全 文 ：新 疆 农 业 大 学 学 报　2008 ,31(5):11 ～ 14
Journal o f Xinj iang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2008)05-0011-04
新疆紫草遗传转化中的抗生素敏感性研究
陈永芳 , 芦韦华 , 代宁波 , 郝爱花 , 任承刚 , 王　芳
(新疆农业大学 农学院 , 乌鲁木齐　830052)
摘　要:　以新疆紫草为材料 , 采用不同浓度梯度抗生素处理未转化和转化子叶的方法 ,研究了不同浓度的卡那霉
素和头孢噻肟钠对新疆紫草子叶出愈和发根的影响。 结果表明 , 卡那霉素对新疆紫草子叶的筛选适宜浓度为
60 mg/ L , 头孢噻肟钠对新疆紫草子叶除菌适宜浓度为 600 ～ 1 000 mg/ L。抑菌继代周期为 12 d。
关键词:　新疆紫草;抗生素;发根农杆菌;抑菌
中图分类号:Q949.777.4　　　　　　文献标识码:A　
Studies on Antibiotic Susceptibility Test of
Genetic Transformation in Arnebia euchroma (Royle)Johnst
CHEN Yong-f ang , LU Wei-hua , DAI Ning-bo ,
HAO Ai-hua , REN Cheng-gang ,WANG Fang
(Col lege of Ag ronomy , Xinjiang Ag ricultural University , Urumqi 830052)
Abstract:　The ef fects o f different concentration of Kanamycin(Kan)and Cefo tax ime(Cef)on callus and
roo ting o f the cotyledons of Arnebia euchroma (Roy le)Johnst wi th dif fe rent concentration of kanamycin
and hyg roycin were investigated.The results indicated that the quality concentration of kanamycin fo r se-
lecting the co tyledons w as 60 mg/L and adequat concentration of cefotaxime w as 600 ～ 1 000 mg/L .Every
ant ibacterial successive pe riod w as 12 d.
Key words:　Arnebia euchroma (Roy le)Johnst;antibio tics;Agrobacterium rhizogenes;antibacteria
　　新疆紫草(A rnebia euchroma(Royle)Johnst
是我国传统药用紫草类植物中临床药效最好的一
种。其主要有效成分为紫草宁及其衍生物 ,具有显
著的抗菌 、消炎 、抗生育 、抗癌等作用[ 1] 。还可以作
为色素广泛用于化妆品及食品 。新疆紫草野生资源
较少 ,大量采挖势必造成资源枯竭及生态环境的破
坏[ 2] 。而利用发根农杆菌将发根基因转入新疆紫草
诱导产生生长迅速的毛状根 ,并大规模培养 ,是生产
和获得大量紫草素及其次生代谢物的有效途径 ,具
有广阔的应用前景。
在发根农杆菌介导转化中 ,筛选培养基中需要
添加抗生素来筛选转化体或杀灭农杆菌 。卡那霉素
(Kanamycin ,Kan)属于氨基葡萄糖苷类 ,由于 Kan
对转化细胞具有强烈的毒害作用 ,从而导致转化率
低[ 3] 。故它不能作为抑菌剂 ,但可用作选择标记基
因 NPT Ⅱ的筛选剂 ,即可用作选择性抗生素 。在以
卡那霉素抗性基因为筛选标记的研究中 ,卡那霉素
的选择效果最好[ 4-6] , 卡那霉素 的浓度多为
50 mg/L ,在此浓度时非转化体不能再生[ 7] 。头孢
噻肟钠(Cefotaxime ,Cef)能促进植物细胞的伸长及
愈伤组织的分化。研究表明 ,能在遗传转化试验中
具有选择压的培养基中存活下来的细胞可初步确定
为转化细胞 ,然而抗生素的毒性不能太高[ 8] 。所以
应对抗生素的浓度进行筛选 ,以使非转化细胞的生
长能被有效地抑制 、致死而不对转化细胞产生毒害 ,
从而提高转化率。
本研究以新疆紫草子叶为外植体分别在添加有
头孢噻肟钠 、卡那霉素的培养基上进行培养 ,研究新
收稿日期:2008-05-18
基金项目:国家自然科学基金项目(30560059);新疆农业大学校内前期课题
通讯作者:王芳 , E-mail:Wangfang1hao@126.com
新　疆　农　业　大　学　学　报 2008年　
疆紫草子叶对头孢噻肟钠的敏感性以选定合适的抗
生素除菌浓度及卡那霉素对紫草外植体的筛选浓
度 ,为建立新疆紫草毛状根遗传转化体系提供技术
参考 。
1　材料与方法
1.1　材 料
新疆紫草种子由新疆农业大学细胞工程研究室
提供。发根农杆菌 R1000(含抗卡那霉素基因)由湖
南农业大学细胞工程重点实验室蒋建雄博士惠赠。
卡那霉素 、头孢噻肟钠由华北制药股份有限公司
生产。
1.2　方 法
1.2.1　菌株及其培养
菌种接于 YEB 固体培养基上 , 28 ℃暗培养
2 d ,挑取单菌落接于 YEB 液体培养基 , 28 ℃,
180 r/min振荡培养 24 h 。取对数生长期菌液以
MS 液体培养基重悬后用于感染。
1.2.2　无菌苗的获得
参照文献[ 9]的方法 。
1.2.3　未感染子叶对 Kan的敏感性试验
切取苗龄为 5 d ,健壮无菌苗的子叶 ,分别接种
于含不同浓度 Kan(0 , 20 , 40 , 60 mg/ L)的 B5 培养
基上 。
1.2.4　未感染子叶对头孢噻肟钠的敏感性试验
切取苗龄为 5 d 的健壮无菌苗的子叶 ,分别接
种于含不同浓度头孢噻肟钠(0 , 200 ,400 , 600 , 800 ,
1000 mg/ L)的 B5培养基上。
1.2.5　感染子叶对 Kan的敏感性试验
切取苗龄 5 ,10 d的新疆紫草无菌苗子叶 ,预培
养 3 d后 ,用 OD 600 0.5发根农杆菌 R1000分别感
染 ,培养 2 d 后接种于含头孢噻肟钠的 B5培养基
上。经2次继代(感染后14 d)后加入不同浓度的卡
那霉素(0 ,20 ,40 ,60 mg/ L)。
1.2.6　感染子叶对头孢噻肟钠的敏感性试验
切取苗龄 5 ,10 d的新疆紫草无菌苗子叶 ,预培
养 3 d后 ,用 OD 600 0.5发根农杆菌 R1000分别感
染 ,培养 2 d后 ,接种于含不同头孢噻肟钠(0 , 200 ,
400 , 600 , 800 ,1 000 ,1 500 mg/ L)的 B5培养基上 。
1.2.7　抑菌圈试验
将OD 600 0.7的菌液混于温度为 45 ℃左右的
YEB培养基中 ,待其凝固后 ,用切去尖部的灭菌枪
头均匀打出6个小孔 ,分别向内滴加 5 μL 不同浓度
的头孢噻肟钠 , 28 ℃恒温培养 36 h 以上观察抑菌
圈的大小 。
1.2.8　抑菌时间试验
用接种环蘸取对数生长期的菌液在含有不同浓
度头孢噻肟钠的 YEB 培养基(琼脂 10 g/L),划平
板。28 ℃恒温培养观察长出单菌落的时间。
2　结果与分析
2.1　Kan对未感染子叶的影响
以无菌苗苗龄 5 d 的子叶为外植体 ,接种于添
加不同浓度抗生素的 B5 +2 , 4-D 培养基上 , 暗培
养。培养 2周的结果表明 ,随 Kan浓度的增加子叶
出愈率明显降低 ,当 Kan 浓度达到 60 mg/ L 时 ,子
叶出愈率已降至 10%以下;Kan 为 20 mg/L 时 ,随
着培养时间的延长出愈率呈增加趋势(图 1)。这可
能是由于在该浓度 Kan虽然对出愈有影响 ,但已形
成的愈伤对 Kan 具有一定的耐性 。而 Kan浓度为
40 , 60 mg/L 时 ,死亡率均超过 50%,而出愈率不超
过 1/4 ,且随着培养时间延长 ,出愈率呈下降趋势。
这是因为有些子叶白化 、死亡从而造成出愈率降低。
表明 Kan浓度超过 40 mg/L 对子叶的生长 、出愈具
有明显抑制作用 。因此可将 40 ～ 60 mg/L 作为
Kan的半致死浓度 。
图 1　Kan 对未感染子叶的影响
Fig.1　Effects of kanamycin on cotyledon explants
2.2　头孢噻肟钠(Cef)对未感染子叶的影响
由图 2可以看出 ,未感染子叶在含有 200 mg/L
Cef的培养基中出愈率最高为 88.6%,与对照差异
不大 。随 Cef浓度的升高 ,出愈率呈逐渐下降趋势 ,
达 800 mg/ L 时出愈率降至 72.9%,即 Cef 浓度为
200 ～ 800 mg/L 时对未感染子叶愈伤组织的影响幅
度不大 ,表明新疆紫草子叶对 Cef的适宜范围较广。
当 Cef为 1 000 mg/ L 时子叶出愈率明显下降 ,达
50%,即高浓度的 Cef 对子叶出愈才有明显地抑制
作用 。Cef为 1 000 mg/L 时 ,除菌效果较好 ,但外
植体褐化程度也随之增加。因此 Cef 除菌浓度为
12
　第 5 期 陈永芳 ,等:新疆紫草遗传转化中的抗生素敏感性研究
600 ～ 1 000 mg/L 时可确保外植体生长分化。
图 2　Cef 对未感染子叶出愈率的影响图 图 3　Cef 抑制发根农杆菌的效果
Fig.2　Ef fects of Cefotaxime on callus induction from cot-
yledon explants
Fig.3　The inhibition effect of Cefotaxime on a grobacte-
rium
2.3　Cef对发根农杆菌的抑制效果试验
将OD 600 0.7 的菌液混于 YEB 培养基中 ,用切
去尖部的灭菌枪头均匀打出 6个小孔 ,分别向内滴
加 5μL 不同浓度的 Cef ,由图 3 可以看出 ,抑菌圈
的大小随 Cef浓度增加而趋加大 ,分别在 500 mg/ L
和 800 mg/L 处 ,抑菌效果有陡升现象 。结合 Cef
对未感染子叶出愈的影响 ,将除菌浓度设在 500 ～
800 mg/L 为宜。
在明确了新疆紫草未感染子叶对 Cef 不同浓度
的耐受能力之后 ,有必要进一步确定头孢噻肟钠的
抑菌周期 。抗生素各浓度水平能保持其效力的时
间:未加抗生素的对照在第 2 天就开始长出明显菌
落;含 Cef 50 mg/L 的培养基第 3天开始长出明显
菌落;含 Cef 100 mg/ L的培养基第 5天开始长出菌
落;含 Cef 200 mg/ L 以上的培养基在观察期内
(12 d)未见菌落形成 。所以 ,使用 Cef对转化组织
块进行除菌时 ,浓度为 200 mg/L 以上每 12 d 继代
1次可有效地抑制农杆菌的过度增殖。若提高 Cef
的浓度应缩短继代周期 。
2.4　Kan及 Cef对感染子叶发根的影响
在除菌过程中抗生素对外植体的生长 、分化及
出愈有不同程度的影响 ,而经过发根农杆菌感染后 ,
由于抗生素与发根农杆菌对外植体的双重作用 ,因
而外植体的生长 、分化反应也不同 。2 种苗龄的子
叶经过感染而未用抗生素除菌(0 mg/L)100%均因
发根农杆菌增殖而死亡;随着抗生素浓度的增加 ,外
植体褐化率逐渐升高(图4)。感染10 d苗龄的子叶
发根率较 5 d苗龄的高 ,Cef为 600 mg/L 时发根率
最高达 14.90%。Cef 对感染 5 d 苗龄的子叶发根
有明显地抑制作用 。表明不同苗龄对 Cef及发根农
杆菌的反应不同。综合考虑褐化率 、发根率 、死亡率
及苗龄 ,确定 600 ～ 1 000 mg/L 为适宜除菌浓度。
这与新疆紫草子叶对 Cef的敏感性试验的结果相
一致 。
图 4　Cef对感染后的新疆紫草不同苗龄子叶发根的影响
Fig.4　Effects of Cefotaxime on rooting from transformed different days cotyledons
　　将感染的子叶分别接于不同浓度梯度的 Kan
培养基(均含 Cef 500 mg/L)上进行筛选 ,感染 10 d
苗龄的子叶发根率较 5 d 苗龄的高 , Kan 为 20 ～
40 mg/L时发根率最高(图 5)。Kan 对感染后 5 d
苗龄的子叶毛状根有明显抑制作用。当 Kan 浓度
较低时 ,子叶发根率较高;浓度较高时 ,对子叶发根
有明显的抑制作用 。当 Kan浓度为 20 ,40 mg/L 时
外植体褐化率 、死亡率较低 ,而发根率较高 。当筛选
培养基中 Kan 浓度为 60 mg/L ,发根率明显降低。
因此可将 60 mg/L 作为 Kan的半致死浓度 。这与
13
新　疆　农　业　大　学　学　报 2008年　
新疆紫草子叶对 Kan 的敏感性试验的结果相一致。
图 5　Kan 对感染后的新疆紫草不同苗龄子叶发根的影响
Fig.5　Effects of kanamycin on rooting from transformed dif-
ferent days cotyledons
3　讨论
许多研究认为卡那霉素在高于 50 mg/L 浓度
水平 , 外植体再生率开始下降;低于 50 mg/L 时 ,非
转化体会再生 ,从而降低转化效率[ 7] 。本试验从新
疆紫草子叶的出愈率结果看 ,我们认为筛选适宜浓
度为 60 mg/ L ,与前人的研究结果趋势一致 。从外
植体的观察情况来看 ,如果培养时间过长 ,由于卡那
霉素处于培养基中时间过长 ,效力下降 ,非转化细胞
很可能再生。因此在转化研究中还应在适当的筛选
时间内进行外植体继代 ,这不仅可以使转化细胞正
常生长 ,还可避免在继代过程中有非转化细胞出现 ,
影响筛选效果[ 10] 。本试验利用卡那霉素进行筛选
其继代时间有待进一步研究 。
虽然植物在受到生物侵染时 ,能够合成并积累
抵抗病原菌侵害的活性物质 ,是植物抗病的一种体
现[ 11] ,然而 ,许多研究表明 ,不同植物合成和积累该
种物质的能力不同 ,因而在植物遗传转化体系中必
须使用抗生素 ,以达到外植体正常生长分化 、获得转
化体的目的。因此 ,很快除去感染后增殖的发根农
杆菌而不致使外植体发病死亡 ,是利用发根农杆菌
转导发根基因 ,提高毛状根转化率的一个瓶颈。程
振东等[ 4] 曾经报道过在抑制根癌农杆菌生长的抗生
素中 ,Cef能抑制芽再生 ,引起伤口细胞褐化死亡 ,
但能促使组织生根 。而詹力平等[ 12] 认为头孢霉素
类抗生素在一定浓度范围内能够促进外植体产生不
定芽 。许多植物抗生素敏感性试验显示 ,头孢霉素
在 500 mg/L 时完全可以抑制农杆菌的生长[ 13] 。本
研究结果显示 ,新疆紫草适应 Cef的浓度范围较其
他植物广泛 ,可在 500 ～ 1 000 mg/L 范围内抑菌而
不至于使外植体大量死亡 ,这与其他许多植物有所
不同 。可能是由于新疆紫草外植体生理状态及内源
激素不同 ,使其对 Cef敏感和耐受范围有所不同。
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