全 文 ：食用菌学报 2008.15(2):42～ 46
收稿日期:2007-08-28原稿;2008-02-16 修改稿
基金项目:云南省科研院所技术开发专项“云南野生食用菌新型产品加工技术工程化应用推广”(编号:2005KFZX
-05)的部分研究内容
作者简介:桂明英(1965-), 女 , 2007年毕业于云南大学生命工程学院 , 博士 , 研究员 , 主要从事食用菌遗传育种方
面的研究 ,发表主笔论文 20 余篇。
文章编号:1005-9873(2008)02-0042-05
美味牛肝菌致突变作用研究
桂明英1 , 郭永红1 , 朱　萍1 , 刘　蓓1 , 赵　博2 , 丁晓雯2
(1 昆明食用菌研究所 ,云南昆明 650223;2 西南大学食品学院 ,四川重庆 400716)
摘　要:通过蚕豆根尖细胞微核实验和 Ames实验 , 研究了美味牛肝菌水提液的致突变作用 ,为其安全性评价
提供基础。实验结果表明 ,当美味牛肝菌水提液的使用剂量从 2.48 mg/mL 增加到 25.46 mg/ mL时 , 蚕豆根尖
细胞的微核率(‰)由 27.21±9.53 增加到 33.33±1.53 ,表明美味牛肝菌水提液对蚕豆根尖细胞产生一定的微核
诱导作用;在相同剂量下, 它们对 10μg/mL 环磷酰胺诱导产生的蚕豆根尖细胞微核抑制作用由完全抑制下降到
很低的抑制水平。 Ames 实验证明 , 当美味牛肝菌水提液的使用剂量由每皿 3.5 mg 增加到 70 mg 时 , TA97 ,
TA98 和 TA102 的回复突变率有一定幅度增加, 但均未达到阴性对照的 2 倍。
关键词:美味牛肝菌;微核率;蚕豆根尖微核实验;Ames 实验
中图分类号:S646.3　　　　文献标识码:A
　　美味牛肝菌(Boletus edulis Bul1.ex Fr.)属于
担 子 菌 亚 门 (Basidiomycotina), 层 菌 纲
(Hymenomycetes),伞菌目(Agaricales),牛肝菌科
(Boletaceae),牛肝菌属(Boletus Fr.)[ 1] ,在我国各
省均有分布 ,以西南地区数量较多[ 2] 。
美味牛肝菌是一种野生菌根菌 ,其肉质肥厚
细嫩 ,味道鲜美 ,长期被人们采摘食用。但对这些
野生食用菌的安全性 ,特别是长期食用后对人体健
康的影响还未见报道 。
环磷酰胺具有染色体断裂作用 ,可以使遗传
物质损伤产生微核等异常现象[ 3 ,4] ,而使用环磷酰
胺为阳性对照进行的蚕豆根尖细胞染色体畸变技
术作为一种检测化学品遗传毒性的方法被广泛采
用。80年代初 ,世界卫生组织 、联合国环境署和美
国国家环保局相继确定了其在环境化学物致突变
检测中的作用 ,并建议在全世界范围内推广应
用[ 5 , 6] ;1986年 ,我国环保局将蚕豆根尖细胞微核
实验列入了水环境生物测试的技术规范[ 7] 。目前 ,
该实验技术也用于食品遗传作用的评价[ 8 , 9] 。
Ames实验也已广泛用于化学物致突变研究的粗
筛和鉴定 。
本文通过蚕豆根尖微核实验和 Ames实验 ,对
美味牛肝菌进行了研究 ,旨在为牛肝菌的食用安全
性研究提供基础和参考。
1　材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验样本
美味牛肝菌子实体由昆明食用菌研究所采集
(采自云南楚雄州禄劝县)并鉴定 , -18℃冷冻保存
备用。
称取一定量的冷冻保藏的美味牛肝菌样品 ,
在 4 ℃水浴中用5倍体积的蒸馏水提取 3次 ,每次
30 min ,过滤得滤液 ,经冷冻干燥制成干粉 ,真空包
装 ,冰箱(4 ℃)保存备用。
1.1.2 蚕豆种子
蚕豆种子购于重庆市天生桥农贸市场。
1.1.3 主要试剂
碱性品红(AR)购自中国医药(集团)上海化学
试剂公司 ,环磷酰胺(BR)购自上海第十二制药厂 ,
卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)自制 ,D
-生物素(AR)和 L-组氨酸(AR)购自上海化学
试剂三厂 。
1.1.4 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变菌株
鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变菌株
TA 97、TA 98 、TA 100和 TA 102由重庆市疾病控制
第 2期 桂明英 ,等:美味牛肝菌致突变作用研究
中心提供 。
1.2 方法
1.2.1 蚕豆根尖微核实验
蚕豆根尖微核实验方法参照文献[ 10] ,并作适
当改进。
选择饱满 、大小均匀的蚕豆种子 ,于自来水中
浸泡 24 h让其自然吸胀 ,然后于 25 ℃恒温培养 ,
每 12 h换水 1次。待根尖生长至 2 ～ 3 cm 时 ,分
别用蒸馏水(阴性对照)、10.0 μg/mL 的环磷酰胺
(阳性对照)、不同浓度的美味牛肝菌水提物的水溶
液和加 10.0μg /mL 环磷酰胺溶液的不同浓度美
味牛肝菌水提物溶液浸没蚕豆根尖处理 6 h ,用卡
诺氏固定液固定 24 h ,然后置 70%乙醇中 ,于 4 ℃
冰箱保存 。
取根尖常规制片 ,用碱性品红染色 ,镜检。每
个浓度处理的根尖片要镜检 3张以上 ,每个根尖至
少观察 1000个细胞 ,统计细胞微核数 ,按下式计算
微核率(micronuclear rate ,MCN):
MCN‰=样品中产生微核的细胞数/样品中
观测的细胞总数×1000
将所得到的微核率与阴 、阳性对照比较 ,根据
差异是否显著判断样本是否引起蚕豆根尖微核率
的明显变化。
1.2.2 Ames实验方法
Ames实验方法参照文献[ 11] ,并进行适当
改进。
采用鼠伤寒沙门氏菌突变菌株 TA 97 、TA 98 、
TA 100和 TA 102 ,以标准平板掺入法进行试验。
阳性对照:TA 97 、TA 100和 TA 102 菌株为浓
度 1.5μg/100μL 的叠氮化钠 , TA 98菌株为浓度
10μg/100μL 的 2-氨基芴;阴性对照:蒸馏水 ,加
入量为每皿100 μL。各处理每平皿加入不同浓度
的牛肝菌水提物溶液200μL。
将-18 ℃冷冻保存的鼠伤寒沙门氏突变菌株
接种于营养肉汤培养基 ,37 ℃、每分钟 100次振荡
培养约 12 h ,得到菌悬液。将牛肝菌水提物溶液分
成几个剂量组 ,各试验组分别设添加 S9活化和不
加 S9活化的试验[ S9 活化处理为添加采用多氯联
苯(polychlorobiphenyl ,PCB)诱导的大鼠肝微粒体
酶混合物 ,每皿添加 0.5 mL] 。每组 3个重复 ,置
37 ℃培养48 h ,计数培养基上长出的回复突变菌
落数 ,以受试组回变菌落数等于或大于阴性对照组
的回变菌落数 2倍作为阳性判断标准。
实验数据统计处理在 Excel 2003上进行。
2　结果与分析
2.1 美味牛肝菌对蚕豆根尖细胞微核率的影响
　　采用不同浓度的美味牛肝菌水提物溶液 、美味
牛肝菌水提物溶液+10.0 μg/mL 环磷酰胺处理蚕
豆根尖细胞 ,不同处理对蚕豆根尖微核率的影响见
表 1。
通过实验得出 ,蒸馏水(阴性)、10.0μg/mL 环
磷酰胺(阳性)样本的蚕豆根尖微核率(‰)分别是
21.10±2.02和 53.61±8.80 ,10.0 μg/mL 环磷酰
胺的蚕豆根尖微核率明显高于阴性对照 ,统计分析
证明差异极显著。
表 1　美味牛肝菌水提物溶液对蚕豆根尖微核率的影响
Table 1　Effect of aqueous Boletus edulis extract on the rate of micronuclei formation in horse bean root tip cells
样品 Sample 剂量
Dosage(mg/ mL)
微核率(‰)±标准差(‰)
Rate of micronuclei formation(‰)±standard error(‰)
阴性对照:蒸馏水
Distilled water(negative control) 21.10 ±2.02
阳性对照:环磷酰胺
Cyclopho sphamide(positive control) 1.0 × 10-2 53.61 ±8.80
样品水溶液
Aqueous B.edulis extract
2.48
5.06
10.02
25.46
27.21 ±9.53
26.84 ±3.02
31.52 ±0.71
33.33 ±1.53
样品水溶液+10 μg/ mL环磷酰胺 2.48
5.06
20.20 ±2.05
30.61 ±3.85
Aqueous B.edulis extract +10 μg/ mL
cyclopho sphamide
10.02
25.46
28.60 ±4.16
46.20 ±3.27
43
食　用　菌　学　报 第 15卷
　　由结果可知 ,当美味牛肝菌水提物溶液的使用
剂量为 2.48 mg/mL 时 ,蚕豆根尖细胞的微核率
(‰)为 27.21 ±9.53 ,较阴性对照高出 29%以上;
当美味牛肝菌的使用剂量增加到 25.46 mg/mL
时 ,蚕豆根尖细胞的微核率(‰)为 33.33 ±1.53 ,
较阴性对照提高 58%以上 ,微核率明显升高说明
美味牛肝菌水提物对蚕豆根尖细胞微核的产生有
一定的诱导作用。
将美味牛肝菌水提物溶液与 10 μg/mL 环磷
酰胺同时作用于蚕豆根尖 ,实验中最小剂量的美味
牛肝菌水提液对环磷酰胺的微核诱导作用产生完
全的抑制 ,蚕豆根尖细胞的微核率(‰)由53.61 ±
8.80下降为 20.20 ±2.05 ,相当于蒸馏水的阴性
对照水平 ,差异极显著;随着美味牛肝菌水提液浓
度提高 ,这种抑制作用逐渐减弱 ,当美味牛肝菌的
使用剂量为 25.46 mg/mL时 ,蚕豆根尖细胞的微
核率(‰)比单独使用 10 μg/mL 环磷酰胺的阳性
对照略有下降(46.20 ±3.27),二者比较没有明显
差异。
2.2 美味牛肝菌水提液的Ames实验
　　本研究选用 4 株两种突变类型的菌株 ,在
有或无代谢活化系统的条件下 ,考察美味牛肝
菌水提液的 4 个剂量对 4 种突变菌株的诱导
突变作用 。
2.2.1 美味牛肝菌水提物对 TA97 、TA98菌株回
复突变的影响
TA97 、TA98菌株回复突变可检测各种移码
型诱变剂 ,实验结果见表 2和表 3。
表 2　美味牛肝菌水提物对 TA97菌株回复突变的影响
Table 2　Effect of aqueous Boletus edulis extract on reverse mutation of S.t yphimurium TA97
分组
Sample
剂量(/皿)
Dosage(/ dish)
不加 S9
Without S9
加 S9
With S9
阴性对照:蒸馏水
Distilled w ater(negativ e control)
100 μL 171.7 ± 4.0 160.7 ±5.9
阳性对照:叠氮化钠
Sodium azide(po sitive control 1.5μg/ 100 μL)
100 μL 226.7± 5.9 202.7 ±8.0
美味牛肝菌水提物溶液
B.edulis extr act
3.5 mg
14.0 mg
35.0 mg
70.0 mg
164.1 ± 7.2
188.0 ± 9.2
205.3 ± 9.6
218.0 ±14.3
163.7 ± 4.7
178.1 ± 3.6
170.3 ± 5.0
221.3 ±15.6
表 3　美味牛肝菌水提物溶液对 TA98菌株回复突变的影响
Table 3　Effect of aqueous Boletus edulis extract on reverse mutation of S.t yphimurium TA98
分组
Sample
剂量(/皿)
Dosage(/ dish)
不加 S9
Without S9
加 S9
With S9
阴性对照(蒸馏水)
Distilled w ater(negativ e control)
100 μL
33.30 ±2.52 37.20 ±2.10
阳性对照:2-氨基芴
2-Amino flurene(positive contro l10 μg/100μL)
100 μL
629.30 ±25.40 829.10 ±22.80
美味牛肝菌水提物溶液
B.edulis extr act
3.5 mg
14.0 mg
35.0 mg
70.0 mg
38.67 ±3.22
33.67 ±1.53
56.30 ±3.06
60.30 ±4.73
32.33 ±3.52
36.30 ±7.53
59.30 ±3.22
69.00 ±8.19
　　由实验结果可知 ,在添加和不添加 S9 的实验
组中 ,实验中最小剂量的美味牛肝菌提取物使得
TA 97 、TA 98菌株的回复突变菌落数低于或接近阴
性对照 ,随着美味牛肝菌提取物使用剂量的增
大 ,回复突变菌落数呈现一定程度的增加 ,但均
未达到等于或大于 2 倍阴性对照组的回变菌落
数水平 ,即实验范围内美味牛肝菌提取物理论上
不会引起 TA 97 、TA 98的移码型突变。
2.2.2 美味牛肝菌水提物对 TA 100 、TA 102菌株回
复突变的影响
TA 100菌株回复突变可检测碱基置换型突
变 , TA 102菌株回复突变可检测移码型突变和碱
基置换型突变以外的突变类型 ,实验结果见表 4
和表 5 。
由表4可知 ,在添加和不添加S9的实验组中 ,
随着美味牛肝菌提取物使用剂量的增大 , TA 100
44
第 2期 桂明英 ,等:美味牛肝菌致突变作用研究
表 4　美味牛肝菌水提物溶液对 TA100菌株回复突变的影响
Table 4　Ef fect of aqueous Boletus edulis extract on reverse mutation of S.ty phimurium TA100
分组
Sample
剂量(/皿)
Dosage(/ dish)
不加 S9
Without S9
加 S9
With S9
阴性对照(蒸馏水)
Distilled w ater(negativ e control)
100 μL
113.3 ±3.6 102.0±3.6
阳性对照:叠氮化钠
Sodium azide(po sitive control 1.5μg/ 100 μL)
100 μL
592.7 ±35.2 545.3 ±45.5
美味牛肝菌水提物溶液
B.edulis extr act
3.5 mg
14.0 mg
35.0 mg
70.0 mg
114.3 ±3.8
126.7 ±4.9
117.2 ±3.6
102.5 ±3.1
158.7 ±5.1
149.3 ±4.2
133.4 ±6.2
121.3 ±8.3
表 5　美味牛肝菌水提物溶液对 TA102菌株回复突变的影响
Table 5　Ef fect of aqueous Boletus edulis extract on reverse mutation of S.ty phimurium TA102
分组
Sample
剂量(/皿)
Dosage(/ dish)
不加 S9
Without S9
加 S9
With S9
阴性对照(蒸馏水)
Distilled w ater(negativ e control)
100 μL
193.1 ±2.6 231.4 ±7.9
阳性对照:叠氮化钠
Sodium azide(po sitive control 1.5μg/ 100 μL)
100 μL
314.2 ±10.5 287.1 ±10.2
美味牛肝菌水提物溶液
B.edulis extr act
3.5 mg
14.0 mg
35.0 mg
70.0 mg
188.5 ±5.6
210.3 ±5.1
237.7 ±12.4
265.0 ±11.1
189.7 ±11.1
272.7 ±12.2
301.0 ±10.5
317.3 ±15.2
菌株的回复突变菌落数与阴性对照相比无明显
增加 ,说明美味牛肝菌不会引起 TA 100菌株的碱
基置换型突变 。
由表 5可知 ,在添加和不添加 S9 的实验组
中 ,实验中最小剂量的美味牛肝菌水提物使得
TA 102菌株的回复突变菌落数低于阴性对照 ,随
着美味牛肝菌水提物使用剂量的增大 , TA 102菌
株的回复突变菌落数呈现一定程度的增加 ,但均
未达到等于或大于 2 倍阴性对照组的回变菌落
数水平 ,即实验范围内美味牛肝菌水提物理论上
不会引起 TA 102的其它类型突变 。
但代谢活化系统及更大剂量对突变的诱导
作用尚需进一步的研究 。
3　讨论
　　蚕豆根尖微核实验结果显示 ,美味牛肝菌的
水提物对蚕豆根尖的微核具有双向调节作用 ,随
着添加美味牛肝菌水提物浓度的增加 ,微核率逐
渐上升;但在添加浓度为 2.48 mg/mL 水平时 ,
美味牛肝菌水提物则完全抑制了由环磷酰胺诱
导的细胞微核的产生 ,然而 ,随着美味牛肝菌水
提物添加浓度的上升 ,这种抑制作用逐渐减弱。
Ames实验证明 ,美味牛肝菌的水提物可导
致 TA 97 、TA 98和 TA10 2回复突变菌落数一定幅度
的上升 ,虽然上升幅度尚未达到阴性对照的 2 倍
数值 ,但其中机理 ,包括其对蚕豆根尖微核的双
向调节作用和原理仍需要深入研究 ,蚕豆根尖的
微核实验和 Ames实验作为食用菌安全性研究的
标准方法也需要更多的实验和研究来完善 。按
现有的实验结果 ,对美味牛肝菌的遗传性毒性还
需要动物实验和流行病学进一步的研究。
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[本文编辑] 　曹　晖
Mutagenic Potential of Boletus edulis
GUI Mingying
1 , GUO Yonghong1 , ZHU Ping1 , LIU Bei1 , ZHAO Bo2 , DING Xiaowen2
(1Kunming Edible Fungi Research Institute , Kunming , Yunnan 650223 , China;
2Food College of Southwest University , Chongqing , Sichuan 400716 , China)
Abstract:The mutagenic potential of aqueous extr acts of Boletus edulis fr uit bodies was determined by
measur ing the r ate of micronucleus formation in hor se bean root tip(HBRT)cells and by the Ames test.The
rate of m icronucleus forma tion incr eased from control values of 21.10‰ ±2.02‰ to between 27.21‰
±9.53‰ and 33.33‰ ±1.53‰ when HBRT cells were exposed to B .edulis extr acts ove r the r ange 2.48 ～
25.46 mg/mL.Lower concentr ations (2.48 ～ 10.02 mg/mL)str ongly inhibited the r ate of m icronucleus
formation induced by 10μg/mL cyclophosphamide whereas higher concentrations(25.46 mg/mL)had
no significant inhibitory effect.The Ames test revealed that B.edulis ext racts did not induce
mutations involving frame shift s or base pair substi tution , and the fungus is therefo re relatively safe
to consume.
Key words:Boletus edulis ;micronucleus formation;horse bean root tip cell;Ames test
46