全 文 ：旋覆花内酯抑制 AD模型大鼠海马
环加氧酶 2和核转录因子 κB的表达
王英杰1 ,柴锡庆 1, 2 ,韩　梅 1 ,温进坤 1
(1.河北医科大学基础医学研究所省部共建教育部重点实验室 , 河北 石家庄　050017;
2.河北化工医药职业技术学院 , 河北 石家庄　050026)
收稿日期:2007-11-02,修回日期:2008-01-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No30472167);河北省自然
科学基金资助项目(NoC2005000722)
作者简介:王英杰(1973-),男 , 博士生 , 主治医师 ,研究方向:老年
痴呆 , E-mail:yj310@yahoo.com.cn;
柴锡庆(1958-),男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向:
老年痴呆 ,通讯作者 , Tel:0311-85110002, E-mail:xqchai@
163.com
中国图书分类号:R-332;R 284.1;R 322.81;R 338.64;
R341.31;R345.41;R745.705.31
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2008)04-0437-04
摘要:目的 　观察旋覆花内酯 (l-O-acetylbritannilactone,
ABL)对 Aβ 25 ～ 35海马内注射所致阿尔采末病(Alzheimersdis-
ease, AD)模型大鼠海马环加氧酶 2(COX-2),核转录因子κB
(NF-κB)表达的影响 , 探讨其对 AD大鼠的治疗作用及机
制。方法　30只 SD大鼠随机分为对照组 、模型组及药物处
理组 , Aβ
25 ～ 35海马内注射制备 AD大鼠模型 , 药物处理组给
予 ABL26 mg· kg-1· d-1 ,模型组给予等量溶剂 , 分两次灌
胃 , 共 21 d。用 Morris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力 , 免
疫组化及 Westernblot测定大鼠海马 COX-2, NF-κB蛋白表
达。结果　AD大鼠在定位航行试验中 ,逃避潜伏期延长 , 单
位时间内跨越原平台次数减少 , 空间记忆力受损 , 与对照组
及药物处理组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05);于试
验 d2、3、 4药物处理组与对照组大鼠比较差异无统计学意
义(P>0.05)。 模型组海马 COX-2、NF-κB表达升高(P<
0.05), 分别是对照组的 2.8倍和 1.6倍 , 药物处理组 COX-
2、NF-κB表达下降 , 与模型组比较差异有统计学意义(P<
0.05)。结论　ABL的抗炎作用可能是其改善 AD大鼠学习
记忆能力的作用机制之一。
关键词:β-淀粉样蛋白;阿尔采末病;环加氧酶 2;核转录因
子 κB;旋覆花内酯;炎症
　　阿尔采末病(Alzheimersdisease, AD)是一种常
见的老年神经变性疾病 ,临床上表现为进行性认知
功能障碍和精神异常 。AD的病因至今尚未明了 ,
其发病机制有多种学说 , 其中以 β-淀粉样蛋白学
说 , tau蛋白过度磷酸化学说和基因突变学说为主 ,
但这些均不能完整地解释 AD的发生。随着近年对
AD发病机制的研究 ,脑内慢性炎症反应可能是其
重要病理特征之一 ,从而提出了 AD的炎症机制。
到目前为止仍无针对病因的防治药物 ,但许多药物
可改善 AD病人的记忆和认知功能。
欧亚旋覆花是一种传统的中草药 ,具有活血化
瘀 ,抗炎止痛之功效 。旋覆花内酯(l-O-acetylbritan-
nilactone, ABL)是从欧亚旋覆花的氯仿提取物中分
离出的一种结构上属于苯并呋喃酮衍生物的单体成
分 ,该化合物能有效抑制 RAW 264.7巨噬细胞合成
炎性介质 NO和 PGE2,并发现其作用机制与抑制核
转录因子 κB(NF-κB)活化及 iNOS和 COX-2基因表
达有关[ 1] 。该文拟以 AD发病的炎症机制为基础 ,
初步研究 ABL对 AD防治作用及其机制。
1　材料与方法
1.1　实验动物　健康♂ SD大鼠 30只(由河北省
实验动物中心提供),鼠龄 10 ～ 12 mon,体重(364.5
±15.0)g,随机分为 3组:对照组 、模型组和药物处
理组 ,每组 10只。
1.2　试剂与仪器　ABL由河北医科大学药学院从
欧亚旋覆花的氯仿提取物中分离制备(已获专利授
权);Aβ25 ～ 35购自 Sigma公司;NF-κB, COX-2抗体购
自 SantaCruz公司;免疫组化试剂盒购自北京中杉
金桥生物技术公司;脑立体定向仪:江湾 Ⅰ型 C,上
海川沙花木农机厂制造 。
1.3　Aβ25 ～ 35的孵育　用无菌生理盐水将 Aβ25 ～ 35稀
释成 10g· L-1 , 37℃孵育 72 h,使其变为聚集状态
的 Aβ25 ～ 35 ,放在 4℃冰箱备用。
1.4　药物海马内注射步骤　大鼠用质量浓度为
200 g· L-1乌拉坦 3 ml· kg-1腹腔注射麻醉后 ,固
定于脑立体定向仪上 。参照大鼠脑立体定位图
谱[ 2] ,以前囟为零点 , AP=-3.5mm, ML=2.0mm,
DV=3.0 mm为穿刺点 ,钻孔穿颅 ,用微量注射器将
Aβ25 ～ 35各 1 μl(10 μg)在 5 min缓慢注入 ,留针 5
min,对照组注射等量的生理盐水 ,退针缝合伤口 。
1.5　给药方法　术前 3d及术后 18d,药物处理组
给 ABL26mg· kg-1·d-1分 2次灌胃 ,模型组给予
等量溶剂 。
·437·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2008 Apr;24(4):437 ～ 40
1.6　大鼠空间学习记忆能力测试(Morris水迷宫)
　参照 Moris实验方法进行 ,用于测量大鼠学习和
记忆能力。本实验所用水迷宫为一直径 120 cm、高
55 cm的圆形水池 ,水池内壁被漆为黑色 ,水深 42
cm,距池壁 35 cm处放置一高 40 cm,直径 8 cm圆
台 。实验历时 5d, d1让大鼠自由游泳 2min,从 d2
起 ,每天分上 、下午两段 ,每段训练 4次。训练时随
机选择一个入水点 ,将大鼠面向池壁放入水中 ,记录
大鼠寻找并爬上平台时所需时间(即潜伏期),每次
训练间隔为 60s。如果大鼠在 120s内未找到平台 ,
须将其引至平台 ,这时潜伏期记为 120 s。在 d5最
后 1次训练后撤除水下平台 ,在同一入水点将大鼠
面向池壁放入水中 ,测其在 120 s内跨过原平台相
应位置的次数。
1.7　免疫组化染色法检测 NF-κB和 COX-2　参
照使用说明书进行 。切片常规脱蜡至水 ,蒸馏水冲
洗 , PBS浸泡 5min,浸入 EDTA缓冲液(pH=8.0),
电炉加热至 92℃ ～ 98℃ 20 min,冷却后 PBS洗涤 1
～ 2次。 3%过氧化氢室温孵育 5 ～ 10 min, PBS洗 2
min×3次 。滴加正常山羊血清封闭液 ,室温孵育 20
min,甩去多余液体。加入用 PBS稀释的 NF-κB抗
体(1 ∶100)或 COX-2抗体(1 ∶50), 4℃过夜 , PBS
冲洗 3 min×3次 。滴加生物素标记二抗 , 37℃温育
15 min。PBS洗 2 min×3次。滴加辣根酶标记链霉
卵白素工作液 , 37℃温育 10 ～ 15 min, PBS洗 2 min
×3次。 DAB室温显色 ,镜下控制反应时间 。苏木
精复染 20s,自来水洗涤 。常规脱水 、透明 、封片 ,镜
检 。
1.8　Westernblot检测 NF-κB和 COX-2蛋白　
分别取 20 μg和 200μg总蛋白提取物与 5×SDS上
样缓冲液混合均匀 , 100℃煮沸 5 min,冰上冷却 ,上
样于 PAGE凝胶加样孔内 , 120 V恒压电泳至溴酚
蓝至凝胶底部。 20V恒压分别 20 min和 50 min将
凝胶上蛋白转移至 PVDF膜 ,质量浓度为 50 g· L-1
的牛奶于 37℃封闭 1 h。将膜分别浸入兔多抗 NF-
κB(1∶400)、羊多抗 COX-2(1 ∶250)溶液 , 4℃结合
过夜。 TTBS溶液洗膜 ,将膜浸入辣根过氧化物酶标
记的二抗溶液(1 ∶10 000), 37℃反应 1 h, TTBS溶
液洗膜 ,化学发光法显色。
1.9　图像处理及统计学分析　采用美国 Kodak公
司数码成像分析软件对 Western印迹显色区带的信
号强度进行相对定量分析。数据采用用 SPSS13.0
软件进行统计分析 ,计量资料以 x±s表示 ,组间资
料应用单因素方差分析。
2　结果
2.1　ABL对大鼠学习记忆行为的影响　随着训练
时段的增加 ,所有动物寻找站台的潜伏期越来越短 ,
表明 3组大鼠通过学习 ,均可对水下的站台产生空
间定位记忆。训练 d1,模型组大鼠和药物处理组大
鼠差异无统计学意义(P>0.05),对照组大鼠与其
他两组大鼠比较 ,差别有统计学意义(P<0.05);训
练 d2、3、4,模型组大鼠平均潜伏期明显延长 ,与其
他两组比较差别具有统计学意义(P<0.05),而药
物处理组与对照组比较 ,两者之间的差异无统计学
意义(P>0.05);于训练 d5, 3组大鼠达稳定水平 ,
差别均无统计学意义(P>0.05, Fig1)。模型组大
鼠最后一次跨平台次数 (7.6 ±1.78), 较对照组
(12.4±2.73)药物处理组 (9.8±2.23)减少 (P<
0.05),提示 ABL对 Aβ25 ～ 35所致 AD大鼠模型空间
学习记忆能力障碍有明显的改善作用。
Fig1　Averagelatencyinplacenavigationtestduringthefivedays
　　＊P<0.05vsmodelgroup;#P<0.05vscontrolgroup
2.2　ABL对大鼠海马 COX-2表达的影响　免疫
组化染色阳性反应物为棕黄色 ,位于细胞膜和胞质 ,
细胞核不着色;对照组表达量低 ,几乎不着色 ,模型
组着色细胞数量多 ,染色深;药物处理组介于二者之
间(Fig2A)。Westernblot显示 ,对照组 COX-2表达
量低 ,模型组表达量明显增高 ,是对照组 2.8倍(P
<0.05), ABL处理后 ,表达明显下降 ,与模型组相
比差异有统计学意义(P<0.05, Fig2B)。
2.3　ABL抑制大鼠海马 NF-κB激活　免疫组化
染色阳性反应物为棕黄色 ,胞质与胞核均着色。对
照组表达量低 , 模型组染色细胞数量多 ,染色深 ,
ABL药物处理组介于二者之间 (Fig3A)。 Western
blot显示 ,对照组 NF-κB表达量低 ,模型组表达量增
高 ,是对照组 1.6倍 (P<0.05), ABL处理后 ,表达
明显下降 ,与模型组相比差异有显著性 (P<0.05,
Fig3B)。
·438· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2008 Apr;24(4)
Fig2　ExpressionandimmunostaininganalysisofCOX-2(n=4)
　　A:Brainsectionswereincubatedwithgoatpolyclonalanti-COX-2
antibodyandHRPconjugatedrabbitanti-goatIgG(×400);B:Proteini-
solatedfromhippocampusofcontrol, model, andtreatmentmicewasana-
lyzedforCOX-2expresionbyWesternblot;C:Statisticalresult.＊P<
0.05vsmodelgroup
3　讨论
神经元细胞外 Aβ聚集形成老年斑是 AD的典
型病理特征 ,在小胶质细胞存在的情况下 , Aβ1 ～ 42对
培养的中脑神经元的毒性作用可明显增加[ 3] 。炎
症介质和胶质细胞活化是 AD脑炎症反应的明显特
征 ,并导致神经元的死亡。 COX-2在 PS2、Tg2576转
基因鼠的海马 CA区和齿状回的表达增多 ,伴随着
Aβ1 ～ 42沉积 ,而应用吲哚美辛鼠 COX-2活性明显下
降 ,同时 Aβ聚集也明显减少 [ 4, 5] 。流行病学研究也
显示非甾体类抗炎药(nonsteroidalanti-inflammatory
drugs, NSAIDs)能明显降低 AD的发生率 [ 6, 7] 。本实
验中 ,痴呆组大鼠 COX-2表达较对照组明显增多 ,
给予 ABL处理后 , COX-2表达下降 ,表明 ABL可以
抑制 COX-2基因的表达 ,从而抑制 Aβ引起的炎症
反应。海马切片 HE染色显示药物处理组的神经元
Fig3　ExpressionandimmunostaininganalysisofNF-κB(n=4)
　　A:Brainsectionswereincubatedwithananti-NF-κBantibodyand
HRPconjugatedgoatanti-rabbitIgG(×400);B:Proteinisolatedfrom
hippocampusofcontrol, model, andtreatmentmicewasanalyzedforNF-
κBexpressionbyWesternblot.Proteinwasseparatedby8% PAGEand
transferredtoPVDFpaper;C:Statisticalresult.＊P<0.05 vsmodel
group
空泡变性 、坏死等改变较模型组明显减轻 , 提示
ABL抑制炎症反应的同时可以减弱 Aβ对神经元的
毒性作用 。
NF-κB是由 p65和 p50组成的异源二聚体 ,于
静息状态下位于胞质中 ,与其抑制蛋白 I-κB结合呈
非活性状态。受刺激后 , I-κB磷酸化降解 , NF-κB
游离并移位至胞核 ,与靶基因 κB序列结合启动基
因转录 。 Aβ是 NF-κB有效激活剂 [ 8] , NF-κB在神
经细胞中适度表达可保护其免受氧化应激损伤 ,但
它也是一种强大介导 COX-2等多种促炎因子表达
的重要转录因子 ,在胶质细胞中过度激活又可导致
炎症级联反应 , AD脑中 NF-κB的表达增高 ,神经元
中 Aβ的沉积增加 [ 9, 10] 。本试验中 ,在体注射 Aβ后
海马内 NF-κB表达明显上调 , ABL能明显抑制 NF-
·439·中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2008 Apr;24(4)
κB的表达 ,从而抑制 COX-2表达 ,抑制炎症反应发
展 ,保护神经细胞 。最近体外研究显示 ,低浓度人参
皂苷 Rg1能提高神经元中 NF-κB活性 ,同时拮抗其
在星形胶质细胞中的激活 ,从不同途径起到神经元
保护作用[ 11] 。 ABL是否对神经元和神经胶质细胞
也有类似的双向调节作用 ,尚需做进一步研究 。
综上 ,本实验结果显示痴呆组大鼠的学习记忆
能力明显下降 ,应用 ABL处理后 ,经水迷宫测试药
物处理组大鼠平均潜伏期较痴呆组大鼠明显减少 ,
单位时间内跨越原平台次数增多 ,表明 ABL具有改
善痴呆大鼠学习记忆的作用。其作用部分可能是由
于 ABL的抗炎效应引起的 。
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Inhibitionofl-O-acetylbritannilactoneonexpressionof
COX-2 andNF-κBinratshippocampuswithAD
WANGYing-jie1 , CHAIXi-qing1, 2 , HANMei1 , WENJin-kun1
(1.KeyLaboratorybyProvinceandEducationMinistry, InstituteofBasicMedicine, HebeiMedicalUniversity,
Shijiazhuang　050017, China;2.HebeiChemicalPharmaceuticalColege, Shijiazhuang　050026, China)
Abstract:Aim　Toexplorethemolecularmechanism
ofABLinratswithAD.Methods　Aβ25 ～ 35 wasinjec-
tedintobilateralhippocampustocreateADmodel.
RatswereadministeredbygavagewithABLof26 mg
· kg-1 · d-1 for3 weekstodeterminetheprotective
andtherapeuticefectsontreatmentrats.Morriswater
mazewasusedtoexaminespatialandmemoryperform-
anceofrats.Thecyclo-oxygenase-2(COX-2)andnu-
clearfactor-κB(NF-κB)proteininhippocampuswere
detectedbyimmunohistochemistryandWesternblot.
Results　ADmodelratsdisplayedspatialandmemory
impairmentshownbylongerescapelatencyandless
frequencyoftryingtofindtheplatform(P<0.05).
ABLtreatmentimprovedlearningandmemoryofrats
withADandaverageescapelatencybetweenABL-trea-
tedandcontrolratsshowednodiference(P>0.05).
LevelsofCOX-2 andNF-κBinhippocampusincreased
approximately2.8 and1.6 foldsrespectivelyinAD
modeltatsthaninthoseofratswithshamoperation(P
<0.05), butnodiferencesinlevelsofCOX-2 and
NF-κBwerefoundbetweenABL-treatedandcontrol
rats(P>0.05).Conclusion　Thepreventiveand
therapeuticefectsofABLonratswithADwasrelated
tothedegressionofCOX-2 andNF-κBexpression.
Keywords:β-amyloid;Alzheimer′sdisease;cyclo-
oxygenase-2;nuclearfactor-κB;l-O-acetylbritannilac-
tone;inflammation
·440· 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2008 Apr;24(4)