全 文 ：基金项目：新疆维吾尔自治区科研机构创新发展专项（２０１５００７）
作者简介：罗嘉楠（１９９２－），女，在读硕士，研究方向：新疆特色中药资源开发与利用。
通信作者：热娜·卡斯木，女（维吾尔族），博士，教授，博士生导师，研究方向：新疆特色中药资源开发与利用研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｅｎａｋｓｓｉｍｕ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
通信作者：闫　明，男，硕士，研究员，研究方向：药物分析与新药开发，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｍｉｎｇ２１ｃｎ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
类叶升麻苷对β－淀粉样蛋白聚集影响的体外研究
罗嘉楠１，高　莉２，黄　晏３，闫　明２，热娜·卡斯木１
（１新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　８３００１１；２新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所新疆维吾尔医方剂学重点实验室，乌鲁木齐　８３００４９；
３军事医学科学院毒物药物研究所，北京　１００８５０）
摘要：目的　研究类叶升麻苷（Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ，ＡＳ）在体外对β－淀粉样蛋白片段（Ａβ１－４２）聚集的影响。方法　采
用硫黄素Ｔ（Ｔｈ－Ｔ）结合实验研究各个浓度ＡＳ对单体态Ａβ１－４２聚集的抑制作用以及对聚集态Ａβ１－４２的解聚作用、呈
现出的量效关系；通过对ＡＳ和ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ进行３００～６００ｎｍ全波长吸收光谱扫描以及（１６０、３２０、６４０μｍｏｌ／Ｌ）ＡＳ
与（１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０和３２０μｍｏｌ／Ｌ）Ｔｈ－Ｔ竞争结合实验，排除实验中可能存在的假阳性因素。结
果　硫黄素Ｔ结合实验表明，加入ＡＳ共同孵育２４ｈ后，单体态或聚集态Ａβ１－４２的荧光强度均能减弱；全波长吸收
光谱扫描显示在４５０ｎｍ和４８５ｎｍ处，ＡＳ、ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ均无特异性吸收峰，在４５０ｎｍ处给予刺激后，４８５ｎｍ附近
也没有出现强的吸收；竞争结合实验表明，固定ＡＳ浓度，增加Ｔｈ－Ｔ浓度，不会使荧光强度恢复至未加入ＡＳ组，则
两者不存在相关结合位点；在ＡＳ影响Ａβ１－４２聚集的量效关系实验中，ＡＳ抑制 Ａβ１－４２聚集的ＩＣ５０为２５４．３μｍｏｌ／Ｌ，
对聚集态Ａβ１－４２解聚的ＩＣ５０为２８２μｍｏｌ／Ｌ。结论　ＡＳ可有效抑制单体态Ａβ１－４２的聚集，对聚集态的Ａβ１－４２也有明
显解聚作用，提示ＡＳ对老年痴呆具有潜在的治疗作用。
关键词：阿尔兹海默病；类叶升麻苷；β－淀粉样蛋白；硫黄素Ｔ
中图分类号：Ｒ９６６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－５５５１（２０１７）０２－０２２０－０２
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－５５５１．２０１７．０２．０２３
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ｏｎ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆβ－ａｍｙｌｏｉｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ＬＵＯ　Ｊｉａｎａｎ１，ＧＡＯ　Ｌｉ　２，ＨＵＡＮＧ　Ｙａｎ３，ＹＡＮ　Ｍｉｎ２，Ｒｅｎａ　Ｋａｓｉｍｕ１
（１　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００１１，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｕｙｇｈｕｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ
Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｕｙｇｈｕｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｒｍｕｑｉ　８３００４９，Ｃｈｉｎａ；３　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ
Ｍｅｄｉｃａｌ　ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａβ１－４２ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　
Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ　Ｔ（Ｔｈ－Ｔ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＡＳ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｇ－
ｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｍｅｒ　Ａβ１－４２ａｎｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　Ａβ１－４２；ｔｈｅ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｔｈ－Ｔ　ａｎｄ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ｆｒｏｍ　３００ｎｍ　ｔｏ　６００ｕｍ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ
ｒｕｌｅ　ｏｕｔ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ　Ｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＡＳ　ｃｏｕｌｄ　ｄｅ－
ｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｗｈｅｎ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｍｅｒ　Ａβｏｒ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　Ａβｆｏｒ　２４ｈ．Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ
ｓｐｅｃｔｒａ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＡＳ，ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｐｅａｋ　ａｔ　４５０ｎｍ　ａｎｄ　４８５ｎｍ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ
ｓｔｒｏｎｇ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｎｅａｒ　４８５ｎｍ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｔ　４５０ｎｍ；Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｆｉｘｅｄ
ＡＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｔｏ　ｂｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈ－Ｔ，ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｔｏ　ｒｅｓｔｏｒｅ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｎ－
ｓｉｔｙ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｔｏ　Ｔｈ－Ｔ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｒｅｌｅｖａｎｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ
　第４０卷　第２期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Ｖｏｌ．４０　Ｎｏ．２
　２０１７年２月 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｅｂ．２０１７
ｓｉｔｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ；．Ｔｈｅ　ＩＣ５０ｗａｓ　２５４．３μｍｏｌ／Ｌ　ｗｈｅｎ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ
ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａβ１－４２，ｗｈｅｒｅａｓ　ＩＣ５０ｗａｓ　２８２μｍｏｌ／Ｌ　ｗｈｅｎ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｂｌｅ　ｔｏ
ｓｅｇｒｅｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａβ１－４２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｔｏ　ｂｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｔｈｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａβ１－４２ａｎｄ　ｏｆ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａβ１－４２，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌｙ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ；β－ａｍｙｌｏｉｄ；ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｔ
　　阿尔兹海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一
种病因未明、发病机制极其复杂的神经退行性疾病，
其特征与患者年龄相关，临床表现为患者认知功能
障碍和记忆功能减退，其三大特征性病理改变为老
年斑、神经纤维缠结和神经元尤其胆碱能神经元缺
失［１］。目前“淀粉样假说”是关于ＡＤ发病机制的一
种主流认识，认为ＡＤ病人主要病理特征是β－淀粉
样蛋白片段（Ａβ）的产生、聚集、沉淀，最终形成老年
斑，导致在学习、记忆和其他认知功能的减退，因此
抑制Ａβ的聚集可减缓病情的进程，成为预防和治疗
ＡＤ的有效治疗方法［２－３］。类叶升麻苷（Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ，
ＡＳ）又名麦角甾苷、毛蕊花糖苷，是一种水溶性较强
的苯乙醇苷类化合物，是中药肉苁蓉的主要有效成
分，具有抗氧化损伤、神经保护、补肾壮阳、改善记忆
的作用［４－５］。本课题组前期研究表明，ＡＳ对东莨菪
碱致小鼠学习记忆障碍和Ｄ－半乳糖致 ＡＤ病样小
鼠均有改善作用［６－７］。本研究旨在探讨ＡＳ在体外
对Ａβ聚集的改善作用，为ＡＳ作为以Ａβ为靶点的
ＡＤ抑制剂开发提供理论基础，现报道如下。
１　材料与方法
１．１　仪器与试剂　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６型二氧化碳培养箱
（力申科学仪器），ＶＯＲＴＥＸ－５ＱＩＬＩＮＢＥＩＥＲ涡旋
震荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），酶标
板振荡器（ＯＲＢＩＴ　Ｐ４，美国Ｌａｂｎｅｔ公司），Ａｃｕｍｅ－
ｎｅＸ３型高速细胞分析仪（英国ＴＴＰＬａｂｔｅｃｈ公司），
ＥｎＳｐｉｒｅ多功能酶标仪（美国 ＰｅｒｋｉｎＥｌｎｅｒ公司），
Ａβ１－４２（中国吉尔生化有限公司，批号：０５２４８７），硫黄
素Ｔ（Ｓｉｇｍａ公司，批号：Ａ０２６４１５３，），ＡＳ（新疆维吾
尔医 药 研 究 所 自 制，批 号：２０１４１２０９），ＤＭＳＯ
（Ｓｉｇｍａ公司，批号：１２７７９００２５－ＡＣＲＯＳ）。
１．２　Ａβ１－４２储备液及待测样品溶液的配置　ＰＢＳ
（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝７．４）用ＮａＯＨ（固体）和 ＨＣＬ调
节溶液ｐＨ＝６．６，Ａβ１－４２按每０．１ｍｇ加入２０μＬ
ＤＭＳＯ溶液完全溶解后，加入ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ
＝６．６）稀释至所需浓度；７　６８０μｍｏｌ／Ｌ　ＡＳ母液、
１　０００μｍｏｌ／Ｌ　Ｔｈ－Ｔ 母液使用 ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，
ｐＨ＝６．６）配制，避光保存，上述溶液用ＰＢＳ稀释并
于４℃储存。
１．３　Ｔｈ－Ｔ结合实验测定ＡＳ对单体Ａβ１－４２聚集的荧
光强度影响　ＡＳ分为３个剂量组（１６０、６４０、２　５６０
μｍｏｌ／Ｌ），每组３个复孔，在９６孔板中加入１００
μｍｏｌ／Ｌ的Ａβ１－４２溶液２０μＬ后，立即在每孔中加入
２０μＬ不同浓度ＡＳ，与２０μｍｏｌ／Ｌ的Ｔｈ－Ｔ溶液２０
μＬ，在酶标板振荡器上２００ｒ／ｍｉｎ混匀１０ｍｉｎ，
３７℃二氧化碳培养箱中孵育２４ｈ，测定荧光值，考
察ＡＳ对实验体系荧光强度的影响。
１．４　Ｔｈ－Ｔ结合实验测定ＡＳ对聚集态Ａβ１－４２荧光强
度影响　按“１．３”项下方法将４０μＬ　Ａβ１－４２加入９６孔
板中，３７℃二氧化碳培养箱中孵育２４ｈ后，在对应孔
中加入不同浓度ＡＳ溶液各４０μＬ，与２０μｍｏｌ／Ｌ的
Ｔｈ－Ｔ溶液４０μＬ，在酶标板振荡器上２００ｒ／ｍｉｎ混匀
１０ｍｉｎ，３７℃二氧化碳培养箱中孵育且于２４ｈ，测定
荧光值。
１．５　ＡＳ的吸收波谱扫描 　Ｔｈ－Ｔ结合实验以固定
激发波长４５０ｎｍ，测定４８５ｎｍ处的荧光强度。使
用多功能酶标仪对终浓度为１　５００μｍｏｌ／Ｌ的 ＡＳ
及ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ均进行了３００～６００ｎｍ全波长扫描
（步长为５ｎｍ），并且在４５０ｎｍ处给予激光激发，检
测待测化合物自身或被激发后在４８５ｎｍ附近是否
有使荧光非特异性降低的强吸收，排除多种因素的
假阳性结果。
１．６　ＡＳ与Ｔｈ－Ｔ竞争结合实验　实验选择不同浓度
（１６０、３２０、６４０μｍｏｌ／Ｌ）的ＡＳ与Ａβ１－４２共孵育，通过
改变Ｔｈ－Ｔ的浓度（依次为１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、
１６０、３２０μｍｏｌ／Ｌ）使荧光强度恢复到最大值，消除二
者之间存在的竞争结合，从而排除实验假因素。
１．７　Ｔｈ－Ｔ结合实验考察ＡＳ影响Ａβ聚集的量效关
系　将 ＡＳ从最高浓度倍比稀释共１１个终浓度
（２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１　２８０、２　５６０
μｍｏｌ／Ｌ）考察 ＡＳ影响 Ａβ１－４２聚集的量效关系，计
算ＩＣ５０。
１．８　统计学处理　采用ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｍｅ５．０统计软件
进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差 （－ｘ±ｓ）
表示，两组间比较采用ｔ检验，多组之间比较采用
Ｏｎｅ　ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ａｎｄ　Ｄｕｎｎｅｔｔ检验分析，检验水
准α＝０．０５。
２　结果
２．１　ＡＳ对单体Ａβ聚集的影响　Ａβ１－４２单体在３７℃
１２２　第２期 罗嘉楠，等：类叶升麻苷对β－淀粉样蛋白聚集影响的体外研究
孵育２４ｈ后，由于疏水作用，自身发生聚集形成β
折叠结构，荧光强度明显增强 （Ｐ ＜０．００１）；与 Ａβ
组相比较，３种浓度（１６０、６４０、２　５６０μｍｏｌ／Ｌ）的ＡＳ
组荧光强度均明显减弱 （Ｐ ＜０．００１），显著抑制
Ａβ１－４２单体的自身聚集，其中２　５６０μｍｏｌ／Ｌ　ＡＳ组对
Ａβ单体聚集的抑制率达到９６．２６％，定量分析结果
显示正常对照组的荧光强度为（０．２５±０．０４）×１０８，
３种浓度的 ＡＳ能使 Ａβ组的荧光强度从（３．４８±
０．０９）×１０８ 分别降至（２．４５±０．１６）×１０８、（０．８９±
０．０３）×１０８ 和（０．１３±０．０４）×１０８，见图１。
图１　ＡＳ抑制Ａβ聚集图
２．２　ＡＳ对聚集态Ａβ解聚的作用　与聚集态Ａβ组
相比较，加入６４０μｍｏｌ／Ｌ和２　５６０μｍｏｌ／Ｌ浓度的
ＡＳ均能明显降低荧光强度 （Ｐ≤０．００１），定量分析结
果显示，正常对照组的荧光强度为（０．１３±０．０４）×
１０８，３种浓度的ＡＳ能使Ａβ组的荧光强度从（３．２７±
０．５１）×１０８ 分别降至（２．９３±０．１９）×１０８、（１．７７±
０．０３）×１０８ 和（０．２８±０．１１）×１０８，且呈量效关系。
２．３　ＡＳ的吸收波谱扫描　ＡＳ的吸收光谱扫描结
果显示，ＡＳ和 ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ在４００～６００ｎｍ波长范
围均没有特异性吸收峰（图２）；同时，在４５０ｎｍ处
给予激发光后，在４７０～６００ｎｍ波长范围测化合物
也没有出现明显的吸收峰（图３），说明待测药物自
身或和荧光染料结合后，不论是自身还是给与刺激
均不会在该波长范围产生强的自身荧光，不会有强
的吸收干扰实验结果。
２．４　ＡＳ与Ｔｈ－Ｔ竞争结合实验假因素的排除　Ｔｈ－
Ｔ最低浓度下，４组荧光值基本始发于同一个点，在
不同浓度的 ＡＳ作用下，随 Ｔｈ－Ｔ浓度增加时，Ａβ
荧光值也增加，当Ｔｈ－Ｔ浓度为１６０μｍｏｌ／Ｌ时达到
平台期。ＡＳ　３个剂量的给药组表现出明显的量效
关系，高浓度的荧光强度值最低，且最低浓度的 ＡＳ
组荧光强度也低于未加药的 Ａβ组，排除了假阳性
结果，见图４。
２．５　ＡＳ对单体和聚集态Ａβ聚集的影响　ＡＳ抑制
单体Ａβ聚集的作用，随着浓度增加而增加，ＩＣ５０为
２５４．３μｍｏｌ／Ｌ（图５Ａ）；ＡＳ对聚集态Ａβ解聚的作
用，亦随着浓度增加而增加，ＩＣ５０为２８２．０μｍｏｌ／Ｌ
（图５Ｂ）。
图２　ＡＳ３００～６００ｎｍ的吸收光谱图 　　 图３　ＡＳ４７０～６００ｎｍ的吸收光谱 　　图４　硫磺素Ｔ与ＡＳ竞争性结合实验
图５　ＡＳ影响单体（Ａ）和聚集态（Ｂ）Ａβ聚集的量效关系
３　讨论
类叶升麻苷（ＡＳ），其主要药理作用为增强记忆
及神经保护作用、抗氧化抗衰老作用、调节免疫作用
等［８］，其中抗氧化作用十分明显，林娟等［６］、高莉
等［７］实验有关类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠学习记
忆障碍的研究和类叶升麻苷对Ｄ－半乳糖致衰老小
鼠抗氧化作用的研究都发现，类叶升麻苷能改善
ＡＤ模型小鼠记忆障碍和降低 ＭＤＡ的增多，升高
Ｔ－ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ这两种酶的活性都与其抗氧化
２２２ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第４０卷　
能力密切相关。ＡＳ在抗氧化治疗ＡＤ的同时，能不
能通过抑制 Ａβ聚集有效地改变 ＡＤ的病理特征，
发现另一个ＡＳ治疗ＡＤ的靶点。
由于ＡＤ发病机理十分复杂，脑内发生的病理
改变难以逆转，虽说关于ＡＤ发病机制有众多假说，
但对于ＡＤ的药物研发已经临床试验都基于β－淀粉
样蛋白级联假说。Ａβ的聚集被认为是导致阿尔茨
海默发病的始发因素。Ａβ作为老年斑（ＳＰ）的主要
组成成分，具有神经毒性，是由其前体淀粉样前体蛋
白（Ａｍｙｌｏｉｄ　ＰｒｅｃｕｒｓｏｒＰｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）经β和γ分泌酶
共同剪切形成的［９］。Ａβ具有很强的自聚性，一旦聚
集，即会较早在老年斑中发生有选择的、难以溶解的
沉淀。正常情况下，Ａβ的产生和降解是平衡的，若降
解酶功能发生异常，平衡被打破，日积月累导致沉积
和老年斑的形成，引起神经元损伤和认知功能的衰
退［１０－１１］。聚集的Ａβ可与荧光衍生剂Ｔｈ－Ｔ特异性
结合，在特定波长的激发光激发（４４０～４６０ｎｍ）下，可
以产生特定波长的发射荧光（４８２～４９０ｎｍ）［１２－１４］，从
而检测聚集态Ａβ。本实验采用Ｔｈ－Ｔ结合实验来考
查ＡＳ对Ａβ１－４２聚集的影响，选择了最优激发波长，即
在实验条件为４５０ｎｍ的波长下激发，通过在４８５ｎｍ
处的荧光强度来间接反映Ａβ１－４２的聚集量
［１５］。实验
结果证明，加入ＡＳ共同孵育后，能够降低单体态Ａβ
的荧光强度，也能降低聚集态Ａβ的荧光强度，说明
ＡＳ能够抑制单体Ａβ１－４２的聚集，同时也能对聚集态的
Ａβ１－４２有明显解聚作用。为了验证实验中是ＡＳ在Ａβ
肽链上的位点结合抑制了Ａβ１－４２的聚集，降低了荧光
强度，做了假阳性因素的排除：对ＡＳ、ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ进
行了３００～６００ｎｍ全波长扫描，并且在４５０ｎｍ下激
发，４７０～６００ｎｍ处检测。结果表明，ＡＳ、ＡＳ＋Ｔｈ－Ｔ
自身或被激发后没有出现强吸收，说明ＡＳ本身的光
谱特性不会导致Ｔｈ－Ｔ实验中的荧光降低；此外，ＡＳ
和Ｔｈ－Ｔ在单体或聚集态Ａβ１－４２共同孵育是否具有相
同的结合位点，如果是两者存在竞争性结合的关系，
固定ＡＳ的浓度随着Ｔｈ－Ｔ浓度增加，一定会抢夺ＡＳ
与Ａβ的结合位点，使不同ＡＳ组的荧光强度都能恢
复到未加入ＡＳ的Ａβ１－４２组，结果证明两者不存在竞
争性结合位点，排除了可能的实验干扰，推翻了可能
存在的的假阳性结果，说明ＡＳ对Ａβ１－４２的聚集有降
解作用。
实验溶剂均在超净工作台配制，９６孔板每孔各
溶液加入２０μＬ（总体积为６０μＬ），体积较小，检测
结果发现３个复孔荧光强度ＳＤ值均较大，为了减
少标准差大对实验的影响，加样时保证动作重复的
均一性；在ＣＯ２ 培养箱中孵育２４ｈ之前，将９６孔
板用保鲜膜封住，以防每孔溶液太少会挥发；在 ＡＳ
对聚集态Ａβ１－４２解聚的作用的实验中，Ａβ１－４２需要先
孵育２４ｈ，为了确保第２天加样时孔底 Ａβ１－４２不会
蒸发干，将体积增加到４０μＬ。ＡＳ在盐酸盐溶液中
不稳定，需要现配现用，为了保证实验重复下的ＩＣ５０
相差不大，从高浓度７　６８０μｍｏｌ／Ｌ稀释至所需的
终浓度，并且用倍比法稀释，确保浓度的准确性，呈
现出较好的量效关系。已有研究表明 ＡＳ对 Ｈ２Ｏ２
诱导的 ＰＣ１２细胞损伤具有显著性保护作用［１６］。
Ａβ单体没有明显的细胞毒性，但其自身聚集的过程
会产生 Ｈ２Ｏ２，能够对细胞产生氧化损伤［１７］。ＡＳ
一方面可以直接抑制 Ａβ１－４２的聚集，另一方面其抗
氧化作用可以有效地减轻Ａβ１－４２在聚集过程中产生
的 Ｈ２Ｏ２ 引起的细胞氧化损伤，为进一步研究 ＡＳ
抗ＡＤ提供了理论依据。
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［收稿日期：２０１６－０６－１６］
（本文编辑　王艳）
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增殖正常软骨细胞和骨关节炎软骨的细胞活性，对
退行性软骨细胞有促进生长的作用。从大鼠细胞增
殖实验结果说明，莲威阿纳其颗粒对正常软骨细胞
也有增殖的效果，不仅可以作为治疗骨性关节炎的
药物，而且在预防过程中也能发挥重要作用［１３，１８］。
通过急性毒性试验证明莲威阿纳其颗粒临床用药
安全。
参考文献：
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［收稿日期：２０１６－０９－０９］
（本文编辑　施洋）
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（上接２２３页）
［１４］　ＶＯＧＥＬＧＥＳＡＮＧ　Ｓ，ＣＡＳＣＯＲＢＩ　Ｉ，ＳＣＨＲＯＥＤＥＲ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．
Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ　ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ　ｉｓｉｎｖｅｒｓｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ
ｗｉｔｈ　Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｅｌｄｅｒｌｙ　ｎｏｎ－
ｄｅｍｅｎｔｅｄ　ｈｕｍａｎｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，１２（７）：
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［收稿日期：２０１６－０８－０７］
（本文编辑　施洋）
８２２ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第４０卷