全 文 ：中国农业科技导报 , 2008, 10(2):82-87
JournalofAgriculturalScienceandTechnology
　收稿日期:2007-12-27;修回日期:2008-01-21
　基金项目:国家 948项目(2007-Z3)资助。
　作者简介:张国华 ,硕士研究生 ,从事微生物工程研究。通讯作者:姚 斌 ,研究员 ,博士 ,博士生导师 ,从事微生物工程研究。
Tel:010-68975126;E-mail:yaobin@mail.caas.net.cn。陈劲春 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,从事生物制药研究。
新疆天山雪莲根部冻土产酶微生物的初步研究
张国华 1, 2 , 　罗会颖2 , 　陈劲春 1 , 　姚　斌 2
(1.北京化工大学生命科学与技术学院 , 北京 100029;2.中国农业科学院饲料研究所 , 北京 100081)
摘　要:利用不同培养基对新疆天山雪莲根部冻土微生物进行了分离与培养 ,通过 16S或 18SrDNA序列扩增
初步鉴定了分离所得微生物 ,并构建系统发育树。结合选择性培养基进行了产蛋白酶 、产甘露聚糖酶 、产木
聚糖酶 、产纤维素酶和产淀粉酶等微生物的筛选。结果表明 ,新疆天山雪莲根部冻土中蕴含着丰富的产酶微
生物 , 分离得到的 34株细菌中大部分都能产酶 , 其中以产淀粉酶为主 ,部分产纤维素酶 、甘露聚糖酶和木聚糖
酶。产淀粉酶细菌主要属于 Pseudeomonas, Flavobacterium和 Arthrobacter等属 , 产纤维素酶细菌主要属于
Pseudeomonas和 Arthrobacter等属。分离得到的 5株真菌 ,以产淀粉酶和木聚糖酶为主。
关键词:雪莲;根部冻土;产酶微生物
中图分类号:Q93-3, Q949.783.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-0864(2008)02-0082-06
PilotStudiesonEnzyme-ProducingMicroflorainFrozenSoilatthe
RootofSaussureaeinvolucrataeKar.etKir.etMaximfrom
Tianshan, XinjiangAutonomousRegion
ZHANGGuo-hua1, 2 , LUOHui-ying2 , CHENJin-chun1 , YAOBin2
(1.CollegeofLifeScienceandTechnology, BeijingUniversityofChemicalTechnology, Beijing100029;
2.FeedResearchInstitute, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing100081, China)
Abstract:ThemicroflorainthefrozensoilattherootofSaussureaeInvolucrataeKar.etKir.etMaximfromTianshan
inXinjiangAutonomousRegionwereisolatedunderdiferentcultureconditionsandidentifiedby16Sor18SrDNA
sequencesamplification, theneighbor-joiningphylogenetictreewasthenconstructed.Themicrofloraproducingall
kindsofenzymesincludingproteinase, mannanase, xylanase, celulaseandamylaseetc, werescreenedbyselective
media.Theresultsshowedthatrichenzyme-producingmicrofloraexistedinthefrozensoil.Among34bacteriastrains
isolated, mostofthemmainlyexcretedamylase, andpartlyexcretedcelulosedegradingenzyme, suchasmannanase,
proteindegradingenzymeandxylanase.ThestrainswhichexcretedamylasearemainlyingenusofPseudeomonas,
FlavobacteriuandArthrobacter, whilethebacteriathatexcretedcellulasebelongtoPseudeomonasandArthrobacter.
Fivefungistrainsisolatedfromthefrozensoilcanproduceamylaseorxylanase.
Keywords:SaussureaeinvolucrataeKar.etKir.etMaxim;frozensoilnearroot;enzyme-producingmicroflora
　　在自然界中存在很多极端环境 ,如高盐 、强
酸 、强碱 、低温 、高热和高辐射等 ,为一般生物生长
和存活的极限 ,但却生长着能适应这些极端环境
的相应的微生物 [ 1 ～ 3] 。作为地球上的边缘生命现
象 ,极端微生物的存在 ,具有极大的应用价值 ,同
时 ,它们还能在生命的起源 、系统进化等方面给人
们以许多重要启示和拓展 。目前 ,极端微生物已
成为国际研究的热门领域 ,日本 、美国 、欧洲等国
都已经启动了极端微生物的研究计划 [ 4] 。主要
研究工作包括:①新物种的发现;②新产物的研究
与生产;③极端酶的结构与功能分析;④极端酶基
因的克隆与表达;⑤极端酶适应机理的分子基础
及遗传原理;⑥基因组分析等 [ 2] 。
在低温环境下 ,低温微生物能够生存 ,主要是
由于其酶能在低温下有效地发挥催化作用[ 4 ～ 7] 。
近年来 ,关于低温酶的研究广泛开展 ,主要集中在
其耐冷机制和生物工程应用方面。已有二十多种
低温酶得到了纯化 、基因克隆或表达 ,大部分低温
酶是从南极和北极以及海水中的低温菌中分离获
得的[ 8, 9] 。
我国的低温环境很多 ,有 49 198条冰川 ,总
面积达 59 406 km2 ,仅次于俄罗斯 、加拿大和美
国 ,居世界第四位 。此外冰川周围的冻土区 、雪线
以上的地域 ,以及巨大的深海区 ,都蕴藏着丰富的
微生物资源 ,包括大量的冷适应微生物资源[ 10] 。
因此 ,我们以新疆天山雪莲根部冻土为实验
材料 ,选择与饲料工业紧密相关的酶 ,包括蛋白
酶 、甘露聚糖酶 、木聚糖酶 、纤维素酶 、淀粉酶等进
行产酶微生物研究 ,以期为这一独特环境来源的
特殊微生物及功能基因资源库的开发奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料及培养基
1.1.1　土样　自新疆天山采取雪莲根部冻土 ,保
存 4℃备用。
1.1.2　培养基　LB液体培养基(培养对象为常
规细菌):蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、氯化钠
1%, pH7.2。 LB固体培养基为 LB液体培养基
中含有 1.5%琼脂。
高氏液体培养基(培养对象为放线菌):可溶
性淀粉 2%、硫酸亚铁 0.01‰、硫酸镁 0.05%、氯
化钠 0.05%、磷酸氢二钾 0.05%、硝酸钾 0.1%,
pH7.2。高氏固体培养基为高氏液体培养基中加
入 1.5%琼脂 。
PDA液体培养基(培养对象为真菌):去皮马
铃薯切片加水煮沸 20min,过滤 ,马铃薯浸出物浓
度 20%、葡萄糖 2%, pH7.2。PDA固体培养基为
PDA液体培养基中加入琼脂 1.5%。
产酶筛选培养基平板都包括蛋白胨 1%、酵
母提取物 0.5%、氯化钠 1%、琼脂 1.5%, pH7.2。
各添加 1%的酪蛋白 、魔芋粉 、木聚糖 、可溶性纤
维素或可溶性淀粉 ,分别用于蛋白酶 、β -甘露聚
糖酶 、 β -木聚糖酶 、纤维素酶及淀粉酶的
筛选[ 11 ～ 17] 。
1.2　菌液的制备
无菌条件下 ,取 5 g土样材料(要尽量做到均
匀取样)置于 50 mL无菌蒸馏水中 ,每隔 20 min
振荡一次 ,振荡数次充分摇匀后 ,静置 0.5 h。取
出上清用无菌蒸馏水进行梯度稀释 , 分别得到
10
-4 、10-5、10-6和 10-7倍稀释液 ,备用。
1.3　微生物的分离培养及鉴定 [ 18]
各梯度稀释菌液分别涂布在 LB培养基 、高
氏培养基和 PDA培养基平板上 , 15℃低温培养 3
～ 4d后 ,挑取形态差异的菌落(主要是通过观察
菌落的大小 、颜色 、菌落表面皱褶等形态),用相
应的液体培养基振荡培养 ,再通过稀释涂板 、菌落
划线等方法得到单一纯化菌种 。
培养各纯化菌种 ,离心收集菌体 ,用细菌基因
组提取试剂盒 (TiangenBiotechCo.LTD.), 提取
细菌基因组 DNA;用液氮冻融法提取真菌基因组
DNA[ 19] 。扩增各菌种 16S或 18SrDNA基因序
列 ,从而对分离纯化的微生物进行初步鉴定。所
用 PCR引物 、反应体系及程序如下:
细菌:根据 16SrDNA保守序列设计合成引
物:27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和
1492r(5′-TACGGHTACCTTACGACTT-3′)。反应
体系共 50 μL,包括模板基因组 DNA1.0 μL,两
种引物各 1.0 μL, 10倍反应缓冲液 5.0 μL, 2.5
mmol· L-1 dNTP4.0 μL, TaqDNApolymerase
0.5μL, ddH2O37.5 μL。反应程序为:94℃ 30
s, 55℃ 30 s, 72℃ 1.5min, 30个循环。
真菌:引物为 NS1(5′-GTAGTCATATGCTT-
GTCTC-3′), ITS4(5′-TCCTCCCGCTTATTGATAT-
GC-3′)。反应体系共 50 μL, ddH2O37.5 μL, 10
×Bufer5.0 μL, dNTP4.0 μL, NS1 1.0 μL,
ITS4 1.0μL, TaqE0.5μL,模板 1.0μL。反应程
序为:94℃ 30s, 55℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 30个循
环 。
对获得的 PCR产物进行序列分析 , 通过
BLAST程序对所获得序列进行比对 [ 20] , 结合
ClustalX1.83与 Tree-View1.6.6软件分别构建新
疆天山雪莲根部冻土微生物的系统发育树 [ 21, 22] 。
1.4　分离微生物的产酶及筛选
将纯化保存的菌液点种于产酶筛选平板上 ,
15℃低温培养 3 ～ 4 d后 ,观察水解圈情况。产蛋
白酶菌株水解圈可以从平板上直接观察。产纤维
素酶 、产 β-木聚糖酶和产 β -甘露聚糖酶菌株的水
解圈 ,需要将 0.5%刚果红倒入平板中染色 30
min,然后用 5%氯化钠浸泡脱色 1 h,出现透明圈
的为阳性。将卢哥氏碘液倒入产淀粉酶菌株平板
中 ,出现不能被碘染色的水解圈者为阳性 。
832期 张国华等:新疆天山雪莲根部冻土产酶微生物的初步研究
2　结果
2.1　微生物分离及鉴定
利用不同培养基 ,经过梯度稀释平板涂布 、单
斑分离等方法 ,共纯化得到 39株菌 ,其中包括细
菌 34株 ,真菌 5株 ,没有得到放线菌(见表 1)。
提取的 34株细菌基因组 DNA,扩增其 16S
rDNA序列 ,并用 BLAST与 NCBI数据库比较 ,结
果表明 ,序列相似性大于 99%的菌株共有 16株 ,
其中 10株属假单胞菌(Pseudomonas), L-11菌株
与 GenBank库中一种不可培养微生物表现了最
高为 100%的相似性。 13个菌株(M-1、M-2、L-2、
G-1、G-5、G-6、G-9、G-10、G-11、G-14、G-15、G-17
与 G-18)与数据库序列表现了 98%的相似性 ,主
要包括假单孢菌属 (Pseudomonas)、黄杆菌属
(Flavobacterium)和杆菌属(Bacterium)等。与数
据库细菌 16SrDNA对比最高相似度为 97%的有
L-6、G-2与 G-19, 分别为假单胞菌属 (Pseudo-
monas)和根瘤菌属(Rhizobium),有继续研究的价
值 。菌株 G-4与 G-12比对的最高相似度为
96%,为潜在的新种 。其中 G-4与 G-2(相似性
97%)之间的亲源关系较近。 L-6、G-4与 G-2处
于系统发育树的底端 ,显示出与其他分离假单胞
菌株较远的遗传距离(见图 1)。
分离得到的 5株真菌(P-1、P-2、P-4、P-5和 P-
6)与数据库中 18SrDNA比对 , 相似度都高于
99%,处于系统发育树的另外分支(见图 1)。分
别为 Zasmidiumcelare(EF137362.1)、Cryptococ-
custephrensis(DQ000318.1)、 Cryptococcussp.
(DQ645520.1)、Rhodotorulapinicola(AB126652.1)和
Cryptococcuschernovi(AF444354.1)。
2.2　微生物产酶分析
分离得到的 34株细菌中 ,大部分菌都能产生
水解酶类 ,以产生淀粉酶为主。有 19株细菌产生
淀粉酶 , 12株细菌产生纤维素酶 , 7株细菌产生木
聚糖酶 。其中 ,菌株 L-4 (Arthrobactersp.)能产生
4种水解酶 ,包括淀粉酶 、纤维素酶 、甘露聚糖酶
和木聚糖酶 。与假单胞菌具有较高的序列相似性
的菌株 L-3、L-10、G-2、G-11和 G-16都能产生 3
种水解酶。 11株细菌不产任何检测的水解酶(见
表 1),这可能与产酶诱导条件的不合适及菌群生
长环境的改变有关。
分离得到的 5株真菌中 , P-1、P-4和 P-6能产
生木聚糖酶 , P-2和 P-5能产生淀粉酶。
3　讨论
在地球两极 、高山 、冰川及冷库等特殊环境中
生活着一类微生物即冷适应微生物 [ 3, 10] 。根据其
生长温度特性可分为两类 [ 23] ,一类是必须生活在
低温下且其最高生长温度不超过 20℃,最适温度
在 15℃,在 0℃或以下可生长繁殖的微生物嗜冷
菌 。另一类其最高生长温度高于 20℃,最适温度
高于 15℃,在 0 ～ 5℃可生长繁殖的微生物称为耐
冷菌。低温微生物在低温条件下对自然界的物质
循环起重要作用 ,能分解环境中的大分子物质 ,如
蛋白质 、碳水化合物或小分子的环境污染物 ,还可
分解人工合成的一些化合物[ 24] ,对全球生态起着
重要作用。
近年来 ,低温生物的研究材料主要来源于南
极和北极以及深海水 [ 8 ～ 10] 。我国的低温环境有
很多 ,如冰川 ,冰川周围的冻土区 、雪线以上的地
域等 ,都蕴藏着丰富的微生物资源尤其是冷适应
微生物资源 ,我国已经在逐渐开展这方面的研
究 [ 10] ,但是对植被根部冻土微生物的研究很少。
本研究以从新疆天山采取的雪莲根部冻土样作为
实验的出发材料 ,研究植被根部冻土微生物分布
情况。通过分析雪莲根部冻土样的微生物分布 ,
研究结果显示植被根部冻土中以假单胞菌为优势
菌群 ,这可能与该类菌与雪莲的互作有关 。但是 ,
由于培养基 、培养温度等条件的局限性 ,分离得到
的菌株不能完全表明微生物的多态性。进一步结
合环境基因组及 PCR-DGGE等手段可以对微生
物多样性及分布有更深的了解 。
低温微生物能在低温环境下生存是由于其可
以产生在低温下有效地发挥催化作用的酶[ 4 ～ 7] 。
与常温酶相比 ,低温酶的蛋白质分子往往有更多
的氢健和盐键 ,能形成相对松动和具有弹性的结
构 ,从而增强分子结构的柔韧性 。低温酶具有高
催化活性和温度敏感性的显著特征 。本研究从分
离的微生物中筛选分析了与饲料工业紧密相关的
若干酶的产酶情况 , 包括蛋白酶 、 β -甘露聚糖
酶 、β -木聚糖酶 、纤维素酶 、淀粉酶等 。结果表
明 ,新疆天山雪莲根部冻土中蕴含着丰富的产
酶微生物 ,分离菌株没有检测到蛋白酶的产生 ,而
84 中 国 农 业 科 技 导 报 10卷
表 1　新疆天山雪莲根部冻土微生物及产酶情况
Table1　ThemicrofloraisolatedfromthefrozensoilattherootofSaussureaeinvolucrataeKar.
etKir.etMaxim.fromTianshan, Xinjiangandtheirexcretedenzymes.
菌株编号
Microfloraorder
鉴定种属及 NCBI登录号
Identifiedmicroflorangenus
andaccessionnumber
相似度
Similarity(﹪)
淀粉酶
Amylase
纤维素酶
Cellulase
甘露聚糖酶
Mannanase
木聚糖酶
Xylanase
细菌 Bacteria
M-1 Arthrobactersp.(AJ810894.1) 98 √ - - -
M-2 Flavobacteriumsp.(AM167565.1) 98 √ - - -
M-3 Pseudomonastrivialis(DQ536517.1) 99 - - - -
L-1 Pseudomonastrivialis(DQ536517.1) 99 √ - - -
L-2 Pseudomonassp.(AJ551142.1) 98 √ - √ -
L-3 Pseudomonastrivialis(DQ536517.1) 99 √ √ √ -
L-4 Arthrobactersp.(AJ810894.1) 99 √ √ √ √
L-5 Pseudomonassp.(EF419342.1) 99 √ - √ -
L-6 Pseudomonasmigulae(AF074383.1) 97 √ - - -
L-7 Acinetobacterjohnsonii(EF114343.1) 99 - √ - -
L-8 Pseudomonasmigulae(AF074383.1) 99 √ √ - -
L-9 Pseudomonassp.(DQ465010.2) 99 - - - -
L-10 Pseudomonassp.(EF601816.1) 99 √ √ √ -
L-11 Unculturedbacterium(DQ980715.1) 100 √ - - -
G-1 BacteriumH15 (AY345557.1) 98 √ - - -
G-2 Pseudomonassp.(AJ551160.1) 97 - √ √ -
G-3 Flavobacteriumsp.(AM177626.1) 99 √ - - -
G-4 Pseudomonasrhizosphaerae(AY152673.1) 96 - - - -
G-5 Pseudomonassp.(AJ551160.1) 98 √ √ - -
G-6 Pseudomonassp.(AJ551142.1) 98 √ √ - -
G-7 Arthrobacternitroguaiacolicus(AJ512504.1) 99 - - - -
G-8 Serratiaproteamaculans(AB334771.1) 99 - - - -
G-9 Flavobacteriumsp.(AM167561.1) 98 - - - -
G-10 BacteriumH15 (AY345557.1) 98 √ - - -
G-11 Pseudomonassp.(AJ551160.1) 98 √ √ √ -
G-12 Janthinobacteriumsp.(AJ551147.1) 96 - √ - -
G-13 Pseudomonassp.(AJ551142.1) 99 - - - -
G-14 Pedobacterduraquae(AM491368.1) 98 - - - -
G-15 BacteriumH15 (AY345557.1) 98 - - - -
G-16 Pseudomonasveroni(AB334768.1) 99 √ √ - √
G-17 BacteriumH15 (AY345557.1) 98 - - - -
G-18 Pseudomonassp.(AJ551160) 98 √ √ - -
G-19 Rhizobiumsp.(DQ337571.1) 97 - - - -
P-3 Pseudomonassp.(AM409368.1) 99 - - - -
真菌 Fungi
P-1 Zasmidiumcellare(EF137362.1) 100 - - - √
P-2 Cryptococcustephrensis(DQ000318.1) 100 √ - - -
P-4 Cryptococcussp.(DQ645520.1) 99 - - - √
P-5 Rhodotorulapinicola(AB126652.1) 99 √ - - -
P-6 Cryptococcuschernovi(AF444354.1) 99 - - - √
　注:√表示产酶;–表示未检测到产酶。
Note:√indicatesthepresenceofexcretedenzymes;-indicatesnoexcretedenzymesdetected.
852期 张国华等:新疆天山雪莲根部冻土产酶微生物的初步研究
图 1　新疆天山雪莲根部冻土微生物系统发育树
Fig.1　Theneighbor-joiningphylogenetictreeofthemirofloraisolatedfromthefrozensoilattheroot
ofSaussureaeinvolucrataeKar.etKir.etMaxim.fromTianshan, Xinjiang.
86 中 国 农 业 科 技 导 报 10卷
以产淀粉酶和纤维素酶为主 ,部分产甘露聚糖酶
和木聚糖酶等多糖酶 ,多糖水解酶的丰富可能利
于微生物利用植物根部的营养 。
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