全 文 ：中国药房 2009年第 20卷第 24期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.24 · 1843·
Δ国家重点基础研究发展计划(973计划)课题(2006CB708516)
*讲师 ,博士。研究方向:中药基础、中药与神经退行性疾病。电话:
0755-26537700。E-mail:yuhuiming72@yahoo.com.cn
·中药研究 ·
基于细胞凋亡表达的中药四性模式识别系统研究 Δ
———红参 、生晒参和西洋参抗 Aβ25 -35诱导 SH -SY5Y 细胞凋亡的药性学比较
余惠 1 * ,周红祖 2(1.深圳大学医学院 ,深圳市 518060;2.深圳市中医院 ,深圳市 518020)
中图分类号 R285.5;R979.1 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)24-1843-03
摘 要 目的:研究不同药性中药———红参(温性)、生晒参(平性)和西洋参(凉性)对 β-淀粉样蛋白(Aβ25 -35)诱导 SH -SY5Y细胞凋亡的影响 。方法:用 Aβ25 -35处理 SH-SY5Y 细胞 ,复制阿尔茨海默病(AD)患者脑内神经元的病理损伤模型 ,以不同浓度的红
参水提物(WERG)、生晒参水提物(WEG)和西洋参水提物(WEAG)进行干预 , 以倒置显微镜观察其形态学变化;MT T 法测定细
胞存活率;流式细胞技术检测细胞凋亡率;蛋白印迹法测定兔抗人 B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2连接
X蛋白(Bcl-2)的表达。结果:50μmol·L -1Aβ25 -35诱导 SH-SY5Y 细胞 72 h后 ,细胞变圆 、聚集 ,细胞存活率显著降低(P <0.01)、
凋亡率显著升高(P<0.01)。Aβ25 -35与不同浓度的WERG 、WEG 和WEAG 同时孵育后 ,可显著减少细胞损伤 , 使细胞存活率升
高 、凋亡率降低 ,同时 Bax 与 Bcl-2比值显著降低 。结论:不同药性的红参 、生晒参和西洋参对 Aβ25 -35诱导的 SH-SY5Y 细胞凋亡具有不同程度的保护作用 ,其中红参作用较强。
关键词 SH -SY5Y 细胞;β-淀粉样蛋白;药性;红参;生晒参;西洋参;水提物;细胞凋亡
Apoptosis Expression-based Pattern Recognition System for Four Natures of Chinese Materia Medica
———Comparative Study on Drug Natures of the Water Extracts of Panax ginseng , Dry Panax ginseng
and Panax quinque fol ium against Aβ 25-35-induced Apoptosis of SH-SY5Y Cells
YU Hui_min(School of M edicine , Shenzhen University , Shenzhen 518060 ,China)
ZHOU Hong_zu(Shenzhen Hospi tal of Tradi tional Chinese M edicine , Shenzhen , 518020 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE :To investigate the ef fects o f w a te r ex tracts o f Pana x ginseng(w arm), dry P.gi nseng(mild),
P.quinque folium(coo l)on the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by β-am yloid protein(Aβ25 -35).METHODS:SH-SY5Y
cells were treated with Aβ25 -35 to sim ulate the patho log ic neuronic damage model in pa tient s with Alzheim er s disease , and then
treated with different doses o f w ate r ex t racts of P.ginseng(WERG),dry P.ginseng(WEG)or P.quinque f oli um(WEAG).
The m orpho logic changes o f the SH -SY5Y cells w ere observed by inverted m icroscope.Cell survival rate w as measured by
M T T assay.The percentage o f apoptosis and the expression of Bax and Bcl -2 pro teins w ere detected by Weste rn Blo t-
ting.RESU LTS:After trea tment w ith Aβ25 -35 50μmol ·L -1 for 72 hours , SH-SY5Y cells became more round and aggrega ted
and the cell survival rate w as significantly reduced(P <0.01)but the percentage o f apoptosis inc reased significantly(P <0.01).
The concomitant trea tment o f Aβ25 -35 50μmol· L -1 plus different doses o f WERG , WEG or WEAG markedly a ttenuated cell
dam age and apoptosis but increase the survival ra te o f SH -SY5Y cells and markedly reduced the Bax/Bcl-2 ra tio.CON-
CLUSION :P.ginseng , Dry P.ginseng and P.quinque f oli um have diffe rent degree o f pro tective e ffects on SH-SY5Y cells
against apoptosis induced by Aβ25 -35 , o f the 3 ex tracts , t he P.gi nseng is more po tent in e fficacy than the o ther two ex tracts.
KEY WORDS SH-SY5Y cells;β -amylo id pro tein;Drug nature;Panax ginseng;Dry Panax ginseng ;Panax quinque f oli-
um ;Water ex tract;Apoptosis
结构都要注重对各分厂等单位进行整合 , 进行流程再造 , 集中
化进行研发 、生产 、采购 , 建立统一销售网络 , 进行集中的资金
筹措;再次 ,对原来的人力资源 、质量管理 、信息管理 、法律等部
门进行整合 ,建立支持流程体系 ,提升企业管理效率 。
总之 , 在经济全球化的大背景下 , 我国有实力的中医药企
业实施跨国经营战略是其发展的必然选择 。这些企业只要有意
识地培养及利用自身优势 , 通过跨国经营与东道国区位优势结
合 , 就有可能快速积累和发展这些优势 , 成为具有强大竞争力
的中药跨国企业 。当然 , 这其中也离不开政府法律政策支持与
国际沟通 、协调 。
参考文献
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中国经济出版社 , 2008:82 ～ 85.
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版社 , 2007:146 ～ 149.
(收稿日期:2008-09-26 修回日期:2009-01-12)
· 1844· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.24 中国药房 2009年第 20卷第 24期
阿尔茨海默病(Alzheimers disease , AD)即老年痴呆症 ,
是一种中老年常见的中枢神经系统退行性病变 。有研究证实 ,
β -淀粉样蛋白(Aβ25 -35)是各种原因诱发 AD 的共同通路 , 是
AD 形成和发展的关键因素 , Aβ25 -35可导致神经突触功能失调
和神经细胞死亡 ,最终导致认知功能障碍 。而红参(温性)、生晒
参(平性)和西洋参(凉性)在临床上具有改善老年人大脑功能
的作用 。因此 , 本研究选择 Aβ25 -35诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡
作为 AD 的体外模型 , 比较不同药性的中药对 Aβ25 -35诱导
SH -SY5Y 细胞凋亡的影响 。
1 材料
1.1 仪器
CO 2培养箱(美国 Shellab公司);DC 300型倒置荧光相差
显微镜(德国 Leica 公司);超净工作台(美国 ESCO 公司);Ro_
tofix32型离心机(德国 Het tich公司);Alleg ra TM 21R 型低
温离心机 、Epics XL 型流式细胞仪(美国 Coulte r公司);Polar
S tar Galaxy 酶标仪(德国 BMG 公司)。
1.2 试药
RNA 酶(RNase)、碘化丙啶 (PI)、二甲基亚砜 (DMSO)、
M T T 、Aβ25 -35(美国 Sigma 公司);胰酶、 1640培养基 (美国
Gibico 公司);胎牛血清(FBS , 美国 Hyclone公司);兔抗人 B
细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2连
接 X蛋白(Bax)单克隆抗体 、山羊抗兔(武汉博士德生物有限
公司);红参 、生晒参和西洋参购自深圳华辉药业有限公司 , 经
湖南中医药大学药学院刘塔斯教授鉴定为真品 。
1.3 细胞
SH -SY5Y 细胞取自深圳大学医学院药理学实验室细胞
库 。用含有体积分数为 10%FBS 、1%非必需氨基酸(NEAA)的
1640培养基 ,于 37 ℃、5%的 CO 2孵箱中培养 。
2 方法
2.1 药物制备
2.1.1 红参水提物(WERG)、生晒参水提物(WEG)和西洋
参水提物(WEAG)的制备:分别取 100 g 药材粉碎 ,常规提取 3
次 , 合并滤液 ,冷冻干燥 , 分别得到 54 、40 、34 g 红参 、生晒参 、
西洋参冻干粉 ,得率分别为 54%、40%、34%。冻干粉溶于灭菌
去离子水 , 12 000 r ·m in -1离心 5m in , 上清液过 0.22μm 滤
膜 ,配成 400 mg ·mL -1(生药浓度)的WERG 、WEG 、WEAG 。
2.1.2 Aβ25 -35的准备:用样品稀释液配制 1 mmol · L -1
Aβ25 -35的母液 , —20 ℃冰箱保存 ,用前于 37 ℃老化 7 d 。
2.2 实验分组
将细胞分为正常对照 、Aβ25 -35 、红参 、生晒参和西洋参组 。
2.3 观察指标
2.3.1 M TT 法测定细胞存活率:取对数生长期细胞 ,调整细
胞密度为 1×104个 ·L -1 ,以每孔 100μL 接入 96孔板 , 37 ℃、
5%的 CO 2孵箱中培养 36 h 。36 h后吸弃旧培养基 , 正常对照
组加入 100 μL 的新鲜培养基 , Aβ25 -35组加入 100μL 含有
Aβ25 -35的培养基 ,给药组加入 100μL 含有 Aβ25 -35和不同浓度
药物的培养基 ,各浓度 6个复孔 。药物作用 72 h 后加 DMSO ,
每孔 150μL ,用酶标仪在 570 nm 波长处读取吸光度(OD)值 ,
细胞存活率=OD 实验组/OD 正常对照组×100%。重复 3次 。
2.3.2 PI 单染流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期:调
整细胞密度为 7×104个 · L -1 , 以每孔 3 mL 种入直径为 6 cm
的培养皿 。同“2.3.1”项下方法操作 。药物作用 72 h后刮取细
胞 , 1 000 r ·min -1离心 10 min , 沉淀中缓慢依次加入 70%的
冰乙醇固定 , 1 000 r ·min -1离心 10min ,调整细胞浓度为 1×
106个 ·mL -1。加 RNase至终浓度 100 mg ·mL -1 , 37 ℃水浴
30 min 。加 PI 至终浓度 50μg ·mL -1 ,4 ℃避光染色 30min后上流式细胞仪(激发波长为 488 nm ,发射波长为 610 nm)检测
各期细胞 DNA 的含量 , 以 DNA 组方图出现低于 G 1期 DNA
含量的亚 G 1峰的大小代表凋亡细胞的数值 。
2.3.3 Western blot 法检测 Bcl-2 、Bax 的含量:调整细胞
密度为 7×104个 ·mL -1 ,以每孔 3 mL 种入直径为 6 cm 的培
养皿 。同“2.3.1”项下方法操作 。药物作用 72 h后收集细胞 ,加
入细胞裂解液 , Bradfo rd 法测定蛋白含量 , 蛋白质样品经
SDS-PAGE电泳后转 PVDF 膜 。按常规技术操作 ,感光胶片 ,
显影 ,定影后拍照 。
2.4 统计学方法
数据采用 SPSS 10.0统计软件进行统计分析 ,数据用x ±
s表示;组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验 。
3 结果
3.1 MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率
与正常对照组比较 , Aβ25 -35组存活率显著降低(P <0.01);
与 Aβ 25 -35组比较 ,各用药组细胞存活率有显著性差异(P <
0.01)。当Aβ25 -35分别与 1mg ·mL -1WERG 、WEG 、WEAG 同
时孵育后 , SH-SY5Y 细胞存活率显著升高(P <0.01);当
Aβ25 -35分别与 5mg ·mL -1 WERG 、WEG 、 WEAG 同时孵育
后 , SH-SY5Y细胞存活率均显著升高(P<0.01)。结果表明 ,
WERG 、WEG 、WEAG 均对Aβ25 -35诱导的SH -SY5Y 细胞损
伤有显著的抑制作用 。红参 、生晒参、西洋参 3种中药比较 ,红参
的保护作用最好 ,生晒参次之 ,西洋参的保护作用最弱 。WERG 、
WEG 、WEAG 对SH-SY5Y 细胞存活率的影响见图1。
3.2 PI单染检测细胞凋亡
与正常对照组比较 , Aβ25 -35组凋亡率显著升高(P<0.01)。当
Aβ25 -35分别与不同浓度WERG 、WEG 、 WEAG 同时孵育后 ,
SH-SY5Y细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。结果表明 ,红参、生
晒参和西洋参能够对抗由Aβ25-35诱导的 SH-SY5Y 细胞的凋亡 ,
且红参保护作用最强 ,生晒参次之 ,西洋参保护作用最弱。WERG 、
WEG 、WEAG 对 SH -SY5Y 细胞凋亡率的影响见表 1。
表 1 WERG、WEG和WEAG对 SH-SY5Y细胞凋亡率的影
响(x ±s)
Tab 1 Effects of WERG , WEG orWEAG on the apoptotic
percentage of SH-SY5Y cells(x ±s)
组别 浓度 凋亡率/%
正常对照组 - 1.77±0.86
Aβ 2 5-35组 50μmo l·L -1 37.30±0.69*红参1组 1 mg·mL -1 4.00±1.00#
红参2组 5 mg·mL -1 2.43±0.66#
生晒参1组 1 mg·mL -1 14.70±0.90#
生晒参2组 5 mg·mL -1 7.23±0.69#
西洋参1组 1 mg·mL -1 15.52±0.93#西洋参2组 5 mg·mL -1 13.39±0.66#
与正常对照组比较:*P<0.01;与 Aβ 25-35组比较:#P<0.01
vs.normal group:*P<0.01;vs.Aβ2 5-3 5 group:#P<0.01
3.3 SH-SY5Y细胞的 Bcl-2、Bax蛋白表达
中国药房 2009年第 20卷第 24期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.24 · 1845·
Δ河南省教育厅自然科学研究计划项目(2008A 360002);河南省
教育厅高等学校青年骨干教师资助计划(2008-23)
*主管药师。研究方向:中药活性成分及新药 。电话:0371-
65589287。E-mail:dx dbz@163.com
#通讯作者:教授 , 硕士研究生导师。研究方向:中药活性成分及
新药。电话:0378-3880680。E-mail:kangweny @hotmail.com
头状蓼提取物体外抗氧化活性研究 Δ
吴彩霞 1 , 2 *,刘瑜新 1 ,常 星 1 ,康文艺 1 , 2 #(1.河南大学天然药物研究所 ,开封市 475004;2.河南省疾病预防
控制中心 ,郑州市 450003)
中图分类号 R258;R97 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)24-1845-03
摘 要 目的:研究头状蓼提取物的体外抗氧化活性 。方法:以脂溶性维生素 E及二丁基羟基甲苯(BHT)作对照 ,采用清除二苯代
苦味酰基(DPPH)自由基 、清除 [ 2 , 2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐 ] (ABTS)自由基和铁离子(Fe 3 +)还原/抗
氧化能力 (FRAP)测定法检测头状蓼石油醚 、乙酸乙酯 、甲醇提取物的体外抗氧化活性 。结果:与头状蓼石油醚 、乙酸乙酯提取物
比较 ,头状蓼甲醇提取物清除 DPPH 自由基 、清除 ABTS自由基及还原 Fe 3 +的能力较强 。结论:头状蓼甲醇提取物具有较好的体外
抗氧化活性 。3种方法中 ,DPPH 方法和 ABTS方法相关性最高 。
关键词 头状蓼;体外;抗氧化;二苯代苦味酰基;2 ,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐;铁离子还原/抗氧化能力法
In Vitro Antioxidant Activity of Extracts from Polygonum alatum
WU Cai_x ia , LIU Yu_x in , CHANG Xing , KANG Wen_y i(Insti tute of Natural Products , Henan University ,
Kai feng 475004 ,China)
WU Cai_xia ,KANG Wen_y i(Henan Center fo r Disease Control and Prevention , Zhengzhou 450003 ,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the in v itro antiox idant activ ity o f the ex t ract s f rom Polygonum alatum.METHODS:
2 , 2-dipheny l-1-picry lhydrazy l assay(DPPH), 2 , 2′-amino -di(3-ethy l-benzo thiazo line sulphonic acid-6)ammonium
salt assay(ABTS)and fer ric reducing antioxidant pow er assay(FRAP)were employed to analyze the antioxidant activity of
ex tracts(ligarine ex t ract , ace tic e ther ex trac t and methano lic ex t ract) from P.alatum w ith lipid-so luble vitamin and diben-
zy latiooluene(BHT)as controls.RESULTS:Compared with ligarine ex trac t and acetic e ther ex tract , the methano l ex trac t of
P.a lat um showed higher po tency in scaveng ing DPPH radical and ABTS radical and reducing Fe 3 +.CONCLUS ION :The
m ethano l ex tract o f P.a lat um show ed high antiox idant activ ity in vitro.Among the 3 methods , the closest cor relation w as
no ted betw een DPPH assay and ABTS assay.
KEY WORDS Polygonum a lat um ;In vit ro;Antioxidant activ ity;DPPH ;ABTS;FRAP assay
50μmol Aβ25 -35诱导 SH -SY5Y细胞 72 h后 , Bax 表达
上调 , Bcl-2表达下调 , Bax/Bcl-2比值增大 。当WERG 、
WEG 、WEAG 浓度分别为 1 、5 mg ·mL -1时 , 西洋参组 Bax/
Bcl-2比值最大 ,生晒参组次之 ,红参组最小。结果表明 ,红参保
护作用最强 , 生晒参保护作用次之 , 西洋参保护作用最弱 。
WERG 、 WEG 、 WEAG 对 Aβ25 -35诱导 SH -SY5Y 细胞的
Bcl-2 、Bax 蛋白表达的影响见图 2。
4 讨论
中药四性即中药的寒、热 、温 、凉 4种功能之气 , 是中医药
最基本的理论之一 。四性中寒和凉 、温和热 ,性质相同而程度有
异 ,热甚于温 ,寒甚于凉 。然而如何判别中药的寒 、热 、温 、凉 ,一
直是困扰中医药界的热点和难点问题 , 迄今未取得实质性的进
展 [1 ,2] 。本研究结果可以看出 ,不同药性的中药———红参(温性)、
生晒参(平性)和西洋参(凉性)对 Aβ25 -35诱导 SH-SY5Y 细胞
凋亡的影响是不同的[3] 。3种中药都能对Aβ25 -35诱导SH-SY5Y
细胞凋亡起到一定的抑制作用 , 但温性中药红参的保护作用最好 ,
平性中药生晒参次之 ,凉性中药西洋参的保护作用最弱。
综上所述 ,从凋亡学的角度研究中药的四性差异 ,有望为中
药四性理论的阐明提供新的研究思路和现代科学的依据 。
参考文献
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(收稿日期:2009-03-12 修回日期:2009-06-25)