全 文 ：[ 文章编号] 1000-8861(2005)04-0313-04
盐酸青藤碱抑制小鼠胶原性关节炎的实验研究
李景怡a ,吴玉章b ,陈永文b ,张静波b ,王　勇a ,方勇飞a＊(第三军医大学 a.西南医院中医科;b.全军免
疫学研究所 ,重庆 400038)
[收稿日期] 2004-11-26;[ 修回日期] 2005-03-24
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(30300452)
[作者简介] 李景怡(1974-), 女 ,河北唐山市人 ,医师 ,硕士 , 主要从
事自身免疫性疾病的临床和机制研究。(Tel) 023-
68765208;(E-mail)ljyli jingyi@yahoo.com.cn
＊通讯作者
[ 摘　要] 　目的　探讨 SN在改善小鼠胶原性关节炎(CIA)关节症状 、抑制体液免疫和细胞免疫方面与甲氨喋呤(MTX)的
异同以及与MTX 是否有叠加效应。方法　以 CIA 为研究对象 , 观察不同剂量 SN和 SN+MTX 治疗后 , 小鼠关节炎症的变化;
ELISA 法测定各组小鼠脾细胞分泌 IFN-γ的能力和小鼠血清中抗 Ⅱ胶原抗体的水平。结果　无论大剂量还是小剂量应用 SN
治疗 CIA ,其改善炎症症状 、抑制 IFN-γ和抗 Ⅱ型胶原抗体的能力均不及经典抗风湿药物———MTX。但 SN 与 MTX 联合治疗
CIA ,疗效优于其他治疗方案。结论　与临床长期应用 SN治疗 RA 的经验相似 , 将 SN作为一种辅助治疗药物 , 与 MTX等二线
药物联合应用 ,可以达到更确切的治疗效果。
[ 关键词] 　盐酸青藤碱;胶原性关节炎;免疫抑制
[ 中图分类号] 　R593.22　　　　[ 文献标识码] 　A
Suppression of sinomenine on collagen-induced arthritis mouse
LI Jing-yi , WU Yu-zhang , CHEN Yong-wen , ZHANG Jing-bo , WANG Yong , FANG Yong-fei(Department of Tradi-
tional Chinese Medicine , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China)
[ Abstract] 　Objective　To investigate the immunosuppression effects of sinomenine(SN)on the humoral and cellular immunity , as well
as the curative effi-cacy of SN on collagen-induced arthritis(CIA)mouse.Methods　The CIA mice were treated with SN or SN +MTX at
different dosages and the changes after the treatment were observed.The IFN-γ-secreting ability of spleen lymphocytes and the level of anti-C
Ⅱ antibodies in serum were assayed by ELISA.Results　SN could suppress the cellular and humoral immunity responses to CⅡ and alter the
sequential development of arthritis , but the curative efficacy of SN was inferior to MTX.SN in combination with MTX had a better curative effi-
cacy on arthritis than SN or MTX did.Conclusion　Similar to the clinical impact in RA patients , SN might be a useful drug for the assistant
treatment.Treat with SN in combination with MTX would be more beneficial to RA patients.
[ Key words] 　Sinomenine;Collagen-induced arthritis;Immunosuppression
　　类风湿关节炎(RA)是以对称性多关节滑膜炎
为特点的自身免疫性疾病 ,其特点为关节骨质破坏 、
功能丧失甚至残疾 ,是严重威胁人类健康的疾病之
一。目前认为有可能控制 RA炎症进展的药物即慢
作用抗风湿药(DMARDs),以甲氨喋呤(MTX)为代表
的此类药物具有一定的免疫抑制效应 ,但尚无有力
证据证实其治疗可控制或逆转骨侵蚀的发生 ,且因
伴随严重的消化道反应 、骨髓抑制等副作用而导致
病人无法长期服用 。近期用于临床的免疫制剂如
IL-1受体拮抗剂[ 1]等 ,对其疗效尚无肯定的结论 ,并
且因易伴发感染 、狼疮样病变及淋巴瘤等副作用而
限制了其进一步应用。因此 ,寻找新的有效且副反
应较小的治疗 RA的药物是国内外风湿学界普遍关
注的问题。
青风藤作为传统中医药学中治疗各种关节炎的
一味主药 ,经过数百年的临床验证 ,认为其能够改善
关节症状 ,且副作用小 ,病人的耐受性好 ,适应于上
述疾病患者长期服用。青藤碱(Sinomenine , SN)是
提取自青风藤的生物碱 ,既往的研究表明 SN具有抗
炎 、镇痛 、抗风湿 、免疫抑制等药理作用 。本文以 RA
动物模型-小鼠胶原性关节炎(CIA)为研究对象 ,比
较 SN 在改善症状 、体液免疫 、细胞免疫等方面与
MTX的异同以及与MTX是否有叠加效应 。
·313·　免 疫 学 杂 志　第 21卷　第 4 期　2005年 7 月　　IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.21 No.4 July 2005
DOI :10.13431/j.cnki.immunol.j.20050093
1　材料与方法
1.1　主要试剂　完全弗氏佐剂 、不完全弗氏佐剂 、
牛鼻软骨 Ⅱ型胶原(C Ⅱ)(Sigma 公司);MTX(上海
华联制药有限公司);SN(湖南正清制药集团);HRP-
兔抗鼠 IgG 抗体(BETHYL 公司);小鼠 IFN-γELISA
检测试剂盒(DIACLONE公司)。
1.2　小鼠胶原性关节炎模型的建立　雄性 Balb/c
小鼠 , 8周龄;将 1 mg C Ⅱ 与完全弗氏佐剂以 1∶1比
例乳化 ,每日小鼠尾根部皮下注射 100 μL/只 。第
21天 ,将C Ⅱ与不完全弗氏佐剂以 1∶1比例乳化后 ,
再次小鼠尾根部皮下注射 100 μL/只。每日观察关
节红肿程度 、皮下结节 、红斑等情况 ,并每隔 1 d 进
行关节评分。对照组于同一时间注射等量 PBS。
关节评分标准:正常为 0 分;1 个关节肿胀为
1分;超过 1个关节肿胀 , 但并未累积全部关节为
2分;整个爪的严重肿胀或强直为 3 分。每只爪的
评分相加即得到小鼠关节炎症的总评分。关节总评
分大于1的小鼠为模型建立成功 。
1.3　实验分组　正常雄性 Balb/c小鼠 6只 ,成功建
立CIA模型的雄性 Balb/C小鼠 30只 ,每组 6只 ,分
组情况如下 。A 正常小鼠对照组;B CIA:生理盐水
治疗组(阴性对照组);C CIA:SN 7.5 mg/(kg·d)治疗
组;D CIA:SN 15mg/(kg·d)治疗组;E CIA:MTX每周
0.4 mg/kg 治疗组(阳性对照组);F CIA:每周 MTX
0.4 mg/kg+SN 7.5mg/(kg·d)治疗组。以小鼠出现
关节肿胀的第 1天作为治疗的第 1 天 ,选择小鼠后
肢内侧进行肌肉注射 ,间隔 1 d记录关节评分 。
1.4　小鼠脾淋巴细胞的分离与培养　第 1次免疫
后56 d脱颈处死小鼠 ,剪下脾脏 ,于100目筛网上轻
轻碾碎并冲洗。将冲洗下的细胞溶液吸入离心管
中 ,1 200 r/min离心 9 min。加 2 mL 的红细胞裂解
液于细胞沉淀 ,充分重悬细胞沉淀;洗涤细胞 2次 ,
最终将细胞重悬于 10 mL 含 100 mL/L 小牛血清的
1640细胞培养液中。于 24孔培养板中加入 1 mL 含
1×106 淋巴细胞的完全 1640培养基 ,50 μg/mL 的 C
Ⅱ 1 mL或不完全 1640培养基 1 mL ,37 ℃, 50 mL/L
CO2孵箱中孵育 48 h ,100 r/min离心 10 min后 ,取上
清置于-70°冰箱中保存待测。
1.5　夹心 ELISA法检测培养上清液中的细胞因子
IFN-γ　酶标板各孔中分别加入 100 μL标准品稀释
液 、200 μL 标准 IFN-γ并等倍稀释 。然后各孔中加
100μL待测样品及 50 μL IFN-γ抗体。封口后 ,室温
孵育 3 h。充分洗涤后各孔中加 100μL HRP ,室温孵
育 20 min。再次洗涤后各孔中加 100 μL TMB 显色
液 ,室温避光孵育 15 min。最后各孔中加 100μL 终
止液。450 nm 波长检测 。
1.6　间接 ELISA法检测血清中抗Ⅱ胶原抗体　于
第 1次免疫后 56 d行小鼠眼眶取血并分离血清 ,不
同浓度稀释。将 C Ⅱ以 25 μg/mL 的质量浓度溶于
pH9.6的 Coating buffer中 ,酶联板每孔中加入上述溶
液 100μL , 4 ℃包被 16 h;PBS 洗 3次后 ,每孔中加入
50 g/L 的 BSA 室温封闭 1 h;PBS 洗 5次后 ,每孔中
加入不同稀释浓度的小鼠待测血清 100 μL ,室温孵
育2 h;加入 HRP-兔抗鼠 IgG抗体 100 μL ,室温孵育
1 h ,其余步骤同 1.5。
1.7　统计学处理　采用 SPSS11.0软件进行数据分
析 ,计量资料均采用均数±标准差( x ±s)表示 。组
间显著性比较采用 t检验。
2　结果
2.1　成功建立 CIA 模型　CIA组小鼠于免疫后第
8 ～ 12天先后出现后爪关节肿胀 , PBS对照组在 56 d
内无任何症状及体征改变。与正常小鼠比较 , CIA
组小鼠活动能力降低 ,后爪明显肿胀 ,关节呈屈曲状
态(图 1),CIA小鼠前爪 、尾部关节无改变 ,未出现结
节 、红斑和关节强直。常规 HE染色病理切片(图 2)
显示在滑膜组织中有大量炎细胞浸润 ,滑膜组织轻
度增殖 ,但无血管翳形成 ,软骨及软骨下骨无骨质破
坏 。病理学研究证实在本模型中 ,关节局部存在特
异性炎症。
2.2　各药物干预组小鼠每周关节炎症评分　正常
对照组小鼠在全程观察期间均未出现关节炎性改
变 ,其他各组则有不同程度的关节炎症表现 。从初
次免疫后第 56天起 ,MTX组 、MTX+SN 组 、SN 大剂
量组[ 15 mg/(kg·d)]小鼠关节评分均显著低于生理
盐水对照组(P <0.05)。其中 ,MTX+SN组关节评
分最低 ,其次为MTX组 ,而 SN小剂量组和大剂量组
关节评分均高于 MTX组(表 1)。
2.3　各组小鼠脾淋巴细胞经 CⅡ体外刺激后分泌 IFN-
γ水平　生理盐水对照组 IFN-γ水平显著高于正常对
照组(P<0.05);各治疗组 IFN-γ水平均显著低于生理
盐水对照组(P <0.05),其中以MTX+SN治疗组最低 ,
而两个SN治疗组均高于MTX组(表1)。
·314· 　　　　　　　免 疫 学 杂 志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21卷
2.4　各组小鼠血清抗 Ⅱ型胶原抗体水平　生理盐
水对照组抗 Ⅱ型胶原抗体水平高于正常对照组
(1∶10和 1∶100两个稀释水平:P <0.05);MTX组 、
MTX+SN 、SN大剂量组[ 15 mg/(kg·d)] 组抗 Ⅱ型胶
原抗体水平均显著低于生理盐水对照组(P <
0.05),其中以 MTX+SN 治疗组最低 ,而两个 SN 治
疗组均高于MTX组(表1)。
3　讨论
SN因其确切的治疗效果 、较少的副反应而被广
泛用于治疗各种关节炎症 ,特别是 RA ,但是具体的
治疗机制尚不明确 。既往对SN的体外研究发现SN
a)　CIA model mice;b)　Control mice
图 1　正常小鼠与 CIA小鼠
Fig 1　Normal mice and CIA mice
a)　注射 PBS小鼠后爪的滑膜组织;b)　CIA 小鼠后爪的滑膜组织;c)　SN[ 15mg/(kg·d)] 治疗后CIA小鼠后爪的滑膜组织
a)　Synovial tissue of hind limbs of control mice;b)　Synovial ti ssue of hind limbs of collagen-induced arthriti s mice;
c)　Synovial tissue of hind limbs of collagen-induced arthritis mice after the treatment of SN [ 15mg/(kg·d)]
图 2　对照小鼠 、CIA小鼠关节滑膜病理切片(×400 ,HE)
Fig 2　Control and CIA mice synovial tissue pathological section(×400 ,HE)
　表 1　不同治疗抑制 CIA 的效应
　Tab 1 Effects of the different treatment
Group
Arthritis index
4 weeks 8 weeks
OD450 nm
1∶10　　 1∶100　　 IFN-γ/(pm·mL
-1)
Control 0 0 0.116±0.004 0.092±0.009 2.32±0.37
B 3.5±0.75 4±1　 0.347±0.014＊ 0.241±0.073＊ 94.21±3.24＊
C 3.33±0.79 3±0.67 0.286±0.033 0.247±0.006 71.78±3.69＊＊
D 2.25±0.375 1.75±0.5＊＊ 0.277±0.040 0.196±0.007＊＊ 64.11±5.82＊＊
E 2.25±0.375 1.5±0.5＊＊ 0.270±0.036 0.187±0.156＊＊ 58.96±2.13＊＊
F 2.5±0.75 0.5±0.5＊＊ 0.218±0.029＊＊ 0.153±0.059＊＊ 52.55±4.51＊＊
　＊ P<0.05 , vs control group;＊＊ P<0.05 , vs group B
可抑制 IL-2等多种细胞因子的分泌 、可抑制 TGF-β2
和 IL-1β引起的滑膜成纤维细胞的增殖反应等[ 2 , 3] 。
那么 SN对 RA 的治疗效果是否与它的这种免疫抑
制活性有直接关系呢 ?相关的体内实验研究文献未
见报道 ,针对这个问题 ,我们从临床表现 、体液免疫 、
细胞免疫和病理等几个方面对 SN进行了研究。
在改善小鼠关节炎症症状方面 ,与阴性对照(生
理盐水组)相比 ,无论小剂量还是大剂量单独应用
SN治疗 CIA2月后 ,均可明显改善关节炎症 ,但 SN
治疗效果均不及 MTX组和MTX与SN联合治疗组 。
因此 ,虽然SN可有效改善关节炎症症状 ,但其治疗
效果不及经典抗风湿药物MTX。而 MTX与SN联合
应用较单独应用MTX治疗显示了更好的疗效 。从
改善关节炎症症状上判断 ,在 CIA的早期治疗中 ,SN
作为一种辅助药物更为稳妥和恰当 。
对 RA的免疫病理机制的研究认为 CD4+T 细胞
在 RA 的炎症发生过程中充当了启动者的角色:
CD4
+
T细胞迁移至滑膜 ,识别特定的抗原肽后 ,释
放出数种细胞因子[ 4]尤其是Th1极化的细胞因子如
IFN-γ[ 5] ,这些细胞因子又刺激其他细胞如巨噬细胞
·315·第 4 期　　　　　　　　李景怡 , 等.盐酸青藤碱抑制小鼠胶原性关节炎的实验研究
分泌促炎性细胞因子如 IL-1β和 TNF-α,进而导致炎
症的发生[ 6] 。基于上述研究 ,抑制 CIA体内针对C Ⅱ
的细胞免疫反应能够减轻关节炎症 。在这个过程
中 ,由于 IFN-γ具有诱导并提高各类细胞上 MHC Ⅱ
分子表达的能力而被认为扮演了重要的角色[ 7] 。因
此本研究通过比较各组小鼠脾淋巴细胞经 C Ⅱ体外
刺激后分泌 IFN-γ的能力初步分析了 SN 对 T 细胞
功能的影响:不同药物组治疗 CIA后 ,小鼠脾淋巴细
胞分泌 IFN-γ的能力均高于正常小鼠组 ,但明显低
于阴性对照组 ,而 SN+MTX 组 IFN-γ水平最低 ,提
示SN具有抑制 IFN-γ分泌的功能 ,并且与MTX协同
应用时 ,这种功能得到强化。在本研究中 ,两种剂量
SN抑制 IFN-γ分泌的能力无显著差异 ,与临床实际
应用的结果一致 ,即 SN 7.5 mg/(kg·d)的治疗剂量
接近临床病人口服/注射剂量 ,加大治疗剂量并不能
达到更好的治疗效果 。
体液免疫也在 RA的炎症过程中发挥了重要作
用 ,尤其表现在具有严重症状和较长病程的 RA 病
人中[ 8] 。在 RA中 Ⅱ型胶原是最为关注的自身抗原
之一 ,在 RA 病人的血清和关节积液中均发现了针
对型胶原的自身抗体 。对 CIA 免疫机制的研究发
现 ,小鼠体内特异性的抗Ⅱ型胶原抗体是与关节炎
症相关的最重要的抗体 ,甚至在小鼠关节症状出现
之前即可检测到此抗体的存在 ,而在正常小鼠体内
输入该抗体后也可引起关节炎症改变[ 9] 。CIA小鼠
体内的抗C Ⅱ抗体与 RA病人体内的该抗体在与同
种胶原结合 、反应并形成免疫复合物的能力上非常
相似[ 10] 。因此我们通过检测各组中 CIA 小鼠血清
中的抗 Ⅱ型胶原抗体来初步分析 SN 对 B细胞功能
的影响 ,与前两项结果相似 ,MTX+SN 组中抗 Ⅱ型
胶原抗体水平最低 ,提示 SN虽然具有抑制体液免疫
的功能 ,但这种能力较弱 。
从上述三个方面的研究发现 ,不同治疗方案均
有一定的抑制炎症的效果 。但无论大剂量还是小剂
量应用SN治疗 CIA ,其改善炎症症状 、抑制 IFN-γ和
抗Ⅱ型胶原抗体的能力均不及经典抗风湿药物———
MTX。本研究发现SN与MTX联合治疗CIA ,得到了
优于其他治疗方案的结果 。上述研究结果与临床长
期应用SN治疗 RA的经验相似 ,即将 SN 作为一种
辅助治疗药物 ,与MTX等二线药物联合应用 ,可以
达到更好的治疗效果 。来源于传统中药的生物碱 ,
大多具有多个作用靶点 ,本研究发现 SN具有弱的抑
制体液免疫和细胞免疫的能力 ,但与其较好的临床
疗效不完全一致 ,说明SN的上述功能只能部分解释
其治疗 RA的药理机制 。
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(编辑　肖　红)
·316· 　　　　　　　免 疫 学 杂 志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21卷