全 文 ：第 36 卷第 7 期
2015 年 7 月
环 境 科 学
ENVIＲONMENTAL SCIENCE
Vol． 36，No． 7
Jul．，2015
耐高浓度沼液产油小球藻的分离鉴定与特征分析
杨闯1，2，王文国2，3* ，马丹炜1* ，汤晓玉2，3，胡启春2，3
(1．四川师范大学生命科学学院，成都 610101;2． 农业部沼气科学研究所，成都 610041;3． 农业部农村可再生能源开发
利用重点实验室，成都 610041)
摘要:本研究从长期在空气中放置的沼液中分离得到 1 株可以耐受高浓度沼液的藻株，经形态和分子生物学方法鉴定为小球
藻属的一种，命名为 Chlorella sp． BWY-1． 本研究所用的沼液来自于以固液分离后的猪场废水为发酵原料的沼气工程． 与普
通小球藻 Chlorella regularis (FACHB-729)的对比研究表明，Chlorella sp． BWY-1 在 BG11 和不同浓度的沼液中都有相对较强
的生长速率、生物量积累能力和氮磷等污染物去除能力． Chlorella sp． BWY-1 在 BG11 中有最高的生长速率和生物量生产力
(324. 40 mg·L －1 ，以 dw计)，但是其含油量和油脂生产力随着沼液浓度的增加而增加． 在未稀释的沼液中 Chlorella sp．
BWY-1 的含油量可达 44. 43%，油脂生产力达 108. 70 mg·L －1 ． 分析结果表明该藻株在养殖废水处理和生物能源方面具有一
定的应用潜力，可以结合固液分离、厌氧发酵等其他技术用于养殖场废水的处理和生物柴油的制取．
关键词:养殖废水;沼液;小球藻;废水处理;生物柴油
中图分类号:X713 文献标识码:A 文章编号:0250-3301(2015)07-2707-06 DOI:10． 13227 / j． hjkx． 2015． 07． 050
收稿日期:2014-12-21;修订日期:2015-01-27
基金项目:国家自然科学基金项目(51108239) ;四川省应用基础研
究计划项目(2013JY0005)
作者简介:杨闯(1989 ～) ，男，硕士研究生，主要研究方向为细胞工
程，E-mail:hyyangchuang@ 126． com
* 通讯联系人，E-mail:wangwenguo@ caas． cn;danwei10ma
@ 163． com
Isolation， Identification and Characteristic Analysis of an Oil-producing
Chlorella sp． Tolerant to High-strength Anaerobic Digestion Effluent
YANG Chuang1，2，WANG Wen-guo2，3* ，MA Dan-wei1* ，TANG Xiao-yu2，3，HU Qi-chun2，3
(1． College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China;2． Biogas Institute，Ministry of Agriculture，
Chengdu 610041，China;3． Key Laboratory of Development and Application of Ｒural Ｒenewable Energy，Ministry of Agriculture，
Chengdu 610041，China)
Abstract:A Chlorella strain tolerant to high-strength anaerobic digestion effluent was isolated from the anaerobic digestion effluent with
a long-term exposure to air． The strain was identified as a Chlorella by morphological and molecular biological methods，and named
Chlorella sp． BWY-1． The anaerobic digestion effluent used in this study was from a biogas plant with the raw materials of swine
wastewater after solid-liquid separation． The Chlorella regularis (FACHB-729)was used as the control strain． The comparative study
showed that Chlorella sp． BWY-1had relatively higher growth rate，biomass accumulation capacity and pollutants removal rate in BG11
and different concentrations of anaerobic digestion effluent． Chlorella sp． BWY-1 had the highest growth rate and biomass productivity
(324. 40 mg·L －1)in BG11，but its lipid productivity and lipid content increased with the increase of anaerobic digestion effluent
concentration． In undiluted anaerobic digestion effluent，the lipid productivity and lipid content of Chlorella sp． BWY-1 were up to
44. 43% and 108. 70 mg·L －1，respectively． Those results showed that the isolated algal strain had some potential applications in
livestock wastewater treatment and bioenergy production，it could be combined with a solid-liquid separation，anaerobic fermentation
and other techniques for processing livestock wastewater and producing biodiesel．
Key words:livestock wastewater;anaerobic digestion effluent;Chlorella;wastewater treatment;biodiesel
畜禽养殖业已经成为我国最大污染行业之
一［1，2］． 沼气工程是一些大中型养殖场进行废水、
粪污处置、资源化再利用的主要手段［3］． 但是厌氧消
化过程主要削减有机物，大量氮磷等物质仍存在于沼
渣、沼液中，对生态环境仍具有一定的威胁［4，5］． 另
一方面，沼渣、沼液中含有大量的氮、磷、钾等植物
生长所必须的物质，可以作为肥料进行进一步利用，
尤其是沼液中含有大量的可溶性氮磷，极易被植物吸
收，是良好的肥料［6］． 但是由于沼液产生的连续性与
作物施肥的间断性之间的矛盾，一些养殖场周围的土
地无法消纳持续产生的大量沼液［3，4］． 其他如沼液的
自然处理、工程化达标处理等技术都仍存在一定的
问题，难以取得经济可行的效果，沼液的处理仍是限
制沼气技术发展的瓶颈之一［3］．
沼液中的氮磷等营养盐类也是微藻生长所必需
的［7］． 利用沼液培养能源微藻被认为是一种高附加
值的沼液处理方式［8］． 但是沼液中高浓度的氨氮和
较低的透明度等因素不利于微藻的生长［9］． 通常需
要对沼液进行离心、稀释后才能用于微藻的培养，这
环 境 科 学 36 卷
会消耗大量的水资源并使微藻培养成本增加［8，10］．
获得可以耐受高浓度沼液的微藻藻株是解决这一问
题的方法之一． Tale 等［11］从以餐厨垃圾为发酵原料
的沼液中分离到 5 株耐受性较好的藻株用于餐厨垃
圾的沼液处理． 但是目前用于以养殖废水为原料的
沼液处理的藻株主要是从藻种库购买［8，10，12］或从其
他地表水体中分离获得［13，14］． 这些藻株一般对高浓
度沼液较为敏感，需要将沼液稀释到较低的浓度． 本
研究直接从长期放置的沼液中分离到 1 株具有较高
浓度沼液耐受性的小球藻，并对其污染物去除能力、
产油能力进行了分析，以期为进一步在养殖废水处理
和生物柴油中的应用奠定基础．
1 材料与方法
1. 1 藻株的分离、纯化
用于藻株分离的水样是从装有沼液的长期放置
在窗台中的广口瓶中获得的． 在无菌操作台中将 100
μL水样被涂抹在灭过菌(121℃，20 min)的含有 1%
琼脂粉和未稀释的沼液的平板上． 将平板置于 25℃、
60 μmol·(m2·s)－1光照强度的培养箱中培养(上海一
恒 MGC-300A，光源为 10 根 36W的白炽灯管) ，光暗
周期为16 h亮 /8 h暗． 5 d后挑取单个的绿色斑点接
种到在含有 100 mL 灭过菌的 BG11 培养液中［15］，置
于培养箱中扩大培养，每天摇动 3次．
实验所用的沼液均采自四川简阳一个以固液分
离后猪场废水为发酵原料的沼气工程，发酵工艺为
连续搅拌完全混合式厌氧消化反应器(continuously
stirred tank reactor，CSTＲ)． 采回的沼液经离心
(4 500r·min －1，15 min)后储存在 4℃的冰柜中备
用． 经过离心后的沼液 pH 为 7. 86，化学需氧量(
COD)为1 021 mg·L －1，总氮为 286 mg·L －1，氨氮为
273 mg·L －1，总磷为 8. 9 mg·L －1 ．
1. 2 藻种的鉴定
分离得到的藻株在三角瓶中扩大培养 10 d 后
取部分样品在光学显微镜下进行形态鉴定，然后将
培养液 4℃，13 000r·min －1离心 3 min，用植物基因
组 DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP337-N96)对所得
藻体 进 行 基 因 组 DNA 提 取． 以 ITS-F: 5-
TTTCCGTA GGTGAACCTGCGGAAG-3，ITS-Ｒ:5-
TTAAGTTC AGCGGGTAGTCTTGCC-3为引物，基因
组 DNA为模版进行 PCＲ扩增，以获得 ITS1(Internal
Transcribed spacer I)序列． 扩增产物经电泳检测后
回收，构建到 pEASY-T1 (TransGene)克隆载体上，
取阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司
测序． 利用 MEGA5. 1 软件的 NJ(Neighbor-Jointin)
法对获得的序列和 GenBank 中其他藻种的 ITS1 序
列构建系统发育树，重复 100 次计算 Bootstrap值．
1. 3 室外培养
以从中国科学院淡水藻种库购买的普通小球藻
(Chlorella regularis FACHB-729)为对照，将在 BG11
培养的分离到藻株和 FACHB-729 作为种子液接种
到装有 2 L不同沼液的密封的玻璃瓶中，起始细胞
浓度是 680 nm波长的吸光度值(D)为 0. 1，并设置
不接种任何藻种的对照组(CK)． 沼液组设置 25%、
50%和 100% 这 3 个浓度梯度． 以空气中的 CO2 为
碳源，空气的流速为 0. 5 L·min －1 ． 实验于 2014 年 9
月在位于成都市的农业部沼气科学研究所楼顶进
行，每天利用分光光度计测定 680 nm处的 D值． 根
据 D值的变化情况选择收获的最佳时间，通过离心
(4 500 r·min －1，10 min)的方式收集藻体，用 1%的
氯化钠溶液洗 3 次后在 60℃的烘箱中烘至恒重．
1. 4 水质分析方法
水质的分析方法均参照文献［16］． 氨氮采用纳
氏试剂分光光度法，总氮采用碱性过硫酸钾消解紫
外分光光度法，总磷的测定用钼酸铵分光光度法，
COD用重铬酸钾法测定，pH值用 pH计测定．
1. 5 油脂提取与分析方法
从干藻粉中提取总油脂采用 Bligh 等的方
法［17］，并做适当修改过． 具体方法如下，取 0. 1 g 藻
粉加入 2 mL 的氯仿和 1 mL 的甲醇，充分混合 10
min后依次加入 1 mL甲醇混合 1 min，1. 8 mL水混
合 5 min 离心(4 500r·min －1)． 吸取氯仿层，用 5%
的氯化钠溶液洗 2 次，然后 60℃烘干至恒重，称取
离心管前后的重量，即油脂重量．
1. 6 统计方法
本研究每个处理设置 3 个重复，采用 Excel
2007、Origin 8. 0 软件进行数据方差分析和作图．
2 结果与分析
2. 1 藻株的分离与鉴定
用于藻株分离的平板在光照培养箱中培养 5 d
后绿色的藻斑的直径达到 0. 5 ～ 1 mm，其中一个藻
斑在 BG11 中扩大培养后经显微镜观察为直径约为
3 ～ 5 μm 的圆形的单细胞藻，与小球藻属的形态相
似［18］(图 1)． 将其命名为 Chlorella sp． BWY-1． 以
ITS1 序列构建的进化树分析表明 BWY-1 与
Chlorella variabilis、Chlorella chlorelloides聚类为一簇
(图 1)．
8072
7 期 杨闯等:耐高浓度沼液产油小球藻的分离鉴定与特征分析
图 1 从沼液中分离的藻株 Chlorella sp． BWY-1 的形态特征和系统发育树
Fig． 1 Morphological characteristics and the phylogenetic tree of Chlorella sp． BWY-1 isolated from the anaerobic digestion effluent
2. 2 生长特征分析
图 2 两个藻株在 BG11 和不同浓度沼液中的生长曲线
Fig． 2 Growth curves of the two algal strains in BG11 and different concentrations of anaerobic digestion effluent
图 2 为 BWY-1 与 FACHB-729 在 BG11 和不同
浓度沼液中的生长曲线． 在经过 1 d 的延滞期后两
株藻在 BG11 和低浓度的沼液中(25%和 50%)进
入对数生长期，在 7 d后进入稳定期，FACHB-729 的
生长速率均低于 BWY-1． 而在高浓度的沼液中
(100%)，尽管 BWY-1 仍在第 7 d进入稳定期，但是
其延滞期要达到 2 d． FACHB-729 在 100%的沼液
中几乎无法生长(图 3)． 因此，本研究后续实验的
收获期为第 7 d． 两个藻株在 BG11 中的生长速率均
高于在沼液中的生长速率．
2. 3 污染物去除能力分析
图 4 为 BWY-1 与 FACHB-729 在 7 d的培养时
间内对不同浓度沼液中 COD、总氮、氨氮和总磷的
去除情况． 两个藻种对 COD的去除效果差异较小，
但是 BWY-1 对氮磷的去除效果明显好于 FACHB-
729，而且在低沼液浓度下的去除效果明显高于高浓
度． BWY-1 在 25%的沼液中对总磷的去除效果最
好，可达 85. 25% ． 在未稀释的沼液中两个藻株对氮
磷的去除效果较差，效果相对较好的 BWY-1 对总
氮、氨氮和总磷的去除率分别为 30. 3%、23. 7%和
52. 8% ．
9072
环 境 科 学 36 卷
图 3 两个藻株在不同浓度沼液中的生长状况
Fig． 3 Growth of the two algal strains in different concentrations of anaerobic digestion effluent
2. 4 生物质积累和油脂含量分析
表 1 为培养 7 d 后 BWY-1 与 FACHB-729 在
BG11 和不同浓度的沼液中的生物量和油脂积累情
况． 在生物量积累方面，两个藻种均是在 BG11 中最
高，BWY-1 可达 324. 40 mg·L －1，高于 FACHB-729
的 253. 51 mg·L －1;在沼液中的生物量积累随着沼液
浓度的增加而降低． 在油脂积累方面，由于随着沼液
浓度的增加两个藻株的含油量呈增加趋势，在 100%
的沼液中 BWY-1 的含油量可高达 44. 43%，BWY-1
的油脂积累能力表现出随着沼液浓度递增的趋势;
但是由于 FACHB-729 在沼液中的生长情况较差，油
脂积累能力仍随着沼液浓度的递增而减少．
表 1 两个藻株的生物质生产力、油脂含量和油脂生产力
Table 1 Biomass productivities，lipid contents and lipid productivities of the two algal strains
藻株 培养液
生物量积累(以 dwt计)
/mg·L －1
油脂积累
/mg·L －1
油脂含量
/%
BG11 253. 51 ± 8． 65 43. 55 ± 2． 00 17. 21 ± 1． 36
Chlorella regularis (FACHB-729) 25%沼液 129. 87 ± 5． 51 34. 47 ± 1． 40 26. 55 ± 0． 19
50%沼液 60. 10 ± 4． 83 16. 61 ± 1． 17 27. 85 ± 1． 14
100%沼液 0. 00 ± 0． 00 0. 00 ± 0． 00 0. 00 ± 0． 00
BG11 324. 40 ± 11． 50 65. 64 ± 0． 88 20. 24 ± 0． 45
Chlorella sp． BYW-1 25%沼液 274. 19 ± 9． 48 88. 48 ± 1． 04 32. 29 ± 0． 74
50%沼液 269. 62 ± 5． 89 95. 18 ± 1． 14 35. 32 ± 1． 20
100%沼液 244. 85 ± 6． 54 108. 70 ± 1． 37 44. 43 ± 1． 74
0172
7 期 杨闯等:耐高浓度沼液产油小球藻的分离鉴定与特征分析
图 4 两个藻株对不同沼液浓度的氨氮、总氮、总磷和 COD的去除率
Fig． 4 Ｒemoval rate of ammonium nitrogen，total nitrogen，total phosphorus，and chemical oxygen demand
from different concentrations of anaerobic digestion effluent by the two algal strains
3 讨论
利用分子生物学的方法对分离的藻株进行离鉴
定已经是较为成熟的方法，通常方法是对 18S、ITS
等特征序列进行测序后构建进化树进行分析［19］．
线粒体 DNA的 ITS1 序列是真核生物进行同属的物
种鉴定的常用序列［20］，也已经成功的用于小球藻属
的鉴定［21，22］． 本研究利用 ITS1 序列的分析，将分离
得到的藻株归为小球藻属．
微藻处理沼液具有一定的优势，但是仍受一些
条件的限制，沼液中过高氨氮含量就是其中因素之
一［23］． 以猪场废水为原料的沼液中的氨氮含量在
100 ～ 2 000 mg·L －1之间［5］，不利于微藻生长． 固液
分离技术作为一种常见的畜禽养殖场粪污的前处理
技术可以有效的将一部分氮磷等物质分离到固体
中［24］，使进入厌氧发酵罐的氮磷含量降低，从而使
产生的沼液中的氨氮的物质的含量降低，有利于微
藻的培养． 本研究所用的沼液即为以固液分离后的
养殖废水为原料的沼液，氨氮浓度虽然已经低于
300 mg·L －1，但是仍不利于一些普通微藻藻株的生
长，FACHB-729 在未稀释的沼液中无法生长． 而从
沼液中分离的藻株 BWY-1 则在未稀释的沼液中表
现出良好的生长状态，说明 BWY-1 对高浓度的沼液
具有一定的耐受性，可以结合固液分离、厌氧发酵
工艺用于养殖废水的处理． 另一方面，与在 BG11 培
养基中相比，两个藻株在各个沼液浓度中的生长速
率和生物量积累要低，说明沼液虽然可以满足微藻
的生长要求，耐受型的藻株 BWY-1 可以在高浓度的
沼液中较好的生长，但是由于沼液中成分复杂，无法
使微藻的生长状态达到最佳．
小球藻 BWY-1 不仅在高浓度的沼液中表现出
较好的生长能力，而且在高浓度的沼液中表现出较
高的含油量． 这可能与高浓度沼液对其产生的胁迫
有关． 研究表明由一些非生物胁迫诱导的氧化胁迫
可以使微藻含油量增加［25］． 废水中高浓度的氨氮
也可以使浮萍等水生植物产生氧化胁迫［26］． BWY-
1 和 FACHB-729 在高沼液浓度条件下表现出的高
油脂含量增加可能与氧化胁迫相关．
在低浓度的沼液中，小球藻可以对氮、磷等物
质进行良好的削减，但是在高浓度的沼液中 BWY-1
虽然仍有一定的污水净化能力，但是由于沼液中的
污染物浓度较高，BWY-1 对沼液中氮磷的去除效果
有限，可以采取多轮培养或者与其他处理手段结合
的方式进行沼液处理．
1172
环 境 科 学 36 卷
4 结论
本研究从长期放置的沼液中筛选的小球藻
Chlorella sp． BWY-1 在高浓度的沼液中可以良好地
生长，并表现出较高的油脂含量和一定的污染物去
除能力． 该藻株在养殖废水处理和生物能源方面具
有一定的应用潜力，可以结合固液分离、厌氧发酵
等其他技术用于养殖场废水的处理，收集的藻体可
以用于生产生物柴汽油的原料．
参考文献:
［1］ 仇焕广，廖绍攀，井月，等． 我国畜禽粪便污染的区域差异
与发展趋势分析［J］． 环境科学，2013，34(7) :2766-2774．
［2］ 耿维，胡林，崔建宇，等． 中国区域畜禽粪便能源潜力及总
量控制研究［J］． 农业工程学报，2013，29(1) :171-179．
［3］ 刘刈，宋立，邓良伟． 我国规模化养殖场粪便污水处理利用
现状及对策［J］． 猪业科学，2011，28(6) :30-33，42．
［4］ 闫园园，李子富，程世昆，等． 养殖场厌氧发酵沼液处理研
究进展［J］． 中国沼气，2013，31(5) :48-52．
［5］ 卫丹，万梅，刘锐，等． 嘉兴市规模化养猪场沼液水质调查
研究［J］． 环境科学，2014，35(7) :2650-2657．
［6］ 骆林平，张妙仙，单胜道． 沼液肥料及其利用研究现状［J］．
浙江农业科学，2009，(5):977-978．
［7］ Wang L，Li Y C，Chen P，et al． Anaerobic digested dairy
manure as a nutrient supplement for cultivation of oil-rich green
microalgae Chlorella sp．［J］． Bioresource Technology，2010，
101(8) :2623-2628．
［8］ Park J，Jin H F，Lim B Ｒ，et al． Ammonia removal from
anaerobic digestion effluent of livestock waste using green alga
Scenedesmus sp．［J］． Bioresource Technology，2010，101(22)
8649-8657．
［9］ Uggetti E，Sialve B，Latrille E，et al． Anaerobic digestate as
substrate for microalgae culture: the role of ammonium
concentration on the microalgae productivity［J］． Bioresource
Technology，2014，152，437-443．
［10］ Kobayashi N，Noel E A，Barnes A，et al． Characterization of
three Chlorella sorokiniana strains in anaerobic digested effluent
from cattle manure［J］． Bioresource Technology，2013，150:
377-386．
［11］ Tale M， Ghosh S， Kapadnis B， et al． Isolation and
characterization of microalgae for biodiesel production from
Nisargruna biogas plant effluent［J］． Bioresource Technology，
2014，169:328-335．
［12］ Wang L，Wang Y K，Chen P，et al． Semi-continuous cultivation
of Chlorella vulgaris for treating undigested and digested dairy
manures［J］． Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，
162(8) :2324-2332．
［13］ Ji F，Liu Y，Hao Ｒ，et al． Biomass production and nutrients
removal by a new microalgae strain Desmodesmus sp． in anaerobic
digestion wastewater［J］． Bioresource Technology，2014，161:
200-207．
［14］ 赵凤敏，梅帅，曹有福，等． 基于沼液的培养基及产油小球
藻藻种选育［J］． 环境科学，2014，35(6):2300-2304．
［15］ Boussiba S，Vonshak A． Astaxanthin accumulation in the green
alga Haematococcus pluvialis［J］． Plant and cell Physiology，
1991，32(7) :1077-1082．
［16］ 国家环境保护总局． 水和废水监测分析方法［M］． (第四
版)． 北京:中国环境科学出版社，2002． 157-386．
［17］ Bligh E G，Dyer W J． A rapid method of total lipid extraction
and purification［J］． Canadian Journal of Biochemistry and
Physiology，1959，37(8):911-917．
［18］ 朱浩然，朱婉嘉，李尧英． 中国淡水藻类志［M］． (第二
卷)． 北京:中国科学出版社，1991． 121-365．
［19］ 甄毓，于志刚，米铁柱． 分子生物学在微藻分类研究中的应
用［J］． 中国海洋大学学报，2006，36(6):875-878．
［20］ Coleman A W，Mai J C． Ｒibosomal DNA ITS-1 and ITS-2
sequence comparisons as a tool for predicting genetic relatedness
［J］． Journal of Molecular Evolution，1997，45(2) :168-177．
［21］ Cozzolino S，Campo I，Moretti M A，et al． The use of nuclear
ribosomal ITS 1 DNA sequences for the identification of Chlorella
strains［J］． Archiv füer Hydrobiologie，1999，130:31-42．
［22］ Wu H L，Hseu Ｒ S，Lin L P． Identification of Chlorella spp．
isolates using ribosomal DNA sequences［J］． Botanical Bulletin
of Academia Sinica，2001，42:115-121．
［23］ 国青青，刘锐，罗金飞，等． 沼液养殖钝顶螺旋藻的中试研
究［J］． 环境科学，2014，35(9) :3480-3486．
［24］ 常志州，黄红英，吴军伟，等． 猪和奶牛粪便的粒径及养分
分布对固液分离效率的影响［J］． 农业环境科学学报，2010，
29(2) :392-395．
［25］ Osundeko O，Davies H，Pittman J K． Oxidative stress-tolerant
microalgae strains are highly efficient for biofuel feedstock
production on wastewater［J］． Biomass and Bioenergy，2013，
56:284-294．
［26］ Huang L，Lu Y Y，Gao X，et al． Ammonium-induced oxidative
stress on plant growth and antioxidative response of duckweed
(Lemna minor L．) ［J］． Ecological Engineering，2013，58:
355-362．
2172