apoptosis rates of all the three types of cells at 6 and 12 hours post_irradiation and reduced the apoptosis rates of spleen
and marrow cells at 24 hours post_irradiation.Data also revealed that activities of caspase_3 and caspase_8 increased at 6 hours
post_irradiation.Medium dose of icariine diminished caspase_3 activity but had no effect on caspase_8 activity.Conclusions:The
results indicate that icariine has antiradiation effect and one of its mechanisms might be restraint of caspase_3 activity and attenua-
tion of apoptosis of cells in irradiated mice.
[ Key words] 　icariine;antiradiation;apoptosis;caspases
[ 收稿日期] 　2002-11-11
[ 基金项目] 　北京市自然科学基金资助课题(7001001)
[ 作者简介] 　王玲巧(1963-),女 , 河北省石家庄市人 ,北京中
医药大学在读博士生。
＊通讯联系人
　　放射疗法是治疗肿瘤的重要手段 , 但辐射损伤导致的
机体免疫功能低下 ,使部分患者被迫终止放疗;另外 , 随着放
射诊疗新技术 、新设备的不断涌现 , 职业性受照人员的数量
逐渐增加 ,因此辐射防护日益受到人们重视。但目前已知的
具有辐射防护作用的药物 ,多数毒性比较大。药源广 、取材
天然 、毒性比较小的中药越来越受到关注。我们在筛选抗辐
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军事医学科学院院刊　2003年 6月 第 27卷 第 3期
Bull Acad Mil Med Sci , Jun 2003;　 Vol 27　No 3　
射损伤的中药过程中观察了淫羊藿甙的抗辐射损伤作用并
对其抗辐射损伤的作用机制进行了探讨。
1　材料与方法
1.1　动物
昆明种(KM)小鼠 104只 , 体重(20±2)g , 雌雄各半 , 军事
医学科学院实验动物中心提供。
1.2　药物与试剂
淫羊藿甙(icariine , ICA)由北京中医药大学生化教研室
提纯(纯度 98%)。 caspase_3 和 caspase_8 比色检测试剂盒
K2027_2 、K2029_2购自 Clontech 公司。 RNase A、碘化丙啶(PI)
购自Sigma 公司;胎牛血清(fetal bovine serum , FBS)为HyClone
公司产品 ,其余试剂为国产分析纯。
1.3　主要仪器
LABSYSTEMS MULTISKAN MS(353 型)酶标仪(Thermo
Labsystems Co., Ltd.), Cytometer FACSCalibur(B_D USA), 台式
高速冷冻离心机(D_37520 Osterode , Labofuge 400R), 自动血球
计数仪(Sysmex_800 ,日本),γ剂量辐射检测控制仪(QT_3 型 ,
军事医学科学院)。
1.4　动物分组 、照射及给药
将KM种小鼠随机分为正常对照组 、照射对照组 、小剂
量(1 mg/kg)淫羊藿甙组 、中剂量(10 mg/kg)淫羊藿甙组和大
剂量(100 mg/kg)淫羊藿甙组。每组 10 只 , 雌雄各半。 除正
常对照组外 ,各组小鼠受60Coγ射线全身一次照射 , 照射剂
量为8.0 Gy , 剂量率为 199.4 R/min。淫羊藿甙给药组于照射
前48 , 24 h 和照射后即刻灌服淫羊藿甙(用0.5%羧甲基纤维
素钠混悬)3次。照射对照组灌胃 0.5%羧甲基纤维素钠 , 给
药体积 0.01 ml/g 体重。每天观察和记录各组动物死亡数 ,
计算照射后 30 d 存活率和死亡动物平均存活时间。
另取KM种小鼠随机分为正常对照组 、照射对照组 、淫
羊藿甙(10 mg/kg)组。每组 18 只 ,雌雄各半。除正常对照组
外各组小鼠经60Coγ射线全身一次照射 , 照射剂量为5.5 Gy ,
剂量率为 195.1 R/min。淫羊藿甙组于照射前 48 , 24 h 和照
射后即刻各灌胃淫羊藿甙 1次。
1.5　胸腺 、脾脏及骨髓单细胞悬液的制备
受 5.5 Gy 60Coγ射线照射的小鼠分别于照射后 6 , 12 和
24 h 经颈椎脱臼处死 , 立即取出胸腺 、脾脏和股骨。 用 PBS
漂洗胸腺和脾脏 , 去除其表面血污 , 剪碎后置于 200目不锈
钢网筛 , 用针芯碾碎过滤 , 制成单细胞悬液。用 PBS 将股骨
骨髓腔内细胞冲出 ,用 4 号针头反复抽吸 ,制成单细胞悬液。
1.6　胸腺 、脾脏及骨髓细胞凋亡检测
取总数为1.5×106的单细胞悬液 , 于 4℃、800×g 离心
2 min。加入体积分数为 70%的冷乙醇 , -20℃放置 24 h 后 ,
800×g 离心 2 min。 PBS 洗涤后 , 加入 RNase A作用 30 min ,
再用 PI染色 ,上机检测细胞凋亡率。
1.7　caspase_3 , caspase_8 活性检测
取总数为 2×106的单细胞悬液 ,用 caspase_3 和 caspase_8
比色检测试剂盒测定 405 nm 处吸光度 , 同时用考马斯亮蓝
比色法进行蛋白定量 ,标准化 caspase 活性用吸光度/蛋白含
量(mg)表示。
1.8　数据表示及统计学方法
存活率和凋亡率用百分率表示 , 其余数据用算术均数±
标准差表示。组间凋亡率的比较用三因素析因设计资料的
统计分析 , 组间 caspase_3和 caspase_8活性的比较用两因素析
因设计资料的统计分析 , 采用 SAS 6.12 软件进行数据处理。
2　实验结果
2.1　淫羊藿甙对受照射小鼠活存率和死亡动物平均存活时
间的影响
中剂量淫羊藿甙组 30 d动物存活率和死亡动物平均存活
天数均高于照射对照组。小剂量淫羊藿甙对受照动物存活率
无影响 ,但可提高死亡动物平均存活天数。 大剂量淫羊藿甙
对存活率和死亡动物平均存活天数均无影响 ,结果见表1。
表 1　淫羊藿甙对受照小鼠 30d存活率和
死亡动物平均存活天数的影响
组　别 动物数(只)
30 d动物
存活数
(只)
30 d动物
存活率
(%)
死亡动物平
均存活天数
(t/ d)
正常对照组 10 10　 　100 　　_
照射对照组 10 1　 　10 10.1±1.3
大剂量淫羊藿甙组 10 3　 　30 12.4±3.6
中剂量淫羊藿甙组 10 6　 　60＊ 12.8±2.2＊
小剂量淫羊藿甙组 10 3　 　30 11.7±1.1＊
　＊与照射对照组比较 P<0.05
2.2　淫羊藿甙对受照射小鼠胸腺 、脾脏和骨髓细胞凋亡的
影响
5.5Gy 60Coγ射线全身照射后 , 照射对照组小鼠胸腺 、脾
脏和骨髓在照射后 6 , 12和 24 h的凋亡率均升高。胸腺和脾
脏在照射后 12 h 凋亡率最高 , 骨髓在照后 6 h 凋亡率最高。
照射后 24 h , 3 种细胞的凋亡率均明显降低 , 但仍高于正常对
照组。淫羊藿甙组胸腺 、脾脏和骨髓细胞在照射后 6 , 12 h 及
脾脏和骨髓细胞在照射后 24 h 凋亡率均低于照射对照组 , 但
仍高于正常对照组(图 1)。
图 1　ICA对照射小鼠细胞凋亡的影响
＊与正常组比较 P<0.01;★与照射组 6h比较 P<0.01;
△与照射组 12 h比较 P<0.01;■与照射组 12 h比较 P<0.05;
○与照射组 24 h比较 P<0.01;★与照射组 24 h比较 P<0.05
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2.3　淫羊藿甙对受照射小鼠 caspase_3 和 caspase_8 活性的
影响
照射对照组与正常对照组比较 ,胸腺 、脾脏和骨髓在照
射后 6 h caspase_3 和 caspase_8 活性均增高 , 淫羊藿甙组与照
射对照组比较 caspase_3 活性降低 ,但仍高于正常对照组。淫
羊藿甙对 caspase_8活性无影响 ,结果见图 2 和图 3。
图 2　ICA 对照射小鼠 caspase_3活性的影响
△与正常组比较 P<0.01;■与正常组比较 P<0.05;
★与照射组比较 P<0.01;☆与照射组比较 P<0.05
图 3　ICA 对照射小鼠 caspase_8活性的影响
△与正常组比较 P<0.01;■与正常组比较 P<0.05
3　讨论
辐射可损害免疫功能 , “补肾壮阳” 中药淫羊藿的有效
成分淫羊藿甙具有免疫激活作用[ 1] ,据此我们探讨了淫羊藿
甙的抗辐射损伤作用。本实验表明淫羊藿甙可提高受照射
小鼠30d存活率和死亡动物平均存活时间 , 表明淫羊藿甙可
能具有抗辐射损伤作用。但并非药物剂量越大效果越显著 ,
而中剂量组效果最佳 。淫羊藿甙的抗辐射损伤作用可能与
其降低 caspase_3 活性有关。
研究发现 , 照射对照组小鼠经 5.5 Gy 60Coγ射线全身照
射后 6 , 12 h ,胸腺 、脾脏和骨髓细胞凋亡率显著增高 ,照射后
24 h , 3 种组织细胞凋亡率均明显降低 , 但仍高于正常对照
组。提示 , 5.5Gy 60Coγ射线全身照射主要诱导小鼠胸腺 、脾
脏和骨髓细胞快速凋亡[ 2] 。快速凋亡主要由 caspase_3 的快
速激活所引发。 caspase_3 的活化主要通过 3 个信号途径[ 3] :
①通过细胞内感受分子(如ATM , p53)途径;②活性氧的产生
和谷胱甘肽的缺乏;③电离辐射和细胞膜直接作用使神经鞘
磷脂快速水解为神经酰胺 , 然后活化 SAPK/ JNK 前凋亡
SAPK/ JNK途径[ 4] 。淫羊藿甙可能通过调节上述信号通路 ,
使体内对辐射敏感的细胞凋亡减少。 具体作用机制有待进
一步研究。
本研究结果显示 , 照射对照组小鼠在照后6 h 胸腺 、脾脏
和骨髓细胞的 caspase_3 和 caspase_8 活性均增高 , 淫羊藿甙可
使受照小鼠的 caspase_3 活性降低 , 但对 caspase_8 活性无影
响。表明淫羊藿甙不是通过 caspase_8 降低 caspase_3活性 , 抑
制 caspase_3 活性可能是淫羊藿甙抗凋亡 、抗辐射的机制之
一。淫羊藿甙通过何种途径抑制 caspase_3 活性有待进一步
研究。
迄今为止 , 国内外已对许多天然产物的辐射防护作用进
行了研究。作者所在单位从上世纪 60 年代开始进行天然产
物的抗辐射作用研究 , 发现了一系列活性成分 ,如多糖 、生物
碱 、酯等。本研究发现淫羊藿甙具有抗辐射损伤作用 , 文献
报道淫羊藿甙还有免疫激活作用[ 5] , 因此 , 对淫羊藿甙的抗
辐射损伤作用值得进一步研究。
[参考文献]
[ 1] 　韩　冰 , 杨峻山.淫羊藿药理作用概况[ J] .中草药 , 2000 , 31
(11):873-875.
[ 2] 　Shinomiya N , Kuno Y , Yamamoto F , et al.Different mechanisms be-
tween premitotic apoptosis and postmitotic apoptosis in X_irradiated
U937 cells [ J] .Int J Radiat Oncol Biol Phys , 2000 , 47(3):767-
777.
[ 3] 　Shinomiya N.New concepts in radiation_induced apoptosi s:`premitotic
apoptosis and` postmitotic apoptosis [ J] .J Cell Mol Med , 2001 , 5
(3):240-253.
[ 4] 　Kwon KB , Yoo SJ , Ryu DG , et al.Induction of apoptosis by diallyl
disulfide through activation of caspase_3 in human leukemia HL_60
cells[ J] .Biochem Pharmacol , 2002 , 63(1):41-47.
[ 5] 　赵　勇 ,崔正言 ,张　玲 ,等.淫羊藿甙协同诱生 IL_2 , 3 , 6作用
的研究[ J] .中国免疫学杂志 ,1996 , 12(1):43-45.
(本文编辑　姜晓舜)
171第 3期　　　　　　　　　　　　　　　　王玲巧 ,等.淫羊藿甙对辐照小鼠的抗凋亡作用与半胱天冬酶活性的相关性研究