全 文 ：第 35 卷第 6 期
2014 年 6 月
环 境 科 学
ENVIＲONMENTAL SCIENCE
Vol． 35，No． 6
Jun．，2014
基于沼液的培养基及产油小球藻藻种选育
赵凤敏，梅帅，曹有福，丁进锋，徐嘉杰，李树君*
(中国农业机械化科学研究院，北京 100083)
摘要:将产油小球藻培养与沼液污水处理结合，为小球藻生长提供营养和水源，同时实现了沼液污水的无害化处理． 本研究
利用 4 种产油小球藻，在沼液污水与绿藻培养基体积比为 1∶ 9、1∶ 3、1∶ 1、3∶ 1形成的培养基中培养，以产油率为指标，选育出
获得最高产油率时的沼液污水-绿藻培养基配比和小球藻藻种． 结果表明，产油率最高的培养基体积比为 1∶ 3，小球藻藻种为
BJ05，该工况下产油率达到 9. 20 mg·(L·d)－ 1，高于纯绿藻培养基中的 8. 66 mg·(L·d)－ 1 ． 在 1 /4 污水比例培养基基础上，考
查添加绿藻培养基中不同营养组分对 BJ05 产油率的影响，结果发现，在同时不添加碳酸钠和柠檬酸的情况下，BJ05 的产油率
为 9. 36 mg·(L·d)－ 1，COD、TN(总氮)、TP(总磷)、NH +4 -N去除率分别达到 59%、75%、61%、100% ． 而其他营养成分缺失
则显著降低了 BJ05 的生物量，进而降低了产油率，所以进一步优化培养基为绿藻培养基中不添加碳酸钠和柠檬酸的体积比为
1∶ 3的沼液污水-绿藻培养基．
关键词:沼液;产油小球藻;培养基;产油率;选育;去除率
中图分类号:X382;X703 文献标识码:A 文章编号:0250-3301(2014)06-2300-05 DOI:10． 13227 / j． hjkx． 2014． 06． 036
收稿日期:2013-10-11;修订日期:2013-11-28
基金项目:国际科技合作项目(2010DFB63750)
作者简介:赵凤敏(1973 ～)，女，研究员，主要研究方向为农产品加
工及工程，E-mail:meishuaiyu@ sina． com
* 通讯联系人，E-mail:meishuaiyu@ sina． com
Culture Medium Based on Biogas Slurry and Breeding of Oil Chlorella
ZHAO Feng-min，MEI Shuai，CAO You-fu，DING Jin-feng，XU Jia-jie，LI Shu-jun
(Chinese Academy of Agricultural Mechanization Sciences，Beijing 100083，China)
Abstract:The oil chlorella cultivation and biogas slurry treatment were combined． The biogas slurry provided water and nutrient for
growing chlorella，at the same time，harmless treatment of biogas slurry was realized． This paper cultivated 4 species of oil chlorella in
the mixed medium of biogas slurry and green algae medium (the volume ratios were 1 ∶ 9，1 ∶ 3，1 ∶ 1 and 3 ∶ 1，respectively)，and
compared their oil productivity to select the best oil chlorella species and the optimal culture medium． The results showed that，the
combination of medium and chlorella species to reach the highest oil productivity was a volume ratio of 1∶ 3 and the chlorella species
BJ05，and the oil productivity of chlorella BJ05 was 9. 20 mg·(L·d)－ 1， higher than that in green algae medium ［8. 66
mg·(L·d)－ 1］． In mixed medium with a volume ratio of 1∶ 3，the effect of adding different nutrients into the green algae medium on
the oil productivity was examined，and the results showed that，sodium carbonate and citric acid had no negative effect on the oil
productivity of chlorella BJ05. in the absence of sodium carbonate and citric acid，the oil productivity of chlorella BJ05 was 9. 36
mg·(L·d)－ 1，and the removal of COD(chemical oxygen demand)，total nitrogen，total phosphorus and ammonia nitrogen rates were
59%，75%，61% and 100%，respectively． Deficiency in other nutrients had negative effect on the oil productivity． Therefore，the
culture medium was further optimized to the mixed medium of biogas slurry and green algae medium with a volume ratio of 1 ∶ 3 and
without addition of sodium carbonate and citric acid．
Key words:biogas slurry;oil chlorella;culture medium;oil productivity;breed;removal rate
微藻是高效的光合作用水生生物，其细胞主要化
学成分是脂类、蛋白质、纤维素和木质素等［1］． 微藻
中的脂肪酸多为 C14 ～ C18，这些脂肪酸是生物柴油
的主要成分［2，3］． 微藻环境适应能力很强，可在淡水、
海水和多种污水中生长，仅占用少量的土地资源，生
产生物柴油的潜力巨大［4，5］． 能源微藻中的产油小球
藻可以进行工业化生产，是理想的能源微藻资源［6，7］．
因此，本研究利用适合大规模培养、油脂含量较高、
研究较为成熟的产油小球藻作为试验原料．
微藻的生长需要大量的水、养料(碳源、氮源
和磷源等)以及光照，这些培养成本导致微藻生物
柴油价格是石油价格的 2 倍多［8］． 微藻生物柴油要
真正成为一种替代能源，降低其培养成本至关重要．
微藻生长所需的光照可利用自然光，碳源可利用空
气、烟道气中的 CO2 等，所以大量的水和其他养料
来源成了关键． 牛粪发酵后的沼液污水中含有大量
的氮磷以及有机碳(可提供微藻生长所需的碳源)
等成分，非常适合微藻的生长，使微藻的大规模培养
减少了水的消耗，同时解决了部分养料来源问
题［9，10］，大大降低了生物柴油生产成本．
人们往往希望利用高污染的污水进行微藻培
养，虽然意义重大，但是由于其组成复杂及污染物浓
6 期 赵凤敏等:基于沼液的培养基及产油小球藻藻种选育
度过高，导致微藻的适应周期过长甚至抑制了微藻
生长，大大降低了产油率，故难以形成持续化的大规
模供应． 不同的藻种污水适应能力不同，故对于污
染物浓度过高的污水需要进行一定的处理，并且污
水中并不一定含有微藻所需生长的全部营养元素，
有些营养成分需要另外添加［11，12］． 因此本研究利用
4 种产油小球藻，在不同体积比的沼液污水与绿藻
培养基形成的混合培养基中，分析了沼液污水培养
微藻的可行性，选育最高产油率时产油小球藻和沼
液污水培养基组合，在最高产油率的小球藻和沼液
污水培养基的基础上，继续考察在沼液污水中添加
不同营养成分藻细胞的产油率以及氮磷的去除效
率，进一步优化沼液污水培养基，以期为利用沼液污
水大规模培养产油小球藻奠定基础．
1 材料与方法
1. 1 材料、试剂
试验所用的小球藻 BJ01(Chlorella sp．)、小球
藻 BJ05 (Chlorella pyrenoidosa)、小 球 藻 BJ07
(Chlorella vulgaris)由本实验室自行筛选获得，为了
便于区分，将美国明尼苏达大学阮榕生教授惠赠的
小球藻(Chlorella sp．)编号为 BJ09． 所用试剂均为
分析纯．
1. 2 主要仪器、设备
热电鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂
101-IEBS)、电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司
BS223S)、高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心仪器
有限公司 GL-21M)、水质分析仪(默克 Pharo 300)、
真空冷冻干燥机(中国农机院研制)、恒温水浴锅
(上海森信水浴锅有限公司 DK-S24)、超静音可调
式气泵(广东海利有限公司 ACO-9602)．
1. 3 试验方法
1. 3. 1 沼液预处理
沼液取自中国农业机械化科学研究院农业生态
科技园沼液发酵池，加入 4 倍清水搅拌经自然沉降
1 周后弃去沉淀，6 000 r·min －1离心 10 min 取上清
液，上述方式处理获得共 50 L 的沼液污水备用． 分
析上清液的水质指标化学需氧量 (COD)、总氮
(TN)、总磷 (TP)、铵态氮 (NH +4 -N)，该沼液污水
的 pH为 6. 4，结果见表 1．
1. 3. 2 小球藻的培养
绿藻培养基中各营养成分是标准 BG11 培养
基［13］中的 2 倍，其组成(mg·L －1)如下:NaNO3
3 000;MgSO4·7H2O 150;CaCl2·2H2O 72;柠檬酸，
12;Na2EDTA 2;柠檬酸铁铵 12;Na2CO3 40;
KH2PO4·H2O 80;微量元素 (A5):ZnSO4·7H2O
0. 444;CuSO4·7H2O 0. 158;MnCl4·4H2O 3. 62;
Na2MoO4·2H2O 78;Co(NO3)2·6H2O 0. 098;H3BO3
5. 72．
表 1 处理后得到的沼液污水水质指标
Table 1 Water quality index of biogas slurry after treatment
指标 COD TN TP NH +4 -N
含量 /mg·L －1 2 590 61. 8 38. 2 6. 8
以绿藻培养基培养的 4 种处于对数生长期的小
球藻为种子液，接种到如表 2 所示的 5 种试验组培
养基中，接种后的干重折合约(0. 1 ± 0. 01)g·L －1，
于温度为 (26 ± 1)℃，光强为(5 000 ± 500)lx 条件
下，在培养体积为 2 L的三角瓶中，由底部连续通入
空气培养(空气流速为 60 L·h －1)18 d． 每天取 20
mL测生物量． 培养结束后离心藻液，干燥测得最终
生物量、含油率、产油率同时检测培养液中 COD
(chemical oxygen demand，化学需氧量)、TN(总
氮)、TP(总磷)、NH +4 -N 去除率． 每组设 3 个平行
对照．
表 2 5 种培养基的体积组成
Table 2 Composition of the five kinds of culture medium
项目
培养基编号
1 2 3 4 5
沼液污水比例 0 1 /10 1 /4 1 /2 3 /4
绿藻培养基比例 1 9 /10 3 /4 1 /2 1 /4
在 5 种培养基筛选得到的培养基基础上，利用
营养缺陷试验进一步优化培养基，营养缺陷组的试
验安排如表 3 所示．
1. 3. 3 细胞生长与生物量测定
试验期间每天上午 10:00 取各试验组藻液 20
mL 于 50 mL 离心管(提前烘至恒重 W1)中6 000
r·min －1离心 10 min，弃上清液，将含有藻体的离心
管于 105℃烘箱下烘至恒重(W2)，藻细胞生物量
DW(g·L －1)的计算式如下:
DW = (W2 － W1)/20 × 10
－3 (1)
式中，W1 为空管质量(g)，W2 为烘后管和物料总质
量(g)．
1. 3. 4 细胞含油率测定
小球藻油脂提取方法如下［14 ～ 16］:准确称取待测
藻粉各 1. 0 g(W4)于研钵中，加入 1. 0 g 石英砂，研
磨 5 min，转入碘量瓶，加入 100 mL 乙醚，在超声波
功率为 500 W下每超声 5 s间歇 10 s，反复 20 次后，
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环 境 科 学 35 卷
表 3 培养基营养元素筛选试验
Table 3 Experimental group arrangements for the screening of nutrients in wastewater medium
组成
试验组编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
NaNO3 － + + + + + + + +
KH2PO4 + － + + + + + + +
MgSO4·7H2O + + － + + + + + +
CaCl2·2H2O + + + － + + + + +
柠檬酸 + + + + － + + + +
柠檬酸铁铵 + + + + + － + + +
Na2EDTA + + + + + + － + +
Na2CO3 + + + + + + + － +
A5 + + + + + + + + －
置于通风橱中提取 12 h后用滤纸过滤，并用少量乙
醚洗涤三角瓶和滤渣 3 次过滤至 250 mL三角瓶中，
60℃水浴锅中蒸发浓缩至干后，将三角瓶置于
105℃烘箱中烘至恒重，准确称取油脂质量(W3)，计
算含油率 u(%):
u = W3 /W4 × 100% (2)
式中，W3 为油脂质量 (g)，W4 为藻粉质量(g)．
1. 3. 5 产油率测定
产油率 m定义为平均每天每升培养基中的藻
细胞所产的油脂质量，它综合考虑了单位体积培养
基中微藻能达到的生物量和藻体含油率两个因素．
产油率 m［mg·(L·d)－ 1］计算公式为:
m = DW × u / t × 10 －3 (3)
式中，DW为生物量(g·L －1)，u 为含油率(%)，t 为
培养天数(d)．
1. 3. 6 COD、TN、TP、NH +4 -N去除率测定
利用水质分析仪进行测定．
2 结果与分析
2. 1 4 种小球藻在不同培养基中的生物量、含油率
和产油率
每天监测各组生物量变化，并收获各试验组第
18 d的藻液，测得各试验组的生物量、含油率和产
油率如图 1 ～ 3 所示． 由图 1 可以看出，在 4 号和 5
号培养基中，4 种小球藻的生物量较在 1 号、2 号、3
号培养基中显著降低，可见，沼液污水所占比例过高
会显著抑制小球藻的生长，特别是在沼液污水占3 /4
的 5 号培养基中，4 种小球藻的生长量几乎为零;而
在 2 号和 3 号培养基中的 4 种小球藻的生物量与 1
号培养基中得到的生物量相差不大，所以一定比例
范围内的污水浓度对小球藻的生长没有影响，利用
沼液污水配制而成的培养基是可行的． 相比较 4 种
小球藻，在不同比例的污水培养基中，小球藻 BJ05
和 BJ01 的生物量均显著大于 BJ07 和 BJ09，说明小
球藻 BJ05 和 BJ01 的适应污水环境能力更强;除了
在 1 号不含污水的绿藻培养基中，小球藻 BJ05 的生
物量小于小球藻 BJ01 的生物量，而在 2 ～ 5 号含不
同污水比例的培养基中，小球藻 BJ05 的生物量均略
大于小球藻 BJ01 的生物量．
图 1 不同小球藻在 5 种培养基中的生物量比较
Fig． 1 Biomass of different chlorella in the 5 kinds of culture medium
图 2 可以看出，4 种小球藻在 5 种培养基中的
藻细胞含油率在 8. 3% ～ 16. 2%间浮动，在 5 种培
养基中，BJ05 的细胞含油率均比其他 3 种小球藻
高，在 5 号培养基中 BJ05 的细胞含油率达到最高，
为 16. 2%，其次为 3 号培养基中的 15. 6% ．
图 3 可以看出，在生物量和含油率二者的综合
影响下，4 种小球藻在 5 种培养基中的产油率相差
较大，BJ05 和 BJ01 由于其生物量和细胞含油率均
较 BJ07 和 BJ09 高，所以二者的产油率明显较高，而
相比较 BJ05 和 BJ01 的产油率，由于 BJ05 的细胞含
油率较高，所以 BJ05 的产油率较高;除 BJ05 外，随
着培养基中沼液污水所占比例的提高，BJ07、BJ09
和 BJ01 的产油率呈下降趋势，BJ05 在 3 号培养基
中的产油率较在 1 号、2 号培养基中的产油率略有
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6 期 赵凤敏等:基于沼液的培养基及产油小球藻藻种选育
图 2 不同小球藻在 5 种培养基中的含油率比较
Fig． 2 Oil content of different chlorella
in the 5 kinds of culture medium
提高，达到 20 种试验组合中的最高值，在 4 号和 5
号培养基中由于其生物量极低导致其产油量急剧下
降． 虽然 BJ05 在 2 号和 3 号培养基中的产油率几
乎没有差距，但是，从处理更多的污水角度来讲，3
号培养基更具有优势．
图 3 不同小球藻在 5 种培养基中的产油率
Fig． 3 Oil productivity of different chlorella
in the 5 kinds of culture medium
2. 2 污水中营养缺陷对 BJ05 产油的影响
沼液污水中含有氮磷等多种营养成分，部分营
养成分可能含量较高足以供应小球藻的生长，而有
些营养成分可能较低不足以供应小球藻的生长，为
了降低培养成本，在利用污水培养小球藻时，只希望
添加沼液中不足以供应小球藻生长的营养成分． 因
此在 3 号培养基基础上，缺乏绿藻培养基中不同营
养母液或微量营养元素，考察污水培养时哪些营养
成分为微藻生长所必需．
2. 3 不同营养对 BJ05 产油的影响
如图 4 所示，BJ05 在分别不添加柠檬酸和碳酸
钠的培养基中生长情况良好，测得产油率分别为
9. 23 mg·(L·d)－ 1、9. 15 mg·(L·d)－ 1，而其它试验
组生长情况较差，无法正常生长． 说明柠檬酸和碳
酸钠并非必须添加，而其他营养元素则必须添加才
能满足小球藻的生长． 分析原因可能是碳酸钠为小
球藻生长过程提供无机碳源，而通入的空气中含有
CO2 能够提供无机碳，柠檬酸提供有机碳源，但污水
中的 COD较高，说明有机碳含量较高，能够满足小
球藻 BJ05 的碳源需求，而污水中其他营养成分的缺
乏则必须经人工添加方可满足小球藻的生长．
图 4 沼液添加不同营养元素对 BJ05 生长的影响
Fig． 4 Effects of different nutrients added in wastewater
on the growth of chlorella BJ05
图 5 BJ05 在不添加柠檬酸和碳酸钠的沼液中生长情况
Fig． 5 Growth of chlorella BJ05 in biogass slurry without
addition of citrate acid and Na2CO3
在 3 号培养基不添加碳酸钠或柠檬酸试验的
基础上，考察同时不添加碳酸钠和柠檬酸对 BJ05
的生长和产油的影响，结果如图 5 所示，BJ05 在
同时不添加柠檬酸和碳酸钠的 3 号培养基中生
长情况良好，并且测得其生物量和细胞含油率分
别为 1. 08 g·L － 1，含油率为 15. 6%，产油率达
9. 36 mg·(L·d)－ 1，高于未优化的 3 号培养基中
得到的 9. 20 mg·(L·d)－ 1，分析原因可能是碳源
过量，柠檬酸和碳酸钠的添加反而抑制了小球藻
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环 境 科 学 35 卷
BJ05 产油 ．
分别比较不添加柠檬酸或碳酸钠、以及同时不
添加柠檬酸和碳酸钠这 3 种情况下，小球藻 BJ05 产
油率相差不大，说明柠檬酸和碳酸钠非必须添加．
培养结束后，检测 3 号培养基中 COD、TN、TP、
NH +4 -N的消耗量发现，BJ05 在该培养基中的 COD、
TN、TP、NH +4 -N 去除率分别达到 59%、75%、
61%、100% ．
3 讨论
本研究基于沼液污水，对不同比例的培养基和
不同小球藻藻种进行了选育，选育出小球藻 BJ05，
但是，对于培养基的选育仍然有需进一步研究的地
方，比如，如何保证沼液污水的相对稳定性，还需更
多的前处理研究． 另外，研究每种营养成分添加多
少能保证小球藻的产油率不受影响或者有更大的提
高，从而进一步减小培养小球藻产油的成本，具有更
现实的意义．
4 结论
(1)本研究基于中国农业机械化科学研究院
农业生态科技园沼气发酵池中的沼液污水，探讨
沼液污水培养小球藻产油的可行性． 结果发现，
BJ05 能很好地在含 1 /4 沼液污水的培养基中生
长，并获得较高的产油率，沼液污水中添加适量的
无机氮、无机磷，镁盐、钙盐、柠檬酸铁铵、络合
剂和微量元素，即可较好地用于微藻的培养与油
脂生产，但对于沼液污水的稳定性和营养元素的
添加的量还有待进一步研究，这样才具有更好的
应用前景．
(2)同时，对培养水体中 COD、TN 和 TP 残留
的检测结果发现，微藻对无机氮与磷均有着高效的
吸收机制． 沼液污水用于含油微藻的培养前景广
阔，通过部分营养元素的添加，即可获得高产油率的
微藻生物质，在产生巨大经济效益的同时，解决了污
水处理中无机氮与无机磷难以去除的难点，可以缓
解农村发展对环境破坏的压力，对我国农村和能源
发展具有重要社会效益．
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