全 文 ：Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2016年第04期
黄皮疣柄牛肝菌多酚提取
及对Caco-2结肠癌细胞抑制作用研究
刘雨阳1，侯玉艳1，吴素蕊2，赵天瑞1，樊 建1，*
（1.昆明理工大学，云南省食品安全研究院，云南昆明 650500；
2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221）
摘 要：以黄皮疣柄牛肝菌为原料，乙醇为提取溶剂，采用Folin-Ciocalteu法测定多酚含量，研究了乙醇浓度、提取温
度、料液比和提取时间对多酚得率的影响。在单因素实验的基础之上，通过正交实验优化提取工艺参数，并测定了所
得多酚组成及其对Caco-2结肠癌细胞的抑制作用。结果表明，最佳提取工艺条件为：温度为80 ℃，乙醇浓度为50%，料
液比为1∶25 g/mL，提取1 h。在此提取工艺条件下，最佳提取次数为2次时，黄皮疣柄牛肝菌多酚的得率为5.46%±
0.04%；在18种酚类物质中，在黄皮疣柄牛肝菌中检出5-磺基水杨酸、儿茶素和肉桂酸等8种多酚类物质，其中5-磺基
水杨酸含量最高为779.00 mg/100 g；黄皮疣柄牛肝菌多酚对Caco-2结肠癌细胞产生一定程度的抑制作用，当其浓度
为175 μg/mL时，抑制率达55.07%。
关键词：黄皮疣柄牛肝菌，多酚，Caco-2结肠癌细胞，抗癌
The polyphenol extraction of Leccinellum crocipodium
and their inhibitory effect on proliferation of Caco-2 cells
LIU Yu-yang1，HOU Yu-yan1，WU Su-rui2，ZHAO Tian-rui1，FAN Jian1，*
（1.Yunnan Institute of Food Safety，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；
2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooperatives，Kunming 650221，China）
Abstract：The polyphenols were extracted from the Leccinellum crocipodium by ethanol as extraction solvent
extraction and Folin-Ciocalteu method. The effect of ethanol concentration，temperature，solid-liquid ratio and
time on the extraction efficiency of polyphenols were identified. Based on single factor test，an orthogonal
design was applied to optimize extraction process. The polyphenol composition and inhibitory effect on Caco-
2 cells of Leccinellum crocipodium were investigated in the present work. The results showed that the optimum
conditions for extraction of polyphenols were temperature of 80 ℃，ethanol concentration of 50% ，solid-liquid
ratio of 1∶25，extracted 1 h，two times. Under this condition，polyphenol extraction rate was 5.46%±0.04%.
Among 18 kinds of polyphenols，the polyphenols of this wild edible fungi were mainly composed of 5-sulfosalicylic
acid，catechin，cinnamon and other five kinds of polyphenols，and the content of 5-sulfosalicylic acid up to
779.00 mg/100 g. The inhibitory effects on colon carcinoma cells showed that the cell inhibition rate was up to
55.07%，when the polyphenols concentration was 175 μg/mL.
Key words：Leccinellum crocipodium；polyphenol；colon carcinoma cells；anticancer
中图分类号：TS201.3 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2016）04-0278-06
doi：10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.047
收稿日期：2015－09－10
作者简介：刘雨阳（1991-），女，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail：303245011@qq.com。
* 通讯作者：樊建（1964-），男，硕士，副教授，研究方向：食品科学与工程，E-mail：fanj333@163.com。
基金项目：国家科技支撑计划课题（2013BAD16B01）。
黄皮疣柄牛肝菌又称黄癞头（Leccinellum
crocipodium），属 真 菌 界（Fungi），担 子 菌 门
（Basidiomycota），伞菌纲（Agaricomycetes），牛肝菌目
（Boletales），牛肝菌科（Boletaceae），疣柄牛肝菌属
（Leccinellum），菌肉细嫩、味道鲜美[1]。外生菌根菌，
夏秋季生于针阔叶混交林或阔叶林下，子实体粗壮
坚实，商品性状极佳[2]。云南、江苏、浙江、安徽、福建、
湖南、湖北、广东、西藏、贵州和台湾均有分布[3]。黄皮
疣柄牛肝菌蛋白质含量为35.1%，可作为蛋白质来源
之一，满足人们对蛋白质营养的需求。黄皮疣柄牛肝
菌含有许多生物活性物质，如多酚、多糖等[4]，还含有
镁、铁、钙、锌等矿物质元素。
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工 艺 技 术
2016年第04期
Vol . 37 , No . 04 , 2016
野生菌多酚是一类广泛存在于野生菌内的大分
子化合物。其具有较强的抗氧化性[5]、抑制癌细胞[6]、
降血压[7]和降血脂[8]等特点，并应用于食品、化妆品、
药品及保健品等领域。早于1957年，Lucas E H[9]首次
研究并报道了美味牛肝菌能够发挥抗肿瘤作用。但
对于黄皮疣柄牛肝菌中提取的多酚类物质抑制癌细
胞的研究鲜有报道。本文以云南地区的黄皮疣柄牛
肝菌为原料，采用乙醇溶剂浸提法，提取黄皮疣柄牛
肝菌中的粗多酚，优化提取工艺条件，测定其多酚组
成，并探究其对Caco-2结肠癌细胞的抑制作用，旨在
为黄皮疣柄牛肝菌的进一步研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜黄皮疣柄牛肝菌 购自云南曲靖马龙县；
结肠癌细胞（Caco-2） 由中科院昆明动物所提供；
乙腈，HPLC级 德国Merck KGaA公司；5-磺基水杨
酸、没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、儿茶素、4-羟基苯
甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、芦丁、鞣花
酸、阿魏酸、3，4-二甲氧基苯甲酸、苯甲酸、白藜芦
醇、槲皮素、肉桂酸 均≥99%，Sigma公司；二甲基亚
砜（AMSO） Biomol公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-
2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、胎牛血清、不完全培
养基DMEM Gibco公司；胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液
（PBS） Amresco公司；Na2CO3、Folin-ciocalteu、没食
子酸、乙酸和乙醇等其他试剂 均为国产分析纯。
ZD-F12真空冷冻干燥机 南京载智自动化设备
有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器上
海有限公司；HH-4恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限
公司；YHZ82恒温振荡器 常州国华电器有限公司；
L500台式低速自动平衡离心机 湖南湘仪实验室仪
器开发有限公司；1260高效液相色谱仪 Agilent，
Germany；CCL-170B -8二氧化碳培养箱 ESCO，
Singapore；SpectraMax M5多功能酶标仪 Molecular
Devices，America；生物显微镜 重庆澳浦光电技术
有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黄皮疣柄牛肝菌多酚的提取流程
黄皮疣柄牛肝菌预处理（冻干）→粉碎过筛（60目）→水浴
提取（2 g，80 ℃，70%乙醇50 mL，1 h）→过滤→合并滤液→离
↓ ↑
滤渣→二次提取
心（4000 r/min，10 min）[10]→浓缩冻干→多酚粗提物。
1.2.2 黄皮疣柄牛肝菌多酚含量测定
1.2.2.1 多酚得率的测定 多酚含量的测定使用
Folin-ciocalteu方法并经过适当修改进行测定[11]。取黄
皮疣柄牛肝菌多酚提取液0.5 mL加入2.5 mL 0.2 mol/L
福林酚试剂，振荡均匀后静置5 min，加入2.0 mL 7.5%
Na2CO3溶液，摇匀，避光静置1 h后765 nm下测定吸
光值。
1.2.2.2 标准曲线的绘制 配制20、40、60、80 μg/mL
没食子酸溶液，参照1.2.2.1方法测定吸光值，同时等
体积蒸馏水代替没食子酸溶液调零，绘制标准曲线。
1.2.2.3 多酚得率的计算 取不同条件下提取的样
液，测定吸光值，按下式计算得率。
多酚得率（%）=[提取液浓度（mgGAE/mL）×提取
液体积（mL）×稀释倍数]/[菌粉质量（g）×1000]×100
1.2.3 黄皮疣柄牛肝菌多酚提取实验设计及优化
1.2.3.1 单因素实验 以多酚得率为指标，考察提取温
度、乙醇浓度、提取时间、液料比对多酚得率的影响。
在其他相同的提取条件下（提取温度80 ℃，乙醇
浓度70%，提取时间1 h，液料比1∶25 g /mL，提取次数
为2次），分别考察提取温度（40、50、60、70、80、90 ℃）、
乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、料液
比（牛肝菌粉∶提取液）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、
1∶35 g/mL）、提取时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）4个单因
素对黄皮疣柄牛肝菌多酚得率的影响。
1.2.3.2 正交实验设计 在单因素实验的基础上，选
择乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为正交实
验因素，设计3个水平，以多酚提取率为考察指标，采
用L9（34）正交表优化实验方案，研究黄皮疣柄牛肝菌
中多酚类物质提取的最佳工艺条件，因素水平设计
见表1。
1.2.4 提取次数的确定 准确称取2 g黄皮疣柄牛
肝菌粉，每份加入50%的乙醇溶液50 mL，80 ℃水浴
提取1 h。提取次数超过1次的，合并提取液，测定吸
光值，计算得率。
1.2.5 HPLC法测定多酚的种类 样品配制：提取黄
皮疣柄牛肝菌中多酚类物质，55 ℃真空浓缩至膏状，
加少量水将提取物溶出后定容，测定提取物中多酚
类物质含量。进样前用0.45 μm有机膜过滤，备用。
参照Liang等[12]的方法并适当修改：色谱柱：Agilent
C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外检测波长280 nm，柱
温25 ℃，进样量10 μL，流速1 mL/min，流动相A为0.1%
乙酸溶液，流动相B为0.1%乙酸乙腈溶液。梯度洗脱程
序：0～2 min、10%B；2～27 min、10~30%B；27～40 min、
30～90%B；40～41 min、100%B；梯度均为线性变化。
1.2.6 黄皮疣柄牛肝菌多酚类物质对Caco-2结肠癌
细胞抑制作用
1.2.6.1 细胞培养 在无菌环境下吸出溶有Caco-2细
胞的冻存液，加入5 mL 37 ℃预热的含10%胎牛血清的
完全DMEM培养基中，1000 r/min离心5 min。弃去上清
液，加入适量的培养液后接种于培养皿中，置于37 ℃
5% CO2浓度以及饱和湿度环境的培养箱中培养，24 h
后更换培养液，继续培养24 h[13]，观察生长情况。
1.2.6.2 MTT法检测细胞存活率 稀释合适的倍数
使细胞浓度约为1×104个/孔。吸取200 μL稀释后的细
水平
因素
A 提取温度
（℃）
B 乙醇浓度
（%）
C 料液比
（g/mL）
D 提取时间
（h）
1 70 50 1∶20 0.5
2 80 60 1∶25 1
3 90 70 1∶30 1.5
表1 实验因素与水平
Table 1 Factors and levels of the experiment
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胞液至96孔板中，边缘的孔中加入150 μL PBS。37 ℃
细胞培养箱培养24 h。取出后将孔板中的培养基完
全吸出，加入不同浓度的样液（将冷冻干燥的乙醇提
取物，用少量二甲基亚砜（DMSO）溶解，然后加入完
全培养基稀释）200 μL到96孔板中，置于37 ℃ 5%
CO2浓度以及饱和湿度环境的培养箱中培养48 h。然
后弃去其中的培养液，加入150 μL 0.5 mg/mL MTT
溶液至孔板中，37 ℃培养箱中继续培养4 h后，将
MTT溶液吸取干净，然后每孔加入150 μL DMSO溶
液，紫色结晶产物完全溶解后 [14]于570 nm波长下测
定吸光值。按照如下方法计算细胞存活率：
细胞存活率（%）=（A0-A1）/（A2-A1）×100
式中：A0为单个样品处理组吸光度，A1为培养板
本底吸光度，A2为未加样品的对照组Caco-2结肠癌
细胞吸光度。
1.3 数据处理
数据采用Origin 8.5统计分析，实验重复3次，结
果用x±s表示，并用SPSS 19.0软件进行统计处理。
2 结果与分析
2.1 回归方程确立
以没食子酸浓度（线性范围：0.002～0.010 mg/mL）
与吸光度建立标准曲线回归方程为：C=6.323A+0.01495
（R2=0.9986）。没食子酸溶液在0.002～0.010 mg/mL范
围内线性关系良好。
2.2 单因素实验结果及分析
2.2.1 温度对多酚类物质提取效果的影响 由图1
可知，黄皮疣柄牛肝菌多酚得率随提取温度的升高
先增加后降低，在温度达到80 ℃时，多酚提取率达最
大值。温度升高，提取液的粘度下降，分子运动加速，
氢键更易断裂，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，
因而多酚类物质更易于溶出。但温度过高也会使多
酚发生氧化或者降解等一些不可逆的化学反应。另
外，温度过高也会导致提取剂乙醇的挥发，导致多酚
得率的下降[15]。
2.2.2 乙醇浓度对多酚类物质提取效果的影响 由
图2可知，随着乙醇浓度增大，黄皮疣柄牛肝菌多酚
的提取率不断增加。当乙醇浓度达到60%时，多酚得
率最高，超过此浓度，提取得率下降。可能是因为乙
醇浓度过高，一部分乙醇会挥发影响提取率。另外，
乙醇浓度过高会使醇溶性杂质、色素成分溶出，导致
提取率下降，而乙醇浓度较低时，糖类物质和水互溶
会影响多酚的提取率[16]。
2.2.3 料液比对提取效果的影响 由图3可知，在相
同提取条件下，随着料液比的增大，黄皮疣柄牛肝菌
多酚得率不断增加。当料液比达到1∶25时，大多数多
酚被提取出来。加大溶剂量后，多酚得率没有显著提
高。另外，料液比过高，醇溶性杂质浸出率也会增高，
对后续处理不利。因此，综合考虑到溶剂的用量以及
节能减排等需要，选取最佳料液比为1∶25。
2.2.4 时间对多酚类物质提取效果的影响 理论上
说，提取率随提取时间的增加而增大[17]。但是提取达
到一定时间时，多酚的溶出达到平衡，即使再延长提
图1 温度对黄皮疣柄牛肝菌多酚得率的影响
Fig.1 Effect of temperature on the extraction of
Leccinellum crocipodium polyphenols
温度（℃）
40 50 60 70 80 90
4.0
3.6
3.2
2.8
2.4
多
酚
得
率
（
%）
图2 乙醇浓度对黄皮疣柄牛肝菌多酚得率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction of
Leccinellum crocipodium polyphenols
乙醇浓度（%）
30 40 50 60 70 80
4.0
3.6
3.2
2.8
2.4
多
酚
得
率
（
%）
图3 料液比对黄皮疣柄牛肝菌多酚得率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid on the extraction of
Leccinellum crocipodium polyphenols
料液比（g·mL-1）
1∶10 1∶15 1∶20 1∶25 1∶30 1∶35
4.4
4.0
3.6
3.2
2.8
多
酚
得
率
（
%）
图4 时间对黄皮疣柄牛肝菌多酚得率的影响
Fig.4 Effect of time on the extraction of
Leccinellum crocipodium polyphenols
时间（h）
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
4.8
4.4
4.0
3.6
3.2
多
酚
得
率
（
%）
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工 艺 技 术
2016年第04期
Vol . 37 , No . 04 , 2016
图5 提取次数对黄皮疣柄牛肝菌多酚得率的影响
Fig.5 Effect of extraction times on Leccinellum crocipodium
polyphenols
提取次数
1 2 3 4 5
6.0
5.6
5.2
4.8
4.4
多
酚
得
率
（
%）
取时间，提取率也不会显著增加。另外，浸提时间过
长时，多酚物质会发生降解、氧化等化学反应致使多
酚分子结构发生一定的破坏。由图4可知，提取1 h后，
多酚提取率有所下降，故选取1 h为最佳提取时间。
2.3 牛肝菌多酚提取工艺的正交实验
在单因素实验的基础上，以黄皮疣柄多酚得率
为考察指标，采用L9（34）正交表研究最佳提取条件，
结果见表2。
由表2结果可知，4个因素对黄皮疣柄牛肝菌多
酚浸提效果影响最大的是浸提温度，其次是料液比
和时间，影响最小的是乙醇浓度。浸提黄皮疣柄牛肝
菌多酚的最佳工艺条件组合为A2B1C2D2，即温度为
80 ℃，乙醇浓度为50%，料液比为1∶25 g/mL，提取
1 h。对照正交表，正交实验9组实验中没有A2C2D2B1，
按A2C2D2B1条件补加实验，重复三次取平均值，得黄
皮疣柄牛肝菌多酚的得率为5.46%±0.04%，且高于正
交实验表中其他组合的多酚得率。
2.4 浸提次数对多酚类物质提取效果的影响
在黄皮疣柄牛肝菌多酚提取的最佳工艺条件
下，连续提取5次，分别测取单次浸提多酚类物质的
含量并累计相加，浸提次数对黄皮疣柄牛肝菌多酚
类物质提取效果的影响如图5所示。提取2次和提取3
次的提取物中多酚无显著性差异（p＞0.05），考虑到
节约能源和人力，选取最佳浸提次数为2次。
2.5 HPLC法测定多酚的成分
在1.2.5所述色谱条件下，将黄皮疣柄牛肝菌样
品进样，测定18种多酚类物质的含量，各成分的含量
以毫克等量每100克牛肝菌干重（mg/100 g）来表示，
测定结果见表3。
由表3可以看出，在该色谱条件下测定黄皮疣柄
牛肝菌样品，检测出8种酚类物质，且5-磺基水杨酸
在所检测的18种酚类物质中含量最高。在黄皮疣柄
牛肝菌中还检测出绿原酸、儿茶素、对香豆酸、鞣花
酸、苯甲酸、槲皮素和肉桂酸共8种多酚类物质。
在此色谱条件下，18种酚类物质得到了较好的分
离，说明该色谱条件适合测定黄皮疣柄牛肝菌中5-
磺基水杨酸、绿原酸、儿茶素、肉桂酸等多酚类物质。
黄皮疣柄牛肝菌中所含多酚类物质的含量存在差
异，其中5-磺基水杨酸含量最高为779.00 mg/100 g。
2.6 MTT法检测细胞存活率分析
黄皮疣柄牛肝菌对Caco-2结肠癌细胞的抑制作
用如图6所示（对照组细胞存活率设为100%）。
由图6可知，Caco-2结肠癌细胞经过不同浓度的
黄皮疣柄牛肝菌多酚提取物诱导培养48 h后，细胞存
活率均有一定程度的下降。与对照组相比，呈显著性差
异（p＜0.05）。且细胞存活率与多酚浓度呈良好的线性
关系，随浓度的增加而递减。当其多酚浓度为175 μg/mL
时，细胞存活率为44.93%，抑制率达55.07%。
实验表明，黄皮疣柄牛肝菌对Caco-2结肠癌细胞
序号 多酚种类
含量（mg/100 g）
黄皮疣柄牛肝菌
1 5-磺基水杨酸 779.00±8.49
2 没食子酸 -
3 原儿茶酸 -
4 绿原酸 6.41±0.083
5 儿茶素 31.04±0.964
6 4-羟基苯甲酸 -
7 香草酸 -
8 咖啡酸 -
9 丁香酸 -
10 对香豆酸 0.68±0.004
11 芦丁 -
12 鞣花酸 3.64±0.058
13 阿魏酸 -
14 3，4-二甲氧基苯甲酸 -
15 苯甲酸 1.34±0.027
16 白藜芦醇 -
17 槲皮素 1.81±0.009
18 肉桂酸 156.38±0.974
表3 黄皮疣柄牛肝菌样品多酚测定结果
Table 3 Determination results of Leccinellum crocipodium
samples
注：“-”代表未检出。
实验号 A B C D 多酚得率（%）
1 1 1 1 1 3.30±0.03
2 1 2 2 2 4.22±0.08
3 1 3 3 3 3.24±0.09
4 2 1 2 3 4.88±0.10
5 2 2 3 1 3.91±0.06
6 2 3 1 2 4.01±0.04
7 3 1 3 2 2.75±0.05
8 3 2 1 3 2.31±0.02
9 3 3 2 1 3.14±0.10
k1 3.59 3.64 3.21 3.45
k2 4.27 3.48 4.08 3.66
k3 2.74 3.46 3.30 3.48
R 1.53 0.18 0.87 0.21
表2 实验设计与结果
Table 2 Experimental design and result
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图6 黄皮疣柄牛肝菌乙醇提取物对细胞存活率的影响
Fig.6 Effect of polyphenolic extracts from Leccinellum
crocipodium on cell viability
提取物浓度（μg·mL-1）
25 50 75 100 125 150 175 200
100
80
60
40
细
胞
存
活
率
（
%）
产生一定程度的抑制作用。Caco-2结肠癌细胞数量
的减少可能是黄皮疣柄牛肝菌多酚对细胞凋亡的诱
导作用，也可能是对细胞增殖的抑制作用。细胞增殖、
凋亡调控的异常与肿瘤发生、发展有关[18]。此前有报
道指出，美味牛肝菌粗多糖对MCF-7细胞48 h抑制
率仅为19.12%[19]，低于黄皮疣柄牛肝菌多酚对结肠
癌细胞的抑制作用。Fridrich等[20]研究表明，苹果多酚
能够抑制结肠癌细胞增殖，而对正常细胞增殖作用
不明显。可可粉多酚提取物对Caco-2结肠癌细胞生
长抑制率高达70%，主要原理是使细胞周期阻滞于
G2/M期[21]。此外，Caco-2结肠癌细胞数量的减少可能
与牛肝菌多酚的抗氧化作用相关。Caco-2结肠癌细
胞细胞数量的减少还可能受黄皮疣柄牛肝菌提取物
中所含多酚类物质的种类和含量的影响。黄皮疣柄
牛肝菌对Caco-2结肠癌细胞抑制作用的机理有待探
究，对其他癌细胞的作用效果有待进一步的实验。
3 结论
在单因素实验的基础之上，通过正交实验优化提
取工艺，确定了最佳提取工艺条件为：温度为80 ℃，
乙醇浓度为50%，料液比为1∶25 g/mL，提取1 h，提取
次数为2次时，黄皮疣柄牛肝菌多酚的得率为5.46%±
0.04%。黄皮疣柄牛肝菌中多酚含量存在较大的差
异，在18种多酚类物质中，5-磺基水杨酸、儿茶素和
肉桂酸等8种多酚类物质均被检出，其中5-磺基水杨
酸含量最高，为779.00 mg/100 g；体外细胞实验结果表
明，黄皮疣柄牛肝菌中提取的多酚类物质对Caco-2
结肠癌细胞产生一定程度的抑制作用，可以开发为
癌症有效的治疗剂。研究表明黄皮疣柄牛肝菌中多
酚类化合物含量较高，具有一定的开发利用前景。
参考文献
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