全 文 ：5　吴寿金 ,杨秀贤 .绵马贯众化学成分的研究 〔J〕.中草药 , 1997;28
(12):712-5.
6　陈炳华 ,李淑慧 ,林菊霞 ,等 .4种鳞毛蕨科植物中总酚含量的分析
〔J〕.福建师范大学学报(自然科学版), 2003;19(1):86-90.
7　徐叔云 ,卞如濂 ,陈　修.药理实验方法学〔M〕.北京:人民卫生出
版社 , 1982:1340.
8　徐红云 , 韦丽华 , 刘春林 , 等 .老年获得性肺炎病原菌及耐药分析
〔J〕.中国微生物学杂志 , 2002;14(5):286-7.
9　KwonDY, KangOH, ChoiJG, etal.AntibacterialefectofDryopteris
crassirhizomaagainstmethicilin-resistantStaphylococcusaureus〔J〕.
Fitoterapia, 2007;78(6):430-3.
10　罗海华 ,潘实清 ,刘长秀 ,等 .贯众提取液对革兰氏阳性球菌的抑
菌作用〔J〕.热带医学杂志 , 2003;3(2):169-71.
11　陈红云 ,蒋金元 ,王超芬 ,等.绵马贯众的抗菌活性研究 〔J〕.大理
学院学报 , 2005;4(3):22-3.
〔2008-05-10收稿　 2008-10-18修回〕
(编辑　牛铁兵)
旋覆花素抑制 Aβ诱导大鼠脑海马组织炎性反应
王英杰 1　柴锡庆 2　王文胜　韩　梅　温进坤　
(河北医科大学基础医学研究所　省部共建教育部重点实验室 ,河北　石家庄　050017)
　　〔摘　要〕　目的　探讨旋覆花素对 Alzheimer病(AD)模型大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS),核转录因子 κB(NF-κB)表达的影响及治疗作用的
机制。方法　30只 SD大鼠随机分为对照组 、模型组及旋覆花素给药组 , Aβ 25 ～ 35海马内注射制备 AD大鼠模型 , 给药组每天给予旋覆花素
26mg· kg-1· d-1 ,模型组给予等量溶剂 ,分两次灌胃 ,共 21 d。用Moris水迷宫测定大鼠的学习记忆能力 ,免疫组化及 Western印迹法测定大鼠海
马 iNOS, NF-κB蛋白表达。结果　模型组海马iNOS、NF-κB基因表达升高 ,给药组 iNOS、NF-κB基因表达下降 ,与模型组比较统计学差异显著(P<
0.05)。 AD大鼠在定位航行实验中 ,逃避潜伏期延长 ,单位时间内跨越原平台次数减少,空间记忆力受损 ,与对照组及给药组大鼠比较有统计学差异
(P<0.05);于实验第 2、3、4d给药组与对照组大鼠比较统计学差异不明显(P>0.05)。结论　旋覆花素的抗炎作用可能是改善 AD大鼠学习记忆
能力的作用机制之一。
〔关键词〕　β-淀粉样蛋白;Alzheimer病;诱导型一氧化氮合酶;核转录因子 κB;旋覆花素;炎症
〔中图分类号〕　R322.81;R338.64;R341;R741.02;R931.71　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2009)08-0956-04
1　邯郸市第一医院神经内科
2　河北化工医药职业技术学院
通讯作者:柴锡庆(1958-),男 ,博士 ,教授 , 博士生导师 , 主要从事老年
痴呆发病机制的研究。
第一作者:王英杰(1973-),男 ,博士 , 副主任医师 ,主要从事老年痴呆发
病机制的研究。
　　旋覆花内酯(l-o-acetylbritannilactone, ABL)是从欧亚旋覆
花的氯仿提取物中分离出的一种结构上属于苯并呋喃酮衍生
物的单体成分 , 该化合物能有效抑制 RAW 264.7巨噬细胞合
成炎性介质 NO和 PGE2, 并发现其作用机制与抑制核转录因
子 κB(NF-κB)活化及 iNOS和 COX-2基因表达有关 〔1〕。基于
Alzheimer病(AD)是一种慢性炎症性疾病 , 旋覆花素是旋覆花
单体有效成分的特定组合 ,本研究通过观察旋覆花素对 Aβ 诱
导的 AD模型大鼠的干预效应 , 探讨其作用机制 , 旨在确定该
有效部位的药用价值和作用途径。
1　资料与方法
1.1　实验动物　健康雄性 SD大鼠 30只(由河北省实验动物
中心提供)鼠龄 10 ～ 12月龄 ,体重(364.5 ±15.0)g, 随机分为
三组:对照组 、模型组和旋覆花素给药组 ,每组 10只。
1.2　试剂与仪器　旋覆花素由河北医科大学药学院从欧亚旋
覆花的氯仿提取物中分离制备 (已获专利授权), 含 ABL
2.66 mg/ml;Aβ
25 ～ 35购自 Sigma公司;NF-κBp50、iNOS抗体购自
SantaCruz公司;免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公
司;脑立体定向仪:江湾Ⅰ型 C,上海川沙花木农机厂制造。
1.3　Aβ25～ 35的孵育用无菌生理盐水将 Aβ25 ～35稀释成 10 g/L,
37℃孵育 72h,使其变为聚集状态的 Aβ25～ 35 ,置于 4℃冰箱备用。
1.4　药物海马内注射步骤　大鼠用质量浓度为 20 g/L乌拉
坦 3 ml/kg腹腔注射麻醉后 , 固定于脑立体定向仪上。参照大
鼠脑立体定位图谱 〔2〕 , 以前囟为零点 , AP=-3.5 mm, ML=
2.0mm, DV=3.0 mm为穿刺点 , 钻孔穿颅 , 用微量注射器将
Aβ 25 ～ 35各 1μl(10μg)在 5 min缓慢注入 , 留针 5min,对照组注
射等量的生理盐水 , 退针缝合伤口。
1.5　给药方法　术前 3 d及术后 18 d, 给药组给旋覆花素
26 mg/kg分 2次灌胃 , 模型组给予等量溶剂。
1.6　大鼠空间学习记忆能力测试(Morris水迷宫)　参照 Mor-
ris实验方法进行 ,用于测量大鼠学习和记忆能力。本实验所用
水迷宫为一直径 120 cm、高 55 cm的圆形水池 , 水池内壁被漆
为黑色 , 水深 42cm,距池壁 35cm处放置一高 40cm,直径 8cm
圆台。实验共 5d,实验前 1d让大鼠自由游泳 2min, 从第 1天
起 , 每天分上 、下午两段 , 每段训练 4次。训练时随机选择一个
入水点 , 将大鼠面向池壁放入水中 , 记录大鼠寻找并爬上平台
所需时间(即潜伏期), 每次训练间隔 60 s。如果大鼠在 120 s
内未找到平台 , 须将其引至平台 , 这时潜伏期记为 120 s。在第
5天最后一次训练后撤除水下平台 , 在同一入水点将大鼠面向
池壁放入水中 , 测其在 120s内跨过原平台相应位置的次数。
1.7　免疫组化染色法检测 iNOS和 NF-κB　参照使用说明书
·956· 中国老年学杂志 2009年 4月第 29卷
进行。切片常规脱蜡至水 , 蒸馏水冲洗 , PBS浸泡 5 min, 浸入
EDTA缓冲液(pH=8.0), 电炉加热至 92℃ ～ 98℃20 min, 冷却
后 PBS洗涤 1 ～ 2次。 3%过氧化氢室温孵育 5 ～ 10 min, PBS
洗 2 min×3次。滴加正常山羊血清封闭液 , 室温孵育 20 min,
甩去多余液体。加入用 PBS稀释的 iNOS抗体(1∶50)或 NF-κB
p50抗体(1∶400), 4℃过夜 , PBS冲洗 3 min×3次。滴加生物
素标记二抗 , 37℃温育 15 min。 PBS洗 2 min×3次。滴加辣根
酶标记链霉卵白素工作液 , 37℃温育 10 ～ 15 min, PBS洗
2 min×3次。 DAB室温显色 , 镜下控制反应时间。苏木素复染
20 s,自来水洗涤。常规脱水 、透明 、封片 , 镜检。
1.8　Western印迹法检测 iNOS和 NF-κB蛋白 　分别取
200μg总蛋白和 20μg核蛋白提取物与 5×SDS上样缓冲液混
合均匀 , 100℃煮沸 5 min,冰上冷却 ,上样于 PAGE凝胶加样孔
内 , 120V恒压电泳至溴酚蓝至凝胶底部。 20V恒压分别
120min和 30 min将凝胶上蛋白转移至 PVDF膜 , 质量浓度为
50 g/L的牛奶于 37℃封闭 1 h。将膜分别浸入兔多抗 iNOS
(1∶300)、兔多抗 NF-κB(1∶400)溶液 , 4℃结合过夜。 TTBS溶
液洗膜 , 将膜 浸入辣 根过氧 化物酶 标记 的二抗 溶液
(1∶10 000), 37℃反应 1h, TTBS溶液洗膜 , 化学发光法显色。
1.9　图像处理及统计学分析　采用美国 Kodak公司数码成像
分析软件对 Western印记显色区带的信号强度进行相对定量分
析。数据采用 SPSS13.0软件进行统计分析 ,计量资料以 x±s
表示 , 组间资料应用单因素方差分析。
2　结　果
2.1　旋覆花素对大鼠海马 iNOS表达的影响　免疫组化染色
阳性反应物为棕黄色 , 位于细胞膜和胞质 , 细胞核不着色。对
照组海马组织 iNOS阳性染色细胞数量少 , 且几乎不着色;模型
组海马组织 iNOS阳性染色细胞数量多 , 着色深;旋覆花素给药
组大鼠 iNOS阳性染色细胞数量较模型组海马组织减少 , 着色
较浅 , 但仍比对照组数量多 , 着色深(图 1)。 Western印迹显
示 , 对照组海马组织 iNOS表达量低 ,模型组海马组织表达量显
著增高(P<0.05);给予旋覆花素治疗后 ,大鼠脑海马组织 iN-
OS表达量明显下降 , 与模型组相比差异有统计学意义(P<
0.05)(图 2)。
图 1　大鼠海马组织切片 iNOS免疫组化染色(×200)
图 2　旋复花素抑制大鼠海马 iNOS表达
2.2　旋覆花素对大鼠海马 NF-κBp50表达的影响　免疫组化
染色阳性反应物为棕黄色 , 胞质与胞核均着色。结果发现 , 对
照组海马组织 NF-κBp50阳性染色细胞数量少 , 着色浅;模型
组海马可见大量 NF-κBp50 阳性染色细胞 , 染色细胞数量多 ,
着色深;旋覆花素给药组大鼠脑海马组织 NF-κBp50阳性染色
细胞数较模型组显著减少 , 着色浅(图 3)。 Western印迹显示 ,
在对照组细胞中 NF-κBp50主要分布于细胞浆中 , 细胞核中仅
有少量的 NF-κBp50存在;Aβ 诱导的 AD模型大鼠脑海马组织
细胞核内 NF-κBp50水平显著升高(P<0.05);服用旋覆花素
的给药组大鼠脑海马组织细胞核中 NF-κBp50的表达量与模
型组相比显著减少(P<0.05)。三组海马组织细胞浆中 NF-κB
p50的含量无明显差异(图 4)。
2.3　旋覆花素对大鼠学习记忆行为的影响　随着训练时段的增
加,所有动物寻找站台的潜伏期越来越短 ,表明三组大鼠通过学习,
均可对水下的站台产生空间定位记忆。训练第 1天,模型组大鼠和
给药组大鼠差别不具有统计学意义(P>0.05),对照组大鼠与其他
两组大鼠比较,差别有统计学意义(P<0.05);训练第 2、3、4天, 模
型组大鼠平均潜伏期明显延长与其他两组比较差别具有统计学意
义(P<0.05),而给药组与对照组比较,两者之间的差异不具有统
计学意义(P>0.05);于训练第 5天, 三组大鼠达稳定水平 ,差别均
无统计学意义(P>0.05)(图 5)。模型组大鼠最后一次跨平台次数
(7.6 ±1.78),较对照组(12.4 ± 2.73)及给药组(9.8 ± 2.23)减
少(P<0.05),提示ABL对Aβ25～ 35所致AD大鼠模型空间学习记忆
能力障碍有明显的改善作用。
·957·王英杰等　旋覆花素抑制 Aβ诱导大鼠脑海马组织炎性反应　第 8期
图 3　大鼠海马组织切片 NF-κB免疫组化染色(×400)
图 4　旋复花素抑制大鼠海马组织 NF-κBp50表达
图 5　定位航行实验中各组大鼠平均潜伏期的变化
3　讨　论
　　AD的病因至今尚未明了 ,其发病机制有多种学说 , 其中以
β -淀粉样蛋白学说 ,但均不能完整地解释 AD的发生。近年认
识到脑内慢性炎症反应可能是其重要病理特征之一 , 从而提出
了 AD的炎症机制。
　　神经元细胞外 Aβ 聚集形成老年斑是 AD的典型病理特
征 , 在小胶质细胞存在的情况下 , Aβ 1 ～ 42对培养的中脑神经元的
毒性作用可明显增加 〔3〕。在 AD脑内 , 激活的小胶质细胞促进
iNOS的表达持续产生大量 NO, 还可产生 α干扰素以增加 NO
的产量。 NO除作为自由基以及与超氧阴离子结合形成超氧亚
硝酸盐(ONOO-)具有直接毒性外 , 还可通过激活 COX-2, 进一
步激活炎症前阶段 ,产生花生四烯酸的级联放大反应而参与炎
症反应。体外实验证实 , Aβ 能诱导胶质细胞表达 iNOS,产生大
量 NO导致神经元死亡 〔4〕。在体研究进一步表明 , 脑内 Aβ 注
射可导致局部胶质细胞增生伴 iNOS大量表达 〔5〕 , 特异性 iNOS
抑制剂可完全阻断在体条件下的 NO合成 〔6〕。本实验发现 ,在
体条件下对照组大鼠海马 iNOS表达很少 , Aβ 海马内注射可刺
激海马组织 iNOS的表达增多 ,服用旋覆花素后 ,给药组大鼠脑
海马组织 iNOS表达较模型组大鼠显著降低。表明旋覆花素可
以抑制 Aβ 诱导的 AD模型大鼠脑海马组织的 iNOS表达。
　　Aβ 是 NF-κB的有效激活剂 〔7〕 , NF-κB在神经细胞中适度
表达可保护其免受氧化应激损伤 , 但它也是一种强大介导
COX-2、iNOS等多种促炎因子表达的重要转录因子 〔8〕 , 在胶质
细胞中过度激活又可导致炎症级联反应 , 研究显示 AD脑中
NF-κB的表达增高 , 伴随 Aβ 的沉积增加 〔9 , 10〕。抑制 NF-κB活
性可以减少 Aβ 的产生 , 减弱 Aβ 的神经毒性 〔11 , 12〕。本实验结
果发现 ,旋覆花素给药组大鼠脑海马组织 NF-κB的表达量与模
型组相比明显减少 ,但胞浆蛋白 NF-κB的表达量则与模型组基
本相同。说明旋覆花素的抗炎机制与抑制 NF-κB活化 , 下调其
下游基因 iNOS表达有关。
　　海马切片 HE染色显示给药组的神经元胶质细胞浸润 、空泡
变性 、坏死等改变较模型组明显减轻 ,提示旋覆花素抑制炎症反
应的同时可以减弱 Aβ 对神经元的毒性作用。痴呆组大鼠的学
习记忆能力明显下降 , 应用旋覆花素处理后 , 经水迷宫测试给药
组大鼠平均潜伏期较痴呆组大鼠明显减少 ,单位时间内跨越原平
台次数增多 ,表明旋覆花素具有改善痴呆大鼠学习记忆的作用 ,
其作用部分可能是由于旋覆花素的抗炎效应引起的。
4　参考文献
1　HanM, WenJK, ZhengB, etal.AcetylbritannilactonesuppressesNOand
PGE2 synthesisinRAW 264.7macrophagesthroughtheinhibitionofiN-
OSandCOX-2geneexpression〔J〕.LifeSci, 2004;75(6):675-84.
2　PaxinosG, WatsonC.Theratbraininsterotaxiccoordinates〔M〕.5the-
d.Sydney:ElsevierAcademicPress, 2005:102.
3　QinL, LiuY, CooperC, etal.Microgliaenhancebeta-amyloidpeptide-in-
ducedtoxicityincorticalandmesencephalicneuronsbyproducingreac-
tiveoxygenspecies〔J〕.JNeurochem, 2002;83(4):973-83.
4　CombsOK, KzrloJC, KaoSC, etal.Beta-amyliodstimulationdomicroglia
·958· 中国老年学杂志 2009年 4月第 29卷
andnonocytesresultsinTNFalpha-dependentexpressionofinducibleni-
tricoxidesynthaseandneuronalapoptosis〔J〕.JNeurosci, 2001;21(4):
1179-88.
5　WeldonDT, RogersSD, GhilardiJR, etal.Fibrilarbeta-amyloidinduces
microglialphagocytosis, expressionofinduciblenitricoxidesythase, and
lossofaselectpopulationofneuronsintheratCNSinvivo〔J〕.JNeu-
rosci, 1998;18(6):2161-73.
6　IshiiK, MuelhauserF, LeiblU, etal.SubacuteNOgenerationinducedby
Alzheimer′sbeta-amyloidinthelivingbrain:reversalbyinhibitionofin-
ducibleNOsynthase〔J〕.FASEBJ, 2000;14(11):1485-9.
7　FererI, MartiE, LopezE, etal.NF-κBimmunoreactivityisobservedin
asociationwithbetaA4 difuseplaquesinpatientswithAlzheimerdis-
ease〔J〕.NeuropatholApplNeurobiol, 1998;24(4):271-7.
8　CombsCK, KarloJC, KaoSC, etal.Beta-amyloidstimulationofmicroglia
andmonocytesresultsinTNFalpha-dependentexpressionofinducibleni-
tricoxidesynthaseandneuronalapoptosis〔J〕.JNeurosci, 2001;21(4):
1179-88.
9　YoshiyamaY, AraiK, HatoriT.EnhancedexpresionofNF-κBwithneu-
rofibrillarypathologyinAlzheimer′sdisease〔J〕.Neuroreport, 2001;12
(12):2641-5.
10　TomitaS, FujitaT, KirinoY, etal.PDZdomain-dependentsuppression
ofNF-B/p65-inducedAβ 42 productionbyaneuron-specificX11-like
protein〔J〕.JBiolChem, 2000;275(17):13056-60.
11　ChenJ, ZhouY, Mueller-SteinerS, etal.SIRT1 protectsagainstmicro-
glia-dependentamyloid-betatoxicitythroughinhibitingNF-kappaBsig-
naling〔J〕.JBiolChem, 2005;(48):40364-74.
12　ParisD, PatelN, QuadrosA, etal.InhibitionofAβ productionbyNF-κB
inhibitors〔J〕.NeurosciLet, 2007;415(1):11-6.
〔2008-09-17收稿　 2009-02-11修回〕
(编辑　曲　莉)
TRAIL与 DDP联合诱导急性淋巴细胞白血病 Jurkat细胞凋亡的实验研究
毕林涛　高长斌 1　宿晓云 2　卢振霞　(吉林大学中日联谊医院血液肿瘤科 ,吉林　长春　130031)
　　〔摘　要〕　目的　探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与顺铂(DDP)联合应用对急性淋巴细胞白血病细胞的抑制作用 ,为白血病的
临床治疗提供新思路。方法　构建重组载体 pACCMV-TRAIL,用脂质体法进行细胞转染 , MTT法检测单独或联用 TRAIL及 DDP处理的各组肿瘤细
胞的增殖变化 , FCM技术检测细胞凋亡变化。结果　DDP组 、TRAIL转染组及联合用药组细胞增殖抑制率均高于空白对照组(均 P<0.05),且联合
用药组高于单独用药组(P<0.05);FCM示凋亡率也明显增高。结论　TRAIL和 DDP联用可抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖 ,具有协调作用。
〔关键词〕　肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;顺铂;急性淋巴细胞白血病;凋亡
〔中图分类号〕　R733.7　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2009)08-0959-03
1　本院干部科　2　吉林大学药学院
通讯作者:卢振霞(1960-),女 ,硕士生导师, 教授 ,主要从事淋巴瘤的基
因治疗研究。
第一作者:毕林涛(1975-),女 ,在读博士 , 主治医师 ,主要从事淋巴瘤的
基因治疗研究。
　　肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactor-relat-
edapoptosis-inducingligand, TRAIL)属于Ⅱ型跨膜蛋白质 ,具有在
体外或体内大量 、快速诱导凋亡的作用。与其他可诱导凋亡的
物质不同 , TRAIL能够选择性杀伤肿瘤细胞 , 而正常细胞可逃逸
其诱导凋亡的作用 , 这引起了众多研究者的兴趣。当 TRAIL与
一些能诱导 DNA损伤的方法 , 如化疗或放疗联合应用时, 可增
强其诱导凋亡的能力 〔1 , 2〕。目前国内外学者已有应用 TRAIL联
合顺铂 、依托泊甙、阿霉素 、氟尿嘧啶 、丝裂霉素等化疗药物处理
胶质瘤细胞、间皮瘤细胞 、结肠癌细胞以及肝癌细胞的研究报
道 〔1 , 3 ～ 5〕 ,但联合应用诱导凋亡的机制尚未完全阐明。本研究将
单独或联合使用 TRAIL及化疗药物顺铂(DDP),观察不同方案
对 Jurkat细胞体外增殖的抑制作用, 以确定 DDP与 TRAIL联合
应用是否具有协同效应 ,并对其机制进行初步探讨。
1　材料与方法
1.1　实验材料　RPMI1640培养基 、胎牛血清购自 Gibco公
司;脂质体 2000购自 Invitrogen公司;PI染色试剂盒购自北京
鼎国生物科技有限公司;顺铂注射液购自江苏豪森公司;MTT
购自 Sigma公司;人 T淋巴细胞白血病 Jurkat细胞株由实验室
自行保存并培养;重组质粒 pACCMV-TRAIL由本实验室自行
构建并保存 , 已将 TRAIL基因克隆至 CMV启动子之后。
1.2　实验方法
1.2.1　Jurkat细胞培养及转染　人 T淋巴细胞白血病细胞株
Jurkat系本实验室常规培养 , 生长于含 10%胎牛血清的 RPMI
1640完全培养液中 , 37℃、5%CO2培养箱中生长。
　　取对数生长期细胞 , 离心后用无抗生素的培养基稀释 , 以
2×106细胞 /ml浓度接种到培养板中 , 用 Lipofectamine2000进
行转染 , 96孔板中每孔加入 Lipofectamine2000 0.5μl, 质粒
0.2μg;6孔板每孔加入 Lipofectamine2000 10 μl, 质粒 4 μg。
具体操作按试剂说明书进行。 转染 4 h后离心换液去除脂质
体 , 继续培养 24 h。
1.2.2　化疗药物亚细胞毒剂量浓度的测定　取对数生长期细
胞 , 以 2×106细胞 /ml浓度接种至 96孔培养板中 ,每孔 200μl。
加入不同浓度 DDP, 终浓度分别为 100、 50、 25、 12.5、 6.25、
3.125 μg/ml, 空白对照组加入等体积培养基 ,各组设 3复孔 ,加
药 24h后进行 MTT检测。每孔加入 5 g/LMTT20 μl, 37℃孵
育 4 h, 洗净孔中液体 , 加入 200 μlDMSO,待 MTT结晶充分溶
·959·毕林涛等　TRAIL与DDP联合诱导急性淋巴细胞白血病 Jurkat细胞凋亡的实验研究　第 8期